CN110623962A - 2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸在制备糖尿病药物中的应用 - Google Patents
2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸在制备糖尿病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了2α,3β,19α,23‑四羟基‑12‑烯‑28‑乌苏酸在制备糖尿病药物中的应用，2α,3β,19α,23‑四羟基‑12‑烯‑28‑乌苏酸结构式为
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，尤其是2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸在制备糖尿病药物中的应用。
背景技术
我国患糖尿病(diabetes mellitus)的人数正快速增长，目前为糖尿病第二大国，并且糖尿病是危害全人类健康的严重公共卫生问题，尤其是II型糖尿病发病率最高，占糖尿病总病例的90%。研究表明，造成II型糖尿病患者血管内皮损伤的重要因素是餐后血糖的波动和日内最大血糖的波动，而餐后高血糖是心血管疾病死亡的独立危险因素，其作用独立于持续血糖水平。葡萄糖苷酶是一种小肠上皮细胞的膜结合酶，参与生物体的糖代谢，其在小肠内可以催化多糖分解为葡萄糖，是调节食物来源血糖的关键酶，因此可作为药物作用靶点来治疗糖尿病。
桃金娘生长在亚洲的南部及东南部，尤其是在中国的南部比如广东，湖南和广西，是桃金娘科桃金娘属阳生性植物。据报道，这种植物的提取物具有多种生物活性，如抗菌、抗炎等，然而尚缺乏对其更深入的作用机制及相关物质基础的研究。鉴于此，本研究结合体外酶抑制活性试验以及酶抑制动力学研究从桃金娘中筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的单体化合物，为该植物中的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发利用提供参考。
发明内容
本发明公开了2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸在制备糖尿病药物中的应用，从桃金娘中筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的单体化合物2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸，为糖尿病新药物的开发提供了参考。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明提供了2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸在制备糖尿病药物中的应用，2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸的结构式为：
。
进一步的，所述糖尿病为II型糖尿病。
本发明进一步提供了2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。
本发明的2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸，其系统命名为2α,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid。
2α,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid是从桃金娘叶中提取出来的天然化合物，其提取方法，包括以下步骤：
S1.干燥的桃金娘叶粉，用体积浓度为70~95%的乙醇溶液浸提至提取液无色，合并所得的浸出液，减压浓缩得浸膏；
S2. 浸膏用水分散，然后用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物；
S3.乙酸乙酯部位采用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱浓度按体积比计，依次为：1:0、9:1、8:2、2:1、1:1、0:1，薄层色谱检测合并相同流分，得到六个组分Fr.A-Fr.F；
S4.取组分Fr.B进一步用MCI柱色谱分离，洗脱液为70-90%的甲醇溶液，分离得到Fr.B1组分；
S5.取组分Fr.B1采用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱浓度按体积比计，依次为：50:1、20:1、0:1，薄层色谱检测得到10个组分Fr.B1-1~Fr.B1-10；
S6.取Fr.B1-2，经制备液相色谱，以甲醇-水梯度洗脱，以体积比计，依次为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，流速为1-10.0mL/min，依次分离得到8个组分Fr.B1-2-1~Fr.B1-2-8；
S7.取Fr.B1-2-5，以甲醇-水按照体积比70:30、流速为3.0mL/min进行半制备，得到2α,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid。
试验证明，2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用，IC50值可达到0.187 ± 0.071 mg/mL，由于其对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性，因此可将其应用于制备治疗糖尿病药物和制备葡萄糖苷酶抑制剂，为制备治疗糖尿病的药物提供了更广阔的思路。
附图说明
图1a是不同浓度的2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸对α-葡萄糖苷酶的抑制率结果示意图。
图1b是不同浓度的阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率结果示意图。
图2a是2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸的酶量-反应速率曲线。
图2b是阿卡波糖的酶量-反应速率曲线。
图2c是2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸的酶抑制动力学曲线。
图2d是阿卡波糖的酶抑制动力学曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
1、仪器
核磁共振光谱仪(DRX-500 MHz，德国布鲁克)，高效液相色谱仪(Agilent LC1260infinity)；旋转蒸发仪(RE-52A，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(Mettler Toledo XS105DualRange，瑞士)；硅胶(100-200目，青岛海洋化学有限公司)；薄层硅胶板GF254 (中国青岛海洋化工有限公司)；反相填料 (RP-18，德国默克)。MCI填料(MCI-gel CHP-20P，日本三菱)；RP色谱柱(Zorbax SB-C18，5μm，9.4×250 mm，美国安捷伦)。多功能酶标仪(InfiniteM200 Pro，奥地利)。
2、药材、药品与试剂
桃金娘叶采集于广西平南县，经桂林医学院药学院黄德青副教授鉴定为桃金娘叶。凭证样本 (编号: 2016082501)存放于桂林医学院药学院。
氯仿，石油醚，乙酸乙酯，甲醇（分析级，均购自中国西陇科学有限公司）；α-葡萄糖苷酶（G0660-750UN，SIGMA，德国）；阿卡波糖（109A032，solarbio，北京索莱宝科技有限公司）；4-pNPG（N0493，东京化学工业株式会社）。
实施例1 2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸的提取。
S1.干燥的桃金娘叶粗粉20 kg，用体积浓度为95%的乙醇溶液浸提至提取液无色，合并所得的浸出液，减压浓缩得浸膏；
S2. 浸膏用水分散，然后用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物；
S3.乙酸乙酯部位采用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱浓度按体积比计，依次为：1:0、9:1、8:2、2:1、1:1、0:1，薄层色谱检测合并相同流分，得到六个组分Fr.A-Fr.F；
S4.取组分Fr.B进一步用MCI柱色谱分离，洗脱液为90%的甲醇溶液，分离得到Fr.B1组分；
S5.取组分Fr.B1采用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱浓度按体积比计，依次为：50:1、20:1、0:1，薄层色谱检测得到10个组分Fr.B1-1~Fr.B1-10；
S6.取Fr.B1-2，经制备液相色谱，以甲醇-水梯度洗脱，以体积比计，依次为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，流速为1-10.0mL/min，依次分离得到8个组分Fr.B1-2-1~Fr.B1-2-8；
S7.取Fr.B1-2-5，以甲醇-水按照体积比70:30、流速为3.0mL/min进行半制备，得到2α,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid，结构式为：
。
实施例2 2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定。
2.1以PNPG为底物，利用α-葡萄糖苷酶催化水解PNPG产生对硝基酚（PNP），以一定时间内反应体系中PNP的含量变化来计算样品提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。反应体系按参考文献1进行，参考文件1为许有瑞, 伊辉, 张可锋, 等. 瑶药葫芦钻中α-葡萄糖苷酶抑制活性部位的筛选。测定化合物和阿卡波糖(阳性对照)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。以化合物的1%DMSO溶液作为母液，配制成供试验使用的不同浓度的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液，pH = 6.8)。在96孔板中加入50µL0.01mmol/L磷酸缓冲液、50 µL不同浓度的化合物(0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL)和100 µL 0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶。在25 ℃下孵育10 min，然后向96孔板中加入50 µL 2 mM的4-pNPG，然后在25 ℃下孵育10 min。在405nm波长处检测吸光度(1、5、10、15、20min)。α-葡萄糖苷酶抑制率(%) = [(A0-A1)/A2]×100%。A0是空白，即不加样品反应后的吸光度值，A1是加样品反应后的吸光度值，A2是背景，即只加样品的吸光度值，IC50为抑制50%酶活性时所需的抑制浓度。
2.2 化合物的酶抑制动力学试验
在化合物质量浓度分别为0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL时，测定其酶抑制活性，考察化合物不同质量浓度对酶活性的影响；在化合物质量浓度为0.5 mg/mL的条件下，分别测定反应时间为1、5、10、15、20 min的酶抑制活性，考察化合物不同反应时间对酶活性的影响。
在酶浓度为0.24、0.36、0.48、0.60 U/mL时测定化合物质量浓度分别为0、0.5 mg/mL时的酶抑制活性，考察其抑制作用的可逆性；取0.5、1、1.7、2 mmol/L 4个浓度的PNPG与0.0935、0.1870、0.3750 mg/mL 3个质量浓度的化合物，分别测定反应速率，由LineweaverBurk 作图法绘制化合物的酶抑制动力学曲线，考察其抑制作用类型。
2.3 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析。
2.4结果
2.4.1化合物和阿卡波糖酶活性抑制作用
化合物和阿卡波糖酶活性抑制率测定结果见图1 a和图1b。
相较于阳性对照物阿卡波糖，随着化合物浓度的增加，其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性明显增大。随着反应时间的增加，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率在1 min内达到最大值，随后抑制率显著降低，而化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率快速达到最大值后，接着抑制率稍有降低，随后抑制率维持在一定水平上。化合物2α, 3β, 19α, 23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid的IC50为0.187 ± 0.071 mg/mL，阳性对照药阿卡波糖的的IC50为0.235 ± 0.063 mg/mL，化合物对α-葡萄糖苷酶抑制能力显著优于阿卡波糖，表明其是一种潜在的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂。
2.4.2 化合物和阿卡波糖的酶抑制动力学试验
当化合物的质量浓度为0.5 mg/mL时，酶活性被化合物迅速抑制，抑制类型与阿卡波糖相似，属于可逆性抑制。抑制作用的可逆性如图2a、2b所示。
按Lineweaver-Burk作图法，绘制化合物和阿卡波糖的抑制作用动力学曲线，得到1/[S]对1/V的线性回归关系，如图2c、2d所示。随着化合物2α, 3β, 19α, 23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid质量浓度的上升，最大反应速度Vmax逐渐减小，表明化合物以竞争性的方式抑制α-葡萄糖苷酶活性。
2.5 讨论与结论
α-葡萄糖苷酶抑制剂能够有效地降低餐后高血糖，一直以来都作为治疗II型糖尿病的理想药物，目前，临床上已有一些通过抑制α-葡萄糖苷酶活性来治疗糖尿病的药物，其中研究最为成熟的是阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇，这些药物虽然可以有效降低餐后血糖水平和减少糖尿病并发症的发生，但毒副作用较大，如肠胃胀气和腹泻等。因此，从天然植物中筛选出新型高效且毒副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制剂成为了当前研究的热点。
本研究体外桃金娘化合物2α, 3β, 19α, 23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oicacid对α-葡萄糖苷酶抑制活性试验，其结果IC50为0.187 ± 0.071 mg/mL，对α-葡萄糖苷酶抑制能力显著优于阿卡波糖，表明其是一种潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂，并且对酶的抑制呈竞争性抑制类型。
Claims (3)
1.2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸在制备糖尿病药物中的应用，其特征在于：
2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸的结构式为：
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述糖尿病为II型糖尿病。
3.2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。
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