CN103743869B - 一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法，涉及物质的确定方法。所述方法包括下列步骤：（1）未经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖的纯化：A、粉碎、筛选；B、蛋白纯化；C、粗多糖纯化；（2）经过挤压膨化的红小豆蛋白和多糖液纯化：A、粉碎、筛选；B、加水搅拌；C、挤压膨化；D、粉碎、筛选；E、蛋白纯化；F、粗多糖纯化；（3）利用体外测定糖苷酶一致的方法比较经过挤压膨胀前后的蛋白和多糖对α糖苷酶的抑制活性。通过比较挤压膨化前后的物质成分变化，很容易发现经过挤压膨胀的蛋白和多糖含量显著增高。利用体外测定糖苷酶一致的方法，能够轻松测定经过挤压膨化的红小豆粉与未经过挤压膨化红小豆粉的糖苷酶抑制率。
Description
技术领域
本发明涉及物质的确定方法，具体而言，本发明涉及一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法。
背景技术
在过去，红豆由于其高纤维及蛋白含量，被推荐为降糖食物。植物化学家对红豆中化学成分进行分析，发现其富含酚类化合物，儿茶素、绿原酸等。红豆具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠血糖有改善作用。红豆汁可降低甘油三酯并抑制胰脂肪酶活性，有利于防治高甘油三酯血症。在保健功能食品领域，对小豆的深入研究开发相对较少，尤其对小豆粉起降糖作用的中关键生物活性物质缺乏研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法。药理实验结果表明，通过挤压膨化制备的小豆粉多糖和蛋白含量更高，降血糖功效更好。
本发明为解决上述技术问题采用的技术方案是：一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法，包括下列步骤：
（1）未经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖的纯化：
A、粉碎、筛选：取质量合格的红小豆，粉碎、过筛，测定获得的物质的成分；
B、蛋白纯化：采用常规酸碱沉降法进行蛋白纯化；
C、粗多糖常规纯化：
a、粗多糖液制备；
b、粗多糖纯化；
（2）经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖液纯化：
A、粉碎、筛选：取质量合格的红小豆，粉碎、过筛；
B、加水搅拌：在红小豆粉中添加8-10%的水，用搅拌机搅拌均匀；
C、挤压膨化：取搅拌后的红小豆粉，放入挤压机中进行挤压膨化；
D、粉碎、筛选：将挤压膨化后的红小豆粉粉碎、过筛，测定获得的物质的成分，比较挤压膨化前后的物质成分变化；
E、蛋白纯化：采用常规酸碱沉降法进行蛋白纯化；
F、粗多糖常规纯化：
a、粗多糖液制备；
b、粗多糖纯化；
（3）利用体外测定糖苷酶一致的方法比较经过挤压膨胀前后的蛋白和多糖对α糖苷酶的抑制活性。
所述过筛为过55-65目筛。
所述进行蛋白纯化的酸碱沉降法的具体做法为：称取原料粉末用蒸馏水按照1：8比例浸泡过夜，3500r离心5-15min，收集上清用1M氢氧化钠调pH到8.0-10.0，磁力搅拌25-35min，5000r离心15-25min，收集上清液。用1N盐酸调pH到6.0-8.0，5000r离心15-25min，弃去上清液，沉淀用去离子水润洗2-3遍，冻干备用。
所述粗多糖液制备的具体做法为：称取原料粉，浸泡20-40min，加15-25倍量水超声溶解豆粉，溶液加无水乙醇使含醇量达70-90%，3-5℃冷藏过夜，3500r离心15-25min，沉淀加5-15mL水溶解，得到粗多糖液。
所述粗多糖纯化的具体做法为：粗多糖液加10%三氯乙酸水溶液0.5-1.5mL，3-5℃冷藏过夜，3500r离心15-25min，取上清液，再加无水乙醇使含醇量达到70-90%，3-5℃冷藏过夜，4500r离心5-10min，弃去上清液，沉淀加5-15mL水溶解再加0.5%活性炭，沸水煮25-35min，过滤，加蒸馏水定容于25mL容量瓶。
所述挤压膨化过程中挤压机Ⅰ区温度范围为140-180℃、Ⅱ区温度范围为120-160℃。
本发明的有益效果是：
1、通过比较挤压膨化前后的物质成分变化，很容易发现经过挤压膨胀的蛋白和多糖含量显著增高。经过挤压膨胀的小豆的蛋白和多糖具有明显较高的α糖苷酶一致活性。
2、利用体外测定糖苷酶一致的方法，能够轻松测定经过挤压膨化的红小豆粉与未经过挤压膨化红小豆粉的糖苷酶抑制率，结果显示可提高糖苷酶抑制率4倍以上。
附图说明
图1为为挤压膨胀红小豆粉对正常鼠降血糖活性实验结果图
图2为挤压膨胀红小豆粉对糖尿病鼠降血糖活性实验结果图
图3为挤压膨胀红小豆蛋白对糖尿病鼠降血糖活性实验结果图
图4为挤压膨胀红小豆蛋白对糖尿病鼠口服葡萄糖耐量影响结果图
具体实施方式
实施例1：
一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法，包括下列步骤：
（1）未经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖的纯化：
A、粉碎、筛选：取质量合格的红小豆，粉碎、过55目筛，测定获得的物质的成分；
B、蛋白纯化：采用酸碱沉降法进行蛋白纯化：称取原料粉末用蒸馏水按照1：8比例浸泡过夜，3500r离心5min，收集上清用1M氢氧化钠调pH到8.0，磁力搅拌25min，5000r离心15min，收集上清液。用1N盐酸调pH到6.0，5000r离心15min，弃去上清液，沉淀用去离子水润洗2遍，冻干备用；
C、粗多糖纯化：
a、粗多糖液制备：称取原料粉，浸泡20min，加15倍量水超声溶解豆粉，溶液加无水乙醇使含醇量达70%，3℃冷藏过夜，3500r离心15min，沉淀加5-15mL水溶解，得到粗多糖液；
b、粗多糖纯化：粗多糖液加10%三氯乙酸水溶液0.5mL，3℃冷藏过夜，3500r离心15min，取上清液，再加无水乙醇使含醇量达到70%，3℃冷藏过夜，4500r离心5min，弃去上清液，沉淀加5mL水溶解再加0.5%活性炭，沸水煮25min，过滤，加蒸馏水定容于25mL容量瓶；
（2）经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖液纯化：
A、粉碎、筛选：取质量合格的红小豆，粉碎、过55目筛；
B、加水搅拌：在红小豆粉中添加8%的水，用搅拌机搅拌均匀；
C、挤压膨化：取搅拌后的红小豆粉，放入挤压机中进行挤压膨化；Ⅰ区温度为140℃、Ⅱ区温度为120℃；
D、粉碎、筛选：将挤压膨化后的红小豆粉粉碎、过55目筛，测定获得的物质的成分，比较挤压膨化前后的物质成分变化；
E、蛋白纯化：采用酸碱沉降法进行蛋白纯化：称取一定量原料粉末用蒸馏水按照1：8比例浸泡过夜，3500r离心5min，收集上清用1M氢氧化钠调pH到8.0，磁力搅拌25min，5000r离心15min，收集上清液。用1N盐酸调pH到6.0，5000r离心15min，弃去上清液，沉淀用去离子水润洗2遍，冻干备用；
F、粗多糖纯化：
a、粗多糖液制备：称取原料粉，浸泡20min，加15倍量水超声溶解豆粉，溶液加无水乙醇使含醇量达70%，3℃冷藏过夜，3500r离心15min，沉淀加5mL水溶解，得到粗多糖液；
b、粗多糖纯化；粗多糖液加10%三氯乙酸水溶液0.5mL，3℃冷藏过夜，3500r离心15min，取上清液，再加无水乙醇使含醇量达到70%，3℃冷藏过夜，4500r离心5min，弃去上清液，沉淀加5mL水溶解再加0.5%活性炭，沸水煮25min，过滤，加蒸馏水定容于25mL容量瓶；
（3）利用体外测定糖苷酶一致的方法比较经过挤压膨胀前后的蛋白和多糖对α糖苷酶的抑制活性。
实施例2：
一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法，包括下列步骤：
（1）未经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖的纯化：
A、粉碎、筛选：取质量合格的红小豆，粉碎、过60目筛，测定获得的物质的成分；
B、蛋白纯化：采用酸碱沉降法进行蛋白纯化：称取原料粉末用蒸馏水按照1：8比例浸泡过夜，3500r离心10min，收集上清用1M氢氧化钠调pH到9，磁力搅拌30min，5000r离心20min，收集上清液。用1N盐酸调pH到7.0，5000r离心20min，弃去上清液，沉淀用去离子水润洗2遍，冻干备用；
C、粗多糖纯化：
a、粗多糖液制备：称取原料粉，浸泡30min，加20倍量水超声溶解豆粉，溶液加无水乙醇使含醇量达80%，4℃冷藏过夜，3500r离心20min，沉淀加10mL水溶解，得到粗多糖液；
b、粗多糖纯化：粗多糖液加10%三氯乙酸水溶液1.0mL，4℃冷藏过夜，3500r离心20min，取上清液，再加无水乙醇使含醇量达到80%，4℃冷藏过夜，4500r离心10min，弃去上清液，沉淀加10mL水溶解再加0.5%活性炭，沸水煮30min，过滤，加蒸馏水定容于25mL容量瓶；
（2）经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖液纯化：
A、粉碎、筛选：取质量合格的红小豆，粉碎、过60目筛；
B、加水搅拌：在红小豆粉中添加9%的水，用搅拌机搅拌均匀；
C、挤压膨化：取搅拌后的红小豆粉，放入挤压机中进行挤压膨化；Ⅰ区温度为160℃、Ⅱ区温度为140℃；
D、粉碎、筛选：将挤压膨化后的红小豆粉粉碎、过60目筛，测定获得的物质的成分，比较挤压膨化前后的物质成分变化；
E、蛋白纯化：采用酸碱沉降法进行蛋白纯化：称取一定量原料粉末用蒸馏水按照1：8比例浸泡过夜，3500r离心10min，收集上清用1M氢氧化钠调pH到9.0，磁力搅拌30min，5000r离心20min，收集上清液。用1N盐酸调pH到7.0，5000r离心20min，弃去上清液，沉淀用去离子水润洗3遍，冻干备用；
F、粗多糖纯化：
a、粗多糖液制备：称取原料粉，浸泡30min，加20倍量水超声溶解豆粉，溶液加无水乙醇使含醇量达80%，4℃冷藏过夜，3500r离心20min，沉淀加10mL水溶解，得到粗多糖液；
b、粗多糖纯化；粗多糖液加10%三氯乙酸水溶液1.0mL，4℃冷藏过夜，3500r离心20min，取上清液，再加无水乙醇使含醇量达到80%，4℃冷藏过夜，4500r离心10min，弃去上清液，沉淀加10mL水溶解再加0.5%活性炭，沸水煮30min，过滤，加蒸馏水定容于25mL容量瓶；
（3）利用体外测定糖苷酶一致的方法比较经过挤压膨胀前后的蛋白和多糖对α糖苷酶的抑制活性。
实施例3：
一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法，包括下列步骤：
（1）未经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖的纯化：
A、粉碎、筛选：取质量合格的红小豆，粉碎、过65目筛，测定获得的物质的成分；
B、蛋白纯化：采用酸碱沉降法进行蛋白纯化：称取原料粉末用蒸馏水按照1：8比例浸泡过夜，3500r离心15min，收集上清用1M氢氧化钠调pH到10.0，磁力搅拌35min，5000r离心25min，收集上清液。用1N盐酸调pH到8.0，5000r离心25min，弃去上清液，沉淀用去离子水润洗3遍，冻干备用；
C、粗多糖纯化：
a、粗多糖液制备：称取原料粉，浸泡40min，加25倍量水超声溶解豆粉，溶液加无水乙醇使含醇量达90%，5℃冷藏过夜，3500r离心25min，沉淀加15mL水溶解，得到粗多糖液；
b、粗多糖纯化：粗多糖液加10%三氯乙酸水溶液1.5mL，5℃冷藏过夜，3500r离心25min，取上清液，再加无水乙醇使含醇量达到90%，5℃冷藏过夜，4500r离心10min，弃去上清液，沉淀加15mL水溶解再加0.5%活性炭，沸水煮35min，过滤，加蒸馏水定容于25mL容量瓶；
（2）经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖液纯化：
A、粉碎、筛选：取质量合格的红小豆，粉碎、过65目筛；
B、加水搅拌：在红小豆粉中添加10%的水，用搅拌机搅拌均匀；
C、挤压膨化：取搅拌后的红小豆粉，放入挤压机中进行挤压膨化；Ⅰ区温度为180℃、Ⅱ区温度为160℃；
D、粉碎、筛选：将挤压膨化后的红小豆粉粉碎、过65目筛，测定获得的物质的成分，比较挤压膨化前后的物质成分变化；
E、蛋白纯化：采用酸碱沉降法进行蛋白纯化：称取一定量原料粉末用蒸馏水按照1：8比例浸泡过夜，3500r离心15min，收集上清用1M氢氧化钠调pH到10.0，磁力搅拌35min，5000r离心25min，收集上清液。用1N盐酸调pH到8.0，5000r离心25min，弃去上清液，沉淀用去离子水润洗3遍，冻干备用；
F、粗多糖纯化：
a、粗多糖液制备：称取原料粉，浸泡40min，加25倍量水超声溶解豆粉，溶液加无水乙醇使含醇量达90%，5℃冷藏过夜，3500r离心25min，沉淀加15mL水溶解，得到粗多糖液；
b、粗多糖纯化；粗多糖液加10%三氯乙酸水溶液1.5mL，5℃冷藏过夜，3500r离心25min，取上清液，再加无水乙醇使含醇量达到90%，5℃冷藏过夜，4500r离心10min，弃去上清液，沉淀加15mL水溶解再加0.5%活性炭，沸水煮35min，过滤，加蒸馏水定容于25mL容量瓶；
（3）利用体外测定糖苷酶一致的方法比较经过挤压膨胀前后的蛋白和多糖对α糖苷酶的抑制活性。
下面通过实验方法来具体说明本发明的有益效果：
实验1：糖苷酶测定体外实验，利用化学测定方法，选用葡萄糖测定试剂盒， 测定不同品种的红小豆粉的糖苷酶抑制率，其中以降血糖拜糖平为阳性对照，实验结果平行测定2次。
结果如下：不同品种红小豆糖苷酶抑制率：
| 编号 | 品种名称 | 抑制率% |
| 1 | 临县红小豆 | 43.63 |
| 2 | 红丰8号 | 42.52 |
| 3 | 广陵 | 41.79 |
| 4 | 冀红352 | 46.67 |
| 5 | 中红2 | 45.27 |
| 6 | 中红6 | 41.66 |
| 7 | 中红5 | 37.66 |
| 8 | 中红8 | 42.09 |
| 9 | 中红9 | 40.86 |
本实验结果证明：浓度为100mg/ml的冀红352糖苷酶抑制活性最高，可选为降血糖品种。
实验2：挤压膨化的工艺优化
| 编号 | 温度变化 | 糖苷酶抑制率% |
| 1 | 150-160 | 60.94 |
| 2 | 150-165 | 64.76 |
| 3 | 150-170 | 60.47 |
| 4 | 155-160 | 62.84 |
| 5 | 155-165 | 60.65 |
| 6 | 155-170 | 65.09 |
| 7 | 160-160 | 61.92 |
| 8 | 160-165 | 62.89 |
| 9 | 160-170 | 58.30 |
本实验结果表明：温度变化155-175度下，经过挤压膨化的红小豆的糖苷酶抑制活性最高。
实验3：红小豆粉膨化前后活性物质的成分含量变化，抗氧化活性与α糖苷酶抑制活性变化测定实验。实验计算20mg/ml的小豆粉膨化前后的水提液的半数抑制率/IC50浓度：
本实验结果证明：挤压膨化后红小豆比挤压膨胀前糖苷酶抑制率显著提高。
实验4：挤压膨化红小豆粉添加前后其糖苷酶抑制率的影响：
| α糖苷酶抑制率(%) | |
| 未挤压小豆粉多糖 | 6.33±0.12c |
| 挤压小豆粉多糖 | 35.47±2.74b |
| 未挤压小豆粉蛋白 | 1.66±0.05c |
| 挤压小豆粉蛋白 | 60.44±5.68a |
本实验结果证明：经过挤压膨胀的红小豆粉的多糖和蛋白对α-糖苷酶的抑制率分别为35.47%和60.44%，说明经过挤压膨胀的红小豆粉多糖和蛋白是降血糖的主要成分。
实验5：挤压膨胀红小豆粉降血糖活性研究：动物实验，正式实验前将所有动物禁食14小时不禁水，将STZ诱导的高血糖鼠和正常SD鼠分别分为4组：灌胃水不做处理——对照组；灌胃200mg/kg红豆提取——ABE组；灌胃200mg/kg挤压红豆提取——EABE组；灌胃50mg/kg阿卡波糖组，灌胃后30min再次灌胃2g/kg的蔗糖溶液，测定其在灌胃蔗糖后的0、30、60、120min的血糖值，血糖测定采用尾静脉取血，实验结果分别如图1和图2所示。
实验结果表明：经过挤压膨胀的红小豆可抑制正常鼠和糖尿病鼠餐后血糖的升高，改善糖耐量水平。
实验6：挤压膨胀红小豆蛋白降血糖活性研究。实验动物：30只遗传型糖尿病KK-Ay小鼠，饲喂高糖高脂饲料，并在适应性饲养第3天、第7天分别测 血糖，取KK-Ay小鼠血糖值大于11.1mol/L纳入实验，并按血糖值随机分为糖尿病模型组、高蛋白剂量组——蛋白添加量为饲料的2%及低蛋白剂量组——蛋白添加量为饲料的1%，连续饲喂6周。
经过挤压膨胀的红小豆蛋白对糖尿病鼠血糖的影响结果如图3所示。
实验结果表明：饲喂经过挤压膨胀的红小豆蛋白42天后，经过挤压膨胀的红小豆蛋白各剂量组均能明显降低糖尿病鼠血糖水平。
实验7：经过挤压膨胀红小豆蛋白对糖尿病鼠口服葡萄糖耐量影响结果如图4所示。
实验结果证明：饲喂经过挤压膨胀的红小豆蛋白六周后，糖尿病鼠糖耐量水平明显改善，模型组在给予糖水30min后血糖达到峰值，且在30min后仍保持较高水平。挤压小豆蛋白各剂量组30分钟后血糖值均低于模型组。
Claims (2)
1.一种提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法，包括下列步骤：
(1)未经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖的纯化：
A、粉碎、筛选：取红小豆，粉碎、过筛，测定获得的物质的成分；
B、蛋白纯化：采用常规酸碱沉降法进行蛋白纯化；
C、粗多糖常规纯化：
a、粗多糖液制备；
b、粗多糖纯化；
(2)经过挤压膨化的红小豆的蛋白和多糖液纯化：
A、粉碎、筛选：另取红小豆，粉碎、过筛，测定获得的物质的成分；
B、加水搅拌：在红小豆粉中添加8-10％的水，搅拌均匀；
C、挤压膨化：取搅拌后的红小豆粉，进行挤压膨化；
D、粉碎、筛选：将挤压膨化后的红小豆粉粉碎、过筛；
E、蛋白纯化：采用常规酸碱沉降法进行蛋白纯化；
F、粗多糖常规纯化：
a、粗多糖液制备；
b、粗多糖纯化；
(3)利用体外测定糖苷酶一致的方法比较经过挤压膨胀前后的蛋白和多糖对α糖苷酶的抑制活性；
所述进行蛋白纯化的酸碱沉降法的具体做法为：称取原料粉末用蒸馏水按照1：8比例浸泡过夜，3500r离心5-15min，收集上清用1M氢氧化钠调pH到8.0-10.0，磁力搅拌25-35min，5000r离心15-25min，收集上清液。用1N盐酸调pH到6.0-8.0，5000r离心15-25min，弃去上清液，沉淀用去离子水润洗2-3遍，冻干备用；
所述粗多糖液制备的具体做法为：称取原料粉，浸泡20-40min，加15-25倍量水超声溶解豆粉，溶液加无水乙醇使含醇量达70-90％，3-5℃冷藏过夜，3500r离心15-25min，沉淀加5-15mL水溶解，得到粗多糖液；
所述粗多糖纯化的具体做法为：粗多糖液加10％三氯乙酸水溶液0.5-1.5mL，3-5℃冷藏过夜，3500r离心15-25min，取上清液，再加无水乙醇使含醇量达到70-90％，3-5℃冷藏过夜，4500r离心5-10min，弃去上清液，沉淀加5-15mL水溶解再加0.5％活性炭，沸水煮25-35min，过滤，加蒸馏水定容于25mL容量瓶；
所述挤压膨化过程中的挤压机Ⅰ区温度范围为140-180℃、Ⅱ区温度范围为120-160℃。
2.根据权利要求1所述的提高红小豆降血糖效果的物质的确定方法，所述过筛为过55-65目筛。
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