CN115073374B - 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药提取物技术领域，公开了一种α‑葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法和应用。本发明首次在酒饼簕的叶中提取制备了一种吖啶酮类α‑葡萄糖苷酶抑制剂，其抑制活性明显高于α‑葡萄糖苷酶抑制剂型抗糖尿病药物阿卡波糖，具有极大的潜在医疗保健价值。可将本发明所提取制备的吖啶酮类α‑葡萄糖苷酶抑制剂在降糖药物、降糖保健品、降糖食品等方面应用。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取物技术领域，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是一种危害身体健康的慢性代谢疾病，源于胰岛素分泌不足或者是体内的胰岛分泌细胞受损，主要以高血糖为特征。其发病通常与饮食习惯、生活习惯、遗传因素及后天的器官病变等一系列因素密切相关，糖尿病体内患者体内长期过高的血糖浓度，会引发一系列糖尿病并发症，因此降低血液中的血糖的含量在治疗糖尿病和糖尿病并发症的防治中发挥着重要的作用。
目前，抗糖尿病药物主要包括胰岛素及胰岛素类似物、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。α-葡萄糖苷酶抑制剂是在碳水化合物消化的最后一步抑制双糖降解为单糖，达到防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症的目的。α-葡萄糖苷酶抑制剂对Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病均适用，也可以与其他口服降糖药或胰岛素联用。
然而，现有α-葡萄糖苷酶抑制剂的抗糖尿病药物均有腹胀、排气等副作用。因此，研发新的α-葡萄糖苷酶抑制剂，以期找到新的高效、低毒的糖尿病药物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其结构式如式(I)所示：
第二方面，本发明提供了所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取酒饼簕叶，干燥，粉碎，加入甲醇浸提，得提取液；将所述提取液浓缩至浸膏状，得到粗浸膏；
(2)取所述粗浸膏加入水中，通过柱层析梯度洗脱，得馏分；
(3)取所述馏分，采用中压液相层析分离，得组分；
(4)取所述组分，采用硅胶柱层析纯化，即得。
酒饼簕(Atalantia Buxifolia)为芸香科(Rutaceae.)酒饼簕属的一种传统药用植物，又名东风桔；具有清热、祛风解表、消炎化湿等功效。
本发明首次在酒饼簕的叶中提取制备了一种吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂，其抑制活性明显高于α-葡萄糖苷酶抑制剂型抗糖尿病药物阿卡波糖，具有极大的潜在医疗保健价值。
作为本发明所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法的优选实施方式，在所述步骤(1)中，所述浸提的方法为：按照液料比(35-45):1的比例加入甲醇，浸泡4-6天后减压浓缩提取滤液，将残渣再按照相同的条件重复浸提3-5次，合并滤液，得提取液。
作为本发明所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法的优选实施方式，在所述步骤(2)中，所述柱层析梯度洗脱采用大孔树脂D101；所述洗脱梯度为：30％、50％、70％、90％的甲醇水溶液。
优选的，所述馏分为90％的甲醇水溶液洗脱的馏分。
作为本发明所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法的优选实施方式，在所述步骤(3)中，所述馏分与所述中压液相层析中硅胶的物料比为1:(10-20)。
作为本发明所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法的优选实施方式，在所述步骤(3)中，所述分离采用石油醚和乙酸乙酯体系，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为(4-6):1。
作为本发明所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法的优选实施方式，在所述步骤(4)中，所述硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯体系，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为(6-8):1。
第三方面，本发明将所述α-葡萄糖苷酶抑制剂、所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法在制备降糖药物中应用。
第四方面，本发明将所述α-葡萄糖苷酶抑制剂、所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法在制备保健品和食品中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明首次在酒饼簕的叶中提取制备了一种吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂，其抑制活性明显高于α-葡萄糖苷酶抑制剂型抗糖尿病药物阿卡波糖，具有极大的潜在医疗保健价值。且，本发明的吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂来源于酒饼簕，为植物来源，无毒副作用。可将本发明所提取制备了一种吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂在降糖药物、降糖保健品、降糖食品等方面应用。
附图说明
图1为酒饼簕叶中吖啶酮类α-葡萄糖苷酶的分离流程图。
图2为吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂核磁共振氢谱。
图3为吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂核磁共振碳谱。
图4为吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂的IC50拟合图；
图中，G6为实施例所得黄色固体粉末的实验序号。
图5为阳性对照阿卡波糖的IC50拟合图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所述酒饼簕购自广西壮族自治区钦州市；所述分析级甲醇购于天津市大茂化学试剂厂；所述分析级石油醚购于天津市百世化工有限公司；所述分析级乙酸乙酯购于天津市百世化工有限公司；所述α-葡萄糖苷酶购于美国Sigma公司；所述pNPG(4-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)：购于美国Sigma公司。
实施例：一种吖啶酮类化合物的制备方法
如图1所示，具体步骤如下：
(1)采用浸渍法提取药材化学成分：
取新鲜药材酒饼簕叶3.4Kg阴干，粉碎，过200目筛，按照液料比40:1的比例，加入分析级纯甲醇，浸泡5天后减压浓缩提取，残渣再按照相同的条件重复浸提4次，合并滤液，得提取液；将提取液浓缩至浸膏状，得到酒饼簕叶粗浸膏271.9g；
(2)取酒饼簕叶粗浸膏，以质量比1：1的比例加入超纯水，通过大孔树脂D101柱层析梯度洗脱(洗脱梯度为：0、30％、50％、70％、90％的甲醇水溶液)，将酒饼簕叶浸膏分离成A馏分26.7g(30％)，B馏分35.6g(50％)，C馏分53.2g(70％)，D馏分47.8g(90％)；
(3)取馏分D(90％甲醇洗脱)，先用中压液相层析MPLC(馏分D与硅胶物料比为1:15)，根据薄层色谱石油醚比乙酸乙酯点分离情况；所述石油醚比乙酸乙酯的体系为15:1、10:1、5:1、1:1，将馏分D分离成4个组分D1、D2、D3 7.8g(5:1)和D4；
(4)取D3组分，经过石油醚比乙酸乙酯7:1体系的硅胶柱层析(型号LH-20)得到1个黄色固体粉末。
将所得黄色固体粉末分别采用核磁共振氢谱和核磁共振碳谱检测，结果如图2和图3所示，可知，该黄色固体粉末为吖啶酮类化合物，其结构式如式(I)所示：
其分子式为C20H21NO4，其分子量为339.14651。
试验例：吖啶酮类化合物的体外抗α-葡萄糖苷酶活性测定
(1)制备溶液
制备0.1mol/L，pH＝6.7的磷酸盐缓冲液：分别称取15.6g NaH2PO4·2H2O与35.6gNa2HPO4·12H2O，分别用1000mL纯水溶解，得到摩尔浓度为0.1mol/L的NaH2PO4·2H2O与Na2HPO4·12H2O溶液。取424mL 0.1mol/L NaH2PO4·2H2O溶液和Na2HPO4·12H2O溶液混合，调节pH至6.7，常温密封保存。
制备α-葡萄糖苷酶溶液(0.1U/mL)：称取α-葡萄糖苷酶(10.8U)适量，pH＝6.7的缓冲液溶解，配制成0.1U/mL的酶溶液，4℃环境下保存。
制备pNPG(1.0mM)：称取30.1mg pNPG，加入50mL 0.1mol/L pH＝6.7的缓冲液，溶解，得2.0mM的pNPG溶液，部分2.0mM pNPG溶液用缓冲液稀释到1.0mM，于4℃环境下保存。样品溶液：称取各样品1.0mg，加入1mL DMSO溶液，震荡溶解，得1.0mg/mL的DMSO母液，用pH＝6.7的磷酸盐缓冲液依次稀释，常温避光保存。
(2)检测方法
设置空白对照组、样品实验组(实施例所得黄色固体粉末)、样品背景组(阿卡波糖)，每组做3个平行样。分别测定反应后的对硝基苯酚生成量来计算化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
分别按照不同组的次序依次向96孔板中加入抑制剂(空白对照组以等体积不含抑制剂的溶剂DMSO替代)、α-葡萄糖苷酶溶液(背景组以等体积PBS缓冲液替代)，在37℃的微孔板恒温振荡器中孵育10min。孵育结束，立即加入底物pNPG在37℃的微孔板恒温振荡器中继续孵育30min，在波长为405nm处利用酶标仪检测吸光值，本实验控制吸光度(OD)值小于1。反应体系如表1所示。
表1反应体系
α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式如式(II)所示：
注：A皆为波长为405nm处检测吸光值。
对吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂浓度50μg、25μg、12.5μg、6.25μg、3.125μg数据和阳性对照阿卡波糖1 000μg、500μg、250μg、125μg、62.5μg的浓度进行非线性拟合，如图4、图5所示。可知从酒饼簕中制备得到的黄色固体粉末，具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，是一种吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂。
半数抑制浓度检测结果如表2所示：
表2半数抑制浓度(IC50)比较
可知，将实施例所得到黄色固体粉末与阿卡波糖半数抑制浓度(IC50)比较，从酒饼簕中得到的吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂，其IC50值远低于阿卡波糖。
本发明在首次在酒饼簕的叶中提取制备了一种吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂，其抑制活性明显高于α-葡萄糖苷酶抑制剂型抗糖尿病药物阿卡波糖，具有极大的潜在医疗保健价值。且，本发明的吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂来源于酒饼簕，为植物来源，无毒副作用。可将本发明所提取制备的吖啶酮类α-葡萄糖苷酶抑制剂在降糖药物、降糖保健品、降糖食品等方面应用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取酒饼簕叶，干燥，粉碎，加入甲醇浸提，得提取液；将所述提取液浓缩至浸膏状，得到粗浸膏；
(2)取所述粗浸膏加入水中，采用大孔树脂D101进行柱层析梯度洗脱，得馏分；
(3)取所述馏分，采用石油醚和乙酸乙酯体系进行中压液相层析分离，得组分；
(4)取所述组分，采用石油醚和乙酸乙酯体系进行硅胶柱层析纯化，即得所述α-葡萄糖苷酶抑制剂；所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的结构式如式(I)所示：
2.根据权利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述浸提的方法为：按照液料比(35-45):1的比例加入甲醇，浸泡4-6天后减压浓缩提取滤液，将残渣再按照相同的条件重复浸提3-5次，合并滤液，得提取液。
3.根据权利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述柱层析梯度洗脱的洗脱梯度为：30％、50％、70％、90％的甲醇水溶液。
4.根据权利要求3所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述馏分为90％的甲醇水溶液洗脱的馏分。
5.根据权利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述馏分与所述中压液相层析中硅胶的物料比为1:(10-20)。
6.根据权利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为(4-6):1。
7.根据权利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为(6-8):1。
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