CN104922173A - 簕菜提取物抑制α-葡萄糖苷酶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了簕菜提取物制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。该簕菜提取物由乙醇提取浓缩，经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取并浓缩后得到，经鉴定其含有9种萜类化合物。本发明还公开了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其含有簕菜提取物以及一种或多种在药学上可接受的辅助剂。实验表明，簕菜叶、茎、根的提取物都表现出α-葡萄糖苷酶的抑制活性；簕菜提取物的9个萜类化学成分中，化合物6具有最好的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，远高于对照品阿卡波糖。

Description

簕菜提取物抑制α-葡萄糖苷酶的应用

技术领域

本发明涉及簕菜提取物的一种新用途，具体涉及簕菜提取物制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

背景技术

糖尿病是一类代谢性疾病，它的特征是血糖长时间高于标准值。高血糖会造成三多一少的症状：吃多、喝多、尿多、以及体重下降。如果未经治疗，糖尿病可能引发许多并发症。急性并发症包括糖尿病酮酸血症与高渗透压高血糖非酮酸性昏迷；严重的长程并发症则包括心血管疾病、中风、慢性肾脏病、糖尿病足、以及视网膜病变等。

世界卫生组织2011年的的报告指出全世界有3.46亿人患有糖尿病，2004年估计有340万人死于高血糖，超过80％的糖尿病死亡发生在低收入和中等收入国家。2013年全球共有3.82亿名糖尿病患者，当中有90％是第二型糖尿病。在成年人中患有糖尿病的比例已经达到8.3％，预期到2035年全世界糖尿病患者将增加到5.92亿人。2012-2013年间，糖尿病每年造成1500万至5100万人死亡，在死因中排名第八。因此，糖尿病已经成为一种严重威胁人类健康的慢性疾病，如何防治糖尿病已经成为目前医药界重点关注的一大课题。

目前市场上治疗糖尿病药物的作用机制主要有：(1)刺激胰岛β细胞分泌胰岛素；(2)降低肠道对葡萄糖的吸收；(3)抑制肝糖产生；(4)增强周缘组织对胰岛素敏感性。口服降糖药有以下几类：(1)磺脲类药物：属于促胰岛素分泌剂，主要药理作用是通过刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，增加体内的胰岛素水平而降低血糖；(2)噻唑烷二酮类药物：主要通过增加靶细胞对胰岛素作用的敏感性而降低血糖；(3)格列奈类药物：为非磺脲类的胰岛素促泌剂，主要通过刺激胰岛素的早期分泌而降低餐后血糖；(4)α-糖苷酶抑制剂：通过抑制碳水化合物在小肠上部的吸收而降低餐后血糖；(5)二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂：通过抑制DPP-4而减少GLP-1在体内的失活，增加GLP-1在体内的水平；(6)双胍类药物：主要药理作用是通过减少肝葡萄糖的输出和改善外周胰岛素抵抗而降低血糖。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂是比较成熟的治疗糖尿病药物，已广泛应用于临床。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。目前已上市并在临床上应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药主要有阿卡波糖、伏格列波糖等。

簕菜，学名为白簕(Acanthopanax trifoliatus(Linn.)Merr.)，又称鹅掌簕、三叶五加、三加皮、苦刺、刺三加，为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)植物。广泛分布于我国中部和南部，印度、菲律宾、缅甸、泰国、越南和孟加拉国等地也有分布。簕菜是药食两用植物，簕菜产地民间自古就有采集簕菜作为鲜食蔬菜和保健药材的习俗。李时珍曰：“五加治风湿痪库，壮筋骨，其功良深”。明代《食物本草》中记有“五加，叶作蔬食，去皮肤风湿”。据《广东药用植物简编》(吴修仁编)记载，簕菜根、茎、叶均可入药，其辛、微苦、涩、凉，气微香。根，祛风除湿、散痕、止痛。叶，疏风，消肿，止痒，有舒筋活血、消肿解毒之功效。据《中国高等植物图鉴》，簕菜味苦、辛、凉，具有清热解毒、祛风利湿、舒筋活血、止咳平喘之功效。簕菜在广东江门市的恩平等地盛产，并且十多年前已经开始了人工种植。目前为止，并未见有关于簕菜降血糖作用方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是为现有制备治疗糖尿病药物领域提供一种新途径。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

簕菜提取物制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

进一步地，所述簕菜提取物按照以下方法提取而得：

(1)采集新鲜簕菜原料，常温干燥后粉碎，得簕菜粉末；

(2)将簕菜粉末用乙醇进行冷浸提取，每隔一天进行过滤，共提取三次，合并提取液，浓缩得簕菜醇提物；

(3)将簕菜醇提物依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，萃取液分别进行浓缩，得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层，簕菜提取物为簕菜醇提物和/或乙酸乙酯层。

进一步地，所述簕菜原料是簕菜的根、茎、叶和全植物的至少一种。

进一步地，所述乙醇的体积浓度是30～95％。

进一步地，所述步骤(2)中每千克簕菜粉末用10～30升的乙醇进行提取。

进一步地，述簕菜提取物含有以下化合物1～9中的至少一种：

一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其含有上述簕菜提取物，以及一种或多种在药学上可接受的辅助剂。

进一步地，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂是胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液。

本发明以对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物的酶抑制剂筛选模型测定了簕菜提取物及其化学成分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。实验结果表明：不同部位的簕菜中的抑制α-葡萄糖苷酶的活性物质都可以通过有机溶剂萃取步骤进行浓缩；簕菜叶、茎、根的乙酸乙酯层都表现出最高的抑制活性；簕菜乙酸乙酯层的9个萜类化学成分中，二萜化合物ent-kaur-15-en-17-al-19-oic acid具有最好的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，远高于对照品阿卡波糖。

本发明的有益效果是：本发明从簕菜中分离得到簕菜提取物，从簕菜乙酸乙酯层中鉴定了9个萜类化合物。通过实验证明簕菜提取物具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性，尤其是簕菜叶和根的乙酸乙酯层对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于现有药物阿卡波糖，在9个萜类化合物中，化合物6具有最好的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，所以簕菜提取物可以用于制备治疗糖尿病的药物制剂，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液。

附图说明

图1是实施例3簕菜不同部位提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率；

图2是实施例4簕菜化学成分对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

具体实施方式

簕菜：2012年4月份采于广东省江门市恩平雪壮簕菜厂，经中国科学院华南植物园叶华谷研究员鉴定为五加科植物簕菜。

α-葡萄糖苷酶、牛血清白蛋白(BSA)和对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)均购自美国Sigma-Aldrich公司；拜唐苹(每片含50mg阿卡波糖)为拜耳医药保健有限公司生产；其它试剂均为国产分析纯。

Infinite F200多功能酶标仪，奥地利TECAN公司；单道、多道移液器，德国Eppendorf公司；96孔酶标板，德国Greiner公司。

实施例1

簕菜提取物的制备

采集簕菜新鲜叶、茎、根，常温干燥后粉碎，分别取出200g，加入2L 95％食用酒精进行冷浸提取，每隔一天进行过滤，共提取三次，合并提取液，用旋转蒸发仪进行浓缩得不同部位的醇提物(叶：L；茎：S；根：R)。各醇提物依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，浓缩干燥后分别得到石油醚层(叶：LP；茎：SP；根：RP)、乙酸乙酯层(叶：LE；茎：SE；根：RE)、正丁醇层(叶：LN；茎：SN；根：RN)。所有提取物真空干燥后均4℃保存备用。

实施例2

簕菜提取物的化学成分

簕菜乙酸乙酯层提取物经反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、反相硅胶柱层析、制备薄层层析(pTLC)、MCI树脂柱层析等分离手段，分离纯化得到单体化合物，综合运用现代波谱技术(IR、UV、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC)以及与文献比对确定了9个已知的萜类化合物的结构，它们的化学名分别为impressic acid(1)；3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-en-23-al-28-oic acid(2)；3α-hydroxy-lup-20(29)-en-23,28-dioic acid(3)；3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-en-23,28-dioic acid(4)；3α-hydroxy-lup-20(29)-en-30-ol-23,28-dioic acid(5)；ent-kaur-15-en-17-al-19-oic acid(6)；17-hydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid(7)；16α-hydroxy-ent-kauran-19-oic acid(8)和13-epi-ent-manoyloxide-19-oic acid(9)。

实施例3

簕菜提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶溶液的配制：将酶冻干粉用0.1％BSA溶液溶解，配成100U/mL的酶液，置于-20℃的冰箱中冻存。实验前，将100U/mL酶液用移液枪吸取少量，先用0.1％BSA溶液稀释到20U/mL，再用0.1％BSA溶液稀释到0.2U/mL备用。

PNPG溶液配制：称取一定量的PNPG固体，用0.1mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，配成浓度为10mmol/L，然后用1.5mL的离心管分装备用。

本实验采用比色法测定α-葡萄糖苷酶的活性。用二甲基亚砜(DMSO)溶解待测簕菜提取物或化合物，配制质量浓度为10mg/mL的备用溶液。再用PBS稀释备用溶液，配置成所需浓度的待测溶液。在96孔板每孔中加入簕菜提取物或者化合物溶液(实验组)、阿卡波糖溶液(阳性对照组)或PBS(阴性对照组)10μL，PBS 50μL，酶溶液20μL，摇匀，置于37℃水浴恒温10min，然后加入PNPG溶液20μL，摇匀，37℃反应10min，再加入Na₂CO₃终止液30μL终止反应，立即于405nm处测定吸光度值。样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：抑制率(％)＝[(阴性对照组吸光度－实验组吸光度)/阴性对照组吸光度]×100％。当样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率为50％时，将样品质量浓度定为半数抑制浓度(IC₅₀)值。

簕菜提取物为簕菜醇提物(叶：L；茎：S；根：R)、石油醚层(叶：LP；茎：SP；根：RP)、乙酸乙酯层(叶：LE；茎：SE；根：RE)、正丁醇层(叶：LN；茎：SN；根：RN)。结果如图1所示，当样品作用浓度为1mg/mL时，簕菜叶、茎、根的醇提物的抑制率分别为28.5％(L)、25.3％(S)和44.1％(R)，通过有机溶剂萃取分层后的提取物中，簕菜叶、茎、根的乙酸乙酯层都表现出最高的抑制率(LE：97.3％、SE：66.5％、RE：77.3％)，并且都高于阳性对照阿卡波糖(59.1％)，说明不同部位的簕菜中的降糖活性物质都可以通过有机溶剂萃取步骤进行浓缩。

进一步测定簕菜各部位乙酸乙酯层和阿卡波糖在不同浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制率，结果如表1所示，并利用SigmaPlot软件绘制药物浓度-抑制率曲线，算出IC₅₀值分别为，LE：496.9μg/mL、SE：703.1μg/mL、RE：425.0μg/mL、阿卡波糖：512.5μg/mL，说明簕菜叶和根的乙酸乙酯层对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于现有药物阿卡波糖。

表1簕菜不同部位乙酸乙酯层提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率(％)和IC₅₀值(μg/mL)

实验结果表明：簕菜不同部位的提取物都具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性，簕菜叶和根的乙酸乙酯层对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于现有药物阿卡波糖。

实施例4

簕菜化学成分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶溶液的配制、PNPG溶液配制、测定α-葡萄糖苷酶活性的方法同实施例3。

测定萜类化合物1～9抑制α-葡萄糖苷酶的活性，结果如图2所示，当作用浓度为0.1mg/mL时，簕菜中含有的二萜化合物6具有最好的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，抑制率为36.5％，高于对照品阿卡波糖的抑制率20.7％。

进一步测定化合物6在不同浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制率，结果如表2所示，并利用SigmaPlot软件绘制药物浓度-抑制率曲线，算出化合物6的IC₅₀值为146.5μg/mL，低于阿卡波糖的IC₅₀(512.5μg/mL)，说明化合物6对α-葡萄糖苷酶的抑制活性优于阿卡波糖。

表2簕菜中化合物6对α-葡萄糖苷酶的抑制率(％)和IC₅₀值(μg/mL)

实验结果表明：9个萜类化合物对α-葡萄糖苷酶均有一定程度的抑制活性，其中化合物6具有最好的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

实施例5

胶囊剂的制备

取20g簕菜提取物，40g食用纤维素及适量胶囊剂辅料，混合均匀，填充胶囊，胶囊为0#胶囊，填充规格为0.45g/粒。

实施例6

片剂的制备

取30g簕菜提取物、50g微晶纤维素、10g乳糖、1g硬脂酸镁以及适量片剂辅料，混合均匀，按公知的片剂制作技术和装备制成片剂，产品规格为0.5g/片。

实施例7

颗粒剂的制备

取簕菜提取物40g、微晶纤维素70g以及适量颗粒剂辅料混合均匀，使用喷雾干燥工艺进行制粒。

实施例8

口服液制剂的制备

称取簕菜提取物10g、蜂蜜8g以及适量口服液剂辅料，用纯化水配制成100ml的溶液，过滤、灌装，高温瞬时灭菌即得。

实施例9

簕菜提取物的制备

采集簕菜新鲜叶、茎、根，常温干燥后粉碎，分别取出200g，加入6L 30％食用酒精进行冷浸提取，每隔一天进行过滤，共提取三次，合并提取液，用旋转蒸发仪进行浓缩得不同部位的醇提物。各醇提物依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，浓缩干燥后分别得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层。所有提取物真空干燥后均4℃保存备用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.簕菜提取物制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述簕菜提取物按照以下方法提取而得：

(1)采集新鲜簕菜原料，常温干燥后粉碎，得簕菜粉末；

(2)将簕菜粉末用乙醇进行冷浸提取，每隔一天进行过滤，共提取三次，合并提取液，浓缩得簕菜醇提物；

(3)将簕菜醇提物依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，萃取液分别进行浓缩，得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层，簕菜提取物为簕菜醇提物和/或乙酸乙酯层。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述簕菜原料是簕菜的根、茎、叶和全植物的至少一种。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乙醇的体积浓度是30～95％。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中每千克簕菜粉末用10～30升的乙醇进行提取。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述簕菜提取物含有以下化合物1～9中的至少一种：

7.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其特征在于，其含有上述任一项权利要求所述的簕菜提取物，以及一种或多种在药学上可接受的辅助剂。

8.根据权利要求7所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂是胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液。