CN111349017B - 一种从金钗石斛中提取化合物的工艺及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从金钗石斛中提取化合物的工艺，A)将金钗石斛粉碎，用乙醇水溶液浸提，浸提液合并浓缩，得到浸膏A；B)将所述浸膏A与水混合，乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；C)取浸膏B，过减压柱，经梯度洗脱，获得16个流分；D)将流分13过反相柱，进行梯度洗脱，得到14个流分；E)第7流分过葡聚糖凝胶柱，以甲醇和氯仿的混合液进行洗脱，得到18个流分，合并第15～17流分，经半制备HPLC纯化，得到式I和式II所示化合物。本发明研究表明式I和II所示的化合物能够抑制α‑葡萄糖苷酶的活性和抑制NO的产生，体现抗炎活性。表明该化合物能够用于制备治疗和/或预防糖尿病和炎症的食品以及药品。

Description

一种从金钗石斛中提取化合物的工艺及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种从金钗石斛中提取化合物的工 艺及应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高，糖尿病的患病率也在逐年增加，据 2017年国际糖尿病联盟(IDF)发布的数据显示，全世界约有4.25亿人(20-79 岁)患有糖尿病，其中中国有1.14亿，位居世界第一，根据这一趋势，到2045 年，全球将有6.29亿人是糖尿病患者。此外，糖尿病的发病率高达12％，并且 在逐渐趋于年轻化。糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一种多种因素和病因 造成的代谢紊乱疾病，它的特征在于慢性的高血糖症。其发病与饮食、遗传、 环境因素和免疫系统功能紊乱等有密切关系。糖尿病主要分为三类，I型、II型和妊娠糖尿病，其中II型患者占总糖尿人数的90％以上，但目前对其发生 发展的精确分子机制尚不完全清楚。近几年，积累的诸多临床实验证据揭示 II型糖尿病的发病机制与肥胖及炎症所引起的胰岛素抵抗有关。
炎症是机体、细胞对外界物理、化学和生物等有害刺激做出的一系列免 疫应答反应，反应的常见表现有发热、红肿、疼痛以及功能障碍等。一般来 说，炎症是组织器官对损伤或者感染做出的防御反应，对机体是有益的，但 是长期的炎症反应会诱导机体产生过激的异常反应，甚至会诱发许多疾病， 如糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆症、癌症等。目前临床上常使用甾体激 素和非甾体类(阿司匹林、双氯芬酸和布洛芬等)治疗炎症，人体服用后会 产生一系列的毒副作用，如肝脏和胃肠道损伤以及心血管系统损伤等。此外， 植物源药物药效缓慢温和、持久性强，毒副作用小且不易产生机体耐受，因 此有必要从植物中寻找具有降血糖和抗炎活性的物质，为新型糖尿病和炎症 药物的研发提供先导化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从金钗石斛中提取化合物的工艺及应用，本 发明中的工艺从药用植物金钗石斛的茎中提取得到式I和II化合物，能有效抑 制血糖水平关键酶的活性，以LPS诱导RAW264.7产生NO为模型进行抗炎活性 评价，I和II所示的化合物能够抑制NO的产生，体现抗炎活性。
本发明提供一种从金钗石斛中提取化合物的工艺，包括以下步骤：
A)将金钗石斛粉碎，用1～3倍体积的乙醇水溶液浸提2～5次，所得浸提液 过滤后合并浓缩，得到浸膏A；
B)将所述浸膏A与水制备成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇 进行萃取，筛选三种萃取液后，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
C)取浸膏B，过减压柱，经石油醚和乙酸乙酯混合洗液梯度洗脱，然后 用丙酮冲柱，收集流分，将所得各个流分浓缩合并，最终获得16个流分，记 为Fr.1～Fr.16；
D)将流分Fr.13过反相柱，以30～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到 14个流分，记为Fr.13-1～Fr.13-14；
E)取流分Fr.13-7过葡聚糖凝胶柱，以甲醇和氯仿的混合液进行洗脱，得 到18个流分，记为Fr.13-7-1～Fr.13-7-18，合并Fr.13-7-15～Fr.13-7-17流分，经 半制备HPLC纯化，在tR＝13.5min得到式I所示化合物，在tR＝16.4min得到式II 所示化合物；
Figure BDA0002407472360000021
优选的，所述步骤B)中浸膏A与水的体积比为1∶(0.5～2)；
所述浸膏A与石油醚的体积比为1∶(0.5～2)；所述浸膏A与乙酸乙酯的 体积比为1∶(0.5～2)；所述浸膏A与正丁醇的体积比为1∶(0.5～2)。
优选的，所述步骤C)中石油醚和乙酸乙酯混合洗液的梯度洗脱具体为： 石油醚和乙酸乙酯的体积比在80～120小时内由20∶1均匀降至0∶1，所述梯度洗 脱的总时间优选为90～110小时，更优选为100小时。
优选的，所述步骤C)将得到的各个流分减压浓缩，经过薄层层析点板检 测，根据显色合并相似流分。
优选的，所述步骤D)中梯度洗脱具体为：依次以质量浓度30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％和100％的甲醇水溶液进行洗脱，每个洗脱梯度 的洗脱时间相等，洗脱总时间为24～48小时，更优选为32～36小时。
优选的，所述步骤E)中甲醇与氯仿的体积比为1∶(0.5～2)。
本发明提供一种如上文所述的工艺提取得到的式I所示化合物和式II所示 化合物在制备防治糖尿病和缓解炎症的药物中的应用。
优选的，所述防治糖尿病的药物为α-葡萄糖苷酶活性抑制剂；所述缓解炎 症的药物为NO的产生抑制剂。
本发明提供一种药物制剂，包括上文所述的工艺提取得到的式I所示化合 物或式II所示化合物以及药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、 膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
本发明提供了一种从金钗石斛中提取化合物的工艺，包括以下步骤：A) 将金钗石斛粉碎，用1～3倍体积的乙醇水溶液浸提2～5次，所得浸提液过滤后 合并浓缩，得到浸膏A；B)将所述浸膏A与水制备成混悬液，依次用石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；C)取浸膏 B，过减压柱，经石油醚和乙酸乙酯混合洗液梯度洗脱，最后用丙酮冲柱，收 集流分，将所得各个流分浓缩合并，最终获得16个流分，记为Fr.1～Fr.16；D) 将流分Fr.13过反相柱，以30～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到14个流分，记为Fr.13-1～Fr.13-14；E)取Fr.13-7过葡聚糖凝胶柱，以甲醇和氯仿的混 合液进行洗脱，得到18个流分，记为Fr.13-7-1～Fr.13-7-18，合并 Fr.13-7-15～Fr.13-7-17流分，经半制备HPLC纯化，在tR＝13.5min得到式I所示化 合物，在tR＝16.4min得到式II所示化合物。本发明研究表明式I和II所示的化合 物能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性，以LPS诱导RAW264.7产生NO为模型进行抗 炎活性评价，I和II所示的化合物能够抑制NO的产生，体现抗炎活性。因此表 明该化合物能够用于制备治疗和/或预防糖尿病和炎症的食品和/或药品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中式I所示化合物的1H NMR图谱；
图2是本发明实施例1中式I所示化合物的13C NMR+DEPT135图谱；
图3是本发明实施例1中式I所示化合物的HSQC图谱；
图4是本发明实施例1中式II所示化合物的1H NMR图谱；
图5是本发明实施例1中式II所示化合物的13C NMR+DEPT135图谱；
图6是本发明实施例1中式II所示化合物的HSQC图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种从金钗石斛中提取化合物的工艺，包括以下步骤：
A)将金钗石斛粉碎，用1～3倍体积的乙醇水溶液浸提2～5次，所得浸提 液过滤后合并浓缩，得到浸膏A；
B)将所述浸膏A与水制备成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇 进行萃取，筛选三种萃取液后，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
C)取浸膏B，过减压柱，经石油醚和乙酸乙酯混合洗液梯度洗脱，最后 用丙酮冲柱，收集流分，将所得各个流分浓缩合并，最终获得16个流分，记 为Fr.1～Fr.16；
D)将流分Fr.13过反相柱，以30～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得 到14个流分，记为Fr.13-1～Fr.13-14；
E)取Fr.13-7过葡聚糖凝胶柱，以甲醇和氯仿的混合液进行洗脱，得到 18个流分，记为Fr.13-7-1～Fr.13-7-18，合并Fr.13-7-15～Fr.13-7-17流分，经 半制备HPLC纯化，在tR＝13.5min得到式I所示化合物，在tR＝16.4min得到 式II所示化合物；
Figure BDA0002407472360000041
Figure BDA0002407472360000051
金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)植物，又名金钗石、扁金钗、扁黄草等，为我国传统名贵中 药，素有“千金草”之称，常以新鲜或干燥茎入药。金钗石斛在我国主要分 布于贵州、云南、广西等长江以南的亚热带地区。在本发明中，优选使用金 钗石斛的干燥茎为原料进行提取。
本发明将金钗石斛干燥茎粉碎，加乙醇水溶液浸提，所得浸提液过滤后 合并浓缩成浸膏A。
在本发明中，所述金钗石斛干燥茎的粉碎粒径优选为0.1～1cm，更优选为 0.5～0.6cm；所述乙醇水溶液中乙醇与水的体积比优选为(15～20)∶1，更优 选为(18～19)∶1；所述乙醇水溶液的体积为粉碎后的金钗石斛的体积的1～3 倍，优选为2倍体积；所述浸提的次数优选为2～5次，优选为3～4次；所述 浸提液浓缩的浓缩比优选为(3～5)∶1，更优选为4∶1。
得到浸膏A后，本发明将所述浸膏A与水制备成混悬液，然后依次用石 油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取层萃取至萃取液无色停止萃取， 将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B。
石油醚、乙酸乙酯和正丁醇极性依次增大，正丁醇萃取液中可能是一些 极性大的糖苷类化合物，具体实验时选择极性中等的流分，即乙酸乙酯萃取 液。在本发明中，所述浸膏A与水的体积比优选为1∶(0.5～2)，更优选为 1∶(1～1.5)；所述浸膏A与石油醚的体积比为1∶(0.5～2)，更优选为1∶ (1～1.5)；具体的，在本发明的实施例中，浸膏A∶水∶石油醚的体积比＝1∶ 1∶1；所述浸膏A与乙酸乙酯的体积比优选为1∶(0.5～2)，更优选为1∶ (1～1.5)；具体的，在本发明的实施例中，浸膏A∶水∶乙酸乙酯的体积比 ＝1∶1∶1；所述浸膏A与正丁醇的体积比为1∶(0.5～2)，更优选为1∶(1～1.5)。 具体的，本发明的实施例中，浸膏A∶水∶正丁醇的体积比＝1∶1∶1。
在本发明中，所述乙酸乙酯萃取液的浓缩比优选为(2～5)∶1，更优选 为(3～4)∶1。
得到浸膏B后，本发明将浸膏B过减压柱，经石油醚和乙酸乙酯混合洗 液梯度洗脱，然后用丙酮冲柱，收集流分，将所得各个流分浓缩合并，最终 获得16个流分，记为Fr.1～Fr.16。
在本发明中，所述减压柱为硅胶柱层析，所述硅胶柱为硅胶H，所述硅 胶H的粒径为100～200目。所述石油醚与乙酸乙酯的混合溶液的体积比为 (20～0)∶1，具体的，在本发明的实施例中，所述梯度洗脱的具体过程为：
石油醚与乙酸乙酯的混合溶液的体积比初始为20∶1，随着梯度洗脱的进 行体积比均匀减小，直至降为0∶1，所述梯度洗脱的总时间优选为80～120小 时，更优选为90～110小时，最优选为100小时；所述梯度洗脱的温度优选为 室温，即20～35℃，优选为25～30℃，每个梯度所用洗脱液的体积优选为3～4L。
洗脱完成后，使用丙酮冲柱，收集流分，优选的，每500mL收集一次， 将所得各个流分经过薄层层析(TLC)点板检测，合并相似流分，获得16个流 分，记为Fr.1～Fr.16。
在本发明中，得到的各个流分经过薄层层析(TLC)点板检测，肉眼观察， 主点相同或者类似的合并到一起，共获得16个流分。
经高效液相色谱分析后，Fr.13特征峰比较明显，将其过反相柱(填料为 C18)，依次以30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇水溶液 梯度洗脱，100mL收集一次，每个梯度用1.5L混合液，所得各个流分经过薄 层层析(TLC)点板检测，肉眼观察，主点相同或者类似的合并到一起，得到14 个流份，记为Fr.13-1～Fr.13-14。
在本发明中，所述梯度洗脱中，每个梯度的洗脱时间相等，所述洗脱的 总时间优选为24～48小时，更优选为32～36小时。
取流分Fr.13-7过葡聚糖Sephadex LH-20凝胶柱，以甲醇和氯仿的混合液 进行洗脱，室温条件下，2～3秒一滴，每5mL收集一管，所得各个流分减压 浓缩，经过薄层层析(TLC)点板检测，合并相似流分，得到18个流分，记为F r.13-7-1～Fr.13-7-18。
在本发明中，所述甲醇和氯仿的体积比优选为1∶(0.5～2)，更优选为1∶ (1～1.5)。
Fr.13-7-15～Fr.13-7-17呈点相似，将其合并后经半制备HPLC(C18色谱柱， 35％甲醇-水洗脱)纯化，得到式I所示化合物(tR＝13.5min)和式II化合物 (tR＝16.4min)。
Figure BDA0002407472360000071
本发明还提供了一种式I所示化合物或式II所示化合物在制备防治糖尿 病和缓解炎症的药物中的应用，优选的，所述防治糖尿病的药物为α-葡萄糖 苷酶活性抑制剂，所述糖尿病为II型糖尿病，本发明中的式I和式II所示化 合物通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，减少低聚糖在消化道内分解，延缓肠道 对葡萄糖的吸收，从而降低餐后高血糖风险，实现降低血糖水平的效果；
本发明中所述缓解炎症的药物为NO的产生抑制剂，本发明中的式I所示 化合物或式II所示化合物能够抑制NO的产生，体现抗炎活性，缓解机体发 红、肿胀、发热、疼痛等症状。
本发明还提供了一种药物制剂，包括上述工艺提取得到的式I所示化合物 或式II所示化合物以及药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物制剂的剂型优选为口服制剂，更优选为片剂、胶囊剂、 丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
更优选的，所述胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂；更优选的，片剂为口服 片剂或口腔片剂；更优选的，口服片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的 药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥 作用。在本发明提供的一些实施例中，口服片剂为普通压制片、分散片、泡 腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。
所述药学上可接受的辅料包括水果粉、食用香精、甜味剂、酸味剂、填 充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增 塑剂中的一种或两者以上的混合物。
本发明提供了一种从金钗石斛中提取化合物的工艺，包括以下步骤：A) 将金钗石斛粉碎，用1～3倍体积的乙醇水溶液浸提2～5次，所得浸提液过滤 后合并浓缩，得到浸膏A；B)将所述浸膏A与水制备成混悬液，依次用石油 醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；C)取 浸膏B，过减压柱，经石油醚和乙酸乙酯混合洗液梯度洗脱，最后用丙酮冲 柱，收集流分，将所得各个流分浓缩合并，最终获得16个流分，记为Fr.1～Fr.16； D)将流分Fr.13过反相柱，以30～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到14 个流分，记为Fr.13-1～Fr.13-14；E)取Fr.13-7过葡聚糖凝胶柱，以甲醇和氯 仿的混合液进行洗脱，得到18个流分，记为Fr.13-7-1～Fr.13-7-18，合并 Fr.13-7-15～Fr.13-7-17流分，经半制备HPLC纯化，在tR＝13.5min得到式I所 示化合物，在tR＝16.4min得到式II所示化合物。本发明研究表明式I和II所 示的化合物能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性，以LPS诱导RAW264.7产生NO 为模型进行抗炎活性评价，I和II所示的化合物能够抑制NO的产生，体现抗 炎活性。因此表明该化合物能够用于制备治疗和/或预防糖尿病和炎症的食品 和/或药品。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种从金钗石 斛中提取化合物的工艺及应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保 护范围的限定。
实施例1
步骤1：将金钗石斛干燥茎(13kg)粉碎后，用2倍体积的乙醇水溶液浸 提3次，所得浸提液过滤后合并浓缩成浸膏A；
步骤2：将所述浸膏A与水体积比1∶1制成混悬液，依次用石油醚(浸 膏A∶水∶石油醚＝1∶1∶1)、乙酸乙酯(浸膏A∶水∶乙酸乙酯＝1∶1∶1)、 正丁醇(浸膏A∶水∶正丁醇＝1∶1∶1)进行萃取，各萃取层萃取至萃取液 无色停止萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
步骤3：取浸膏B，过减压柱，经石油醚、乙酸乙酯(20∶1→0∶1，V/V)的混 合液梯度洗脱，最后用丙酮冲柱，每500mL收集一瓶，所得各个流分经过薄 层层析(TLC)点板检测，合并相似流分，获得16个流分，记为Fr.1～Fr.16；
步骤4：经高效液相色谱分析后，Fr.13特征峰比较明显，将其过反相柱， 以30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇水溶液梯度洗脱， 100mL收集一瓶，每个梯度用1.5L混合液，所得各个流分经过薄层层析(TLC) 点板检测，合并相似流分，得到14个流份，记为Fr.13-1～Fr.13-14；
步骤5：Fr.13-7呈点性较好，取其过葡聚糖凝胶柱，以500mL甲醇∶氯 仿＝1∶1的混合液进行洗脱，6mL收集一管，点板合并相似流分，得到18个 流份，记为Fr.13-7-1～Fr.13-7-18；
步骤6：Fr.13-7-15～Fr.13-7-17呈点相似，合并后经半制备HPLC(C18色 谱柱，35％甲醇-水洗脱)纯化，得到式I和II化合物(tR＝13.5min和tR＝16.4min)。
式I和式II所示结构化合物的鉴定图谱如图1～6所示。
式I和II所示结构鉴定数据如下：低分辨质谱m/z：352.4354[M+Na]+， 分子式为C18H19NO5；1H NMR(500MHz)和13C NMR(125MHz)数据如表1所 示：
表1式I和II所示化合物的NMR数据(溶剂为氘代甲醇)
Figure BDA0002407472360000091
式I和Ⅱ化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
待测样品溶液的配制：取450μL配置好的2U/ml的α-葡萄糖苷酶溶液(用 pH＝6.8的PBS溶液稀释)于EP管中，将待测化合物溶解于DMSO后(浓度 为2mM)，取45μL的该溶液加至EP管中，摇匀，分别取4次110μL混合 均匀的待测溶液于96孔板中；(阴性与空白：取450μL配置好的2U/ml的 α-葡萄糖苷酶溶液于EP管中，再取45μL的DMSO溶液加至EP管中，摇匀，分别取4次110μL混合均匀的待测溶液于96孔板中)
将96孔板于37℃放置15分钟后，各组均加入40μL(2.5mmol/L的4- 硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)PNPG溶液；(空白：加入40μL(0.1mol/L) PBS溶液)
将96孔板于37℃放置15分钟后，设置酶标仪于405nm波长下测量每 孔的OD值吸光度.
计算化合物对α-糖苷酶的抑制活性，计算公式如下：
抑制率＝(ODDMso-OD样)/(ODDMSO-ODPBS)×100％
将化合物倍半稀释几个梯度后，以相同的检测方法检测不同浓度样品对 α-葡萄糖苷酶的抑制率，利用GraphPad Prism 7软件计算其IC50值。
结果如表2所示，化合物对α-葡萄糖苷酶有一定程度的抑制活性且好于 阳性对照阿卡波糖。
表2化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
测试样品 IC<sub>50</sub>±SD(μM)
金雀异黄酮(阳性对照) 8.54±0.69
阿卡波糖(阳性对照) 701.45±0.52
化合物I 22.98±1.46
化合物II 46.42±1.12
式I和Ⅱ化合物抗炎活性评价
选取RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)，在96孔平底细胞培 养板上接种100μL浓度为5×104个/mL的细胞，培养于37℃，5％CO2，90％ 以上湿度的条件下，24h后加入50μL配制好的待测化合物溶液，继续在该条 件下培养，1h后加入50μL配制的LPS(终浓度500ng/mL)溶液，24h后每 孔取上清100μL于新的96孔板中，之后向每孔加入100μL(40mg/mL)的 Griess试剂，十字交叉法混匀。于酶标仪540nm波长下测定并记录每孔的吸 光度，按下面公式计算NO抑制率。对照组为吲哚美辛，阴性对照组为DMSO， 把待测化合物倍半稀释5个浓度梯度。用横坐标表示待测化合物浓度，纵坐 标表示抑制率，作图求出待测化合物的IC50值。
抑制率(％)＝(C2-C1)/(C2-C0)×100％；
式中：C0、C1、C2分别为540nm下测得的空白对照组(不加LPS)、实验 组、阴性(加LPS)对照组的吸光值。计算各浓度下的抑制率并绘制化合物 浓度-抑制率曲线图，计算得到化合物对LPS诱导RAW264.7产生NO的半 抑制浓度(IC50值)。结果如表3所示，化合物能有效抑制RAW264.7细胞NO 的产生量，表现出一定的抗炎活性且效果显著好于阳性对照吲哚美辛。
表3化合物对RAW264.7产生NO的抑制作用
测试样品 IC<sub>50</sub>±SD(μM)
吲哚美辛(阳性对照) 52.30±2.11
化合物I 11.07±0.61
化合物II 10.43±1.17
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种从金钗石斛中提取化合物的工艺，包括以下步骤：
A)将金钗石斛粉碎，用1～3倍体积的乙醇水溶液浸提2～5次，所得浸提液过滤后合并浓缩，得到浸膏A；
B)将所述浸膏A与水制备成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，筛选三种萃取液后，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
C)取浸膏B，过减压柱，经石油醚和乙酸乙酯混合洗液梯度洗脱，然后用丙酮冲柱，收集流分，将所得各个流分浓缩合并，最终获得16个流分，记为Fr.1～Fr.16；
D)将流分Fr.13过反相柱，以质量浓度30～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到14个流分，记为Fr.13-1～Fr.13-14；
E)取流分Fr.13-7过葡聚糖凝胶柱，以甲醇和氯仿的混合液进行洗脱，得到18个流分，记为Fr.13-7-1～Fr.13-7-18，合并Fr.13-7-15～Fr.13-7-17流分，经半制备HPLC纯化，在tR＝13.5min得到式I所示化合物，在tR＝16.4min得到式II所示化合物；
Figure FDA0002990188520000011
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤B)中浸膏A与水的体积比为1：(0.5～2)；
所述浸膏A与石油醚的体积比为1：(0.5～2)；所述浸膏A与乙酸乙酯的体积比为1：(0.5～2)；所述浸膏A与正丁醇的体积比为1：(0.5～2)。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤C)中石油醚和乙酸乙酯混合洗液的梯度洗脱具体为：石油醚和乙酸乙酯的体积比在80～120小时内由20：1均匀降至0:1。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤C)将得到的各个流分减压浓缩，经过薄层层析点板检测，根据显色合并相似流分。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤D)中梯度洗脱具体为：依次以质量浓度30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的甲醇水溶液进行洗脱，每个洗脱梯度的洗脱时间相等，洗脱总时间为24～48小时。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤E)中甲醇与氯仿的体积比为1：(0.5～2)。
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