CN114292302B - 一种从黄皮叶子中提取的化合物及其制备工艺和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从黄皮叶子中提取的化合物，所述化合物的结构式如下(式I)和/或(式II)所示：该化合物具有预防和/或治疗高血糖效果。和公开了上述化合物的制备方法以及该化合物在制备具有预防和/或治疗高血糖效果的药物制剂方面的应用。本发明从黄皮叶子中提取的化合物来源于药食同源植物黄皮叶子中的活性成分，是机体友好型的抗高血糖活性药物；本发明从黄皮叶子中提取的化合物对α‑葡萄糖苷酶均有一定程度的抑制活性、对高血糖模型小鼠具有明显的降血糖作用且小鼠无明显的毒副作用，能够作为药物先导。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种从黄皮叶子中提取的化合物及其制备工艺和应用。
背景技术
正常人群的空腹(8h)血糖值范围为4.0-6.1mmol/L，超过这一范围或者就餐后2h血糖值高于7.8mmol/L均被称为高血糖，长期处于高血糖会进一步发展成为糖尿病。随着国民生活水平的不断提高，被称为“三高”之一的高血糖在人群中的比例不断升高。2013年科学调查，我国约有6亿人处于高血糖，更为严重的是国际糖尿病联盟刚刚发布了最新一版《全球糖尿病概览》，概览中指出，截止到2019年，在20岁到79岁的人群中，共有约4.63亿糖尿病患者，其中中国糖尿病患者数排名第一，总人数约为1.164亿人。糖尿病最主要的特征是长期的慢性高血糖症，长期的高血糖会使全身各个组织器官发生病变，导致急慢性并发症的发生。如胰腺功能衰竭、失水、电解质紊乱、营养缺乏、抵抗力下降、肾功能受损、神经病变、眼底病变等。目前对造成高血糖的原因产生归咎于遗传因素(如糖尿病家族史)与环境因素(如不合理的膳食、肥胖等)的共同作用，两大调节功能发生紊乱，血糖持续升高，但对深入的发病分子机制并不明确，因此探寻新型的抗高血糖药物制剂具有重要意义。
黄皮(Clausenalansium(Lour.)Skeels)是药食同源植物，其果实是南方的重要果品，富含糖类、维C、果胶及有机酸，叶和根含黄酮甙、生物碱、香豆素及酚类等化合物。黄皮叶性味：辛；苦；平。功能主治：解表散热；行气化痰；利尿；解毒。主温病发热；流脑；疟疾；咳嗽痰喘；脘腹疼痛；风湿痹痛；黄肿；小便不利；热毒疥癣；蛇虫咬伤。
现有的降糖药长期服用，大多会对机体产生一定的危害，如长期服用磺酰脲类降糖药，可能会导致患者出现食欲下降、转氨酶升高，诱发肝炎、黄疸、低钠血症等疾病；如长期服用双胍类药物，可能会出现乳酸性中毒，还可能会造成恶心呕吐、腹痛、腹泻等消化道反应以及尿蛋白持续阳性、尿素氮等代谢废物堆积等；若是服用α-糖苷酶抑制剂等药物，可能会出现胃痉挛、乏力、眩晕、皮肤瘙痒等不良症状。探寻药食同源的中草药提取物中的活性成分，为开发机体友好型的抗高血糖活性药物提供基础。
目前，对从黄皮叶子中提取的化合物及其在制备具有预防和/或治疗高血糖效果的药物方面的应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从黄皮叶子中提取的化合物，该化合物具有预防和/或治疗高血糖效果。
本发明的目的还在于提供上述从黄皮叶子中提取的化合物的制备方法。
本发明的最后一个目的在于提供上述从黄皮叶子中提取的化合物在制备具有预防和/或治疗高血糖效果的药物制剂方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种从黄皮叶子中提取的化合物，所述化合物的结构式如下(式I)和/或(式II)所示：
优选的，(式I)所示化合物双键为Z型，氮甲基取代；(式II)所示化合物双键为E型，氮无取代，具体如下：
(式I)所示化合物，化学名称为顺式-N-甲基-N-(2-O-葡萄糖基)苯乙基肉桂酰胺((Z)-N-(2-O-glucoside-2-phenylethyl)-N-methyl-3-phenylacrylamide)，分子式为(C24H29NO7)。
(式II)所示化合物，其化学名称为反式-N-(2-O-葡萄糖基)苯乙基肉桂酰胺((E)-N-(2-O-glucoside-2-phenylethyl)-3-phenylacrylamide)，分子式为(C23H27NO7)。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
(S1)将黄皮叶干燥粉碎，用乙醇溶液浸提多次，所得浸提液过滤后合并浓缩得浸膏A；
(S2)将浸膏A加水制成混悬液，并依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，选取乙酸乙酯萃取液，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
(S3)取浸膏B，过减压柱，依次经石油醚-乙酸乙酯混合溶液以及氯仿-甲醇混合溶液梯度洗脱，合并得到20个流份，记为Fr.1～Fr.20；
(S4)将流份Fr.16过反相柱，以体积百分含量分别为10％～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到15个流份，记为Fr.16.1～Fr.16.15；
(S5)取流份Fr.16.10过凝胶柱色谱，用甲醇进行洗脱，得到11个流份，记为Fr.16.10.1～Fr.16.10.11；
(S6)将流份Fr.16.10.4经半制备高效液相色谱分离，用甲醇水溶液进行洗脱，得到上述(式I)所示化合物和(式II)所示化合物。
在上述化合物的制备方法中：
优选的，步骤(S1)中所述乙醇溶液的体积百分含量为95～99.5％，其与所述黄皮叶的用量关系为1～3L：1kg，浸提次数为2～5次。
优选的，步骤(S2)中所述浸膏A与水的体积比为1：(0.5～2)，所述浸膏A与石油醚的体积比为1：(0.5～2)；所述浸膏A与乙酸乙酯的体积比为1：(0.5～2)；所述浸膏A与正丁醇的体积比为1：(0.5～2)。
优选的，步骤(S3)中石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱包括：将石油醚和乙酸乙酯的体积比在80～120小时内由100：1均匀降至0：1，浓度梯度分别为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1；氯仿-甲醇混合溶液梯度洗脱包括：将氯仿和甲醇的体积比在80～120小时由100：1均匀将至0：1，浓度梯度分别为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，总共获得28个流份。
进一步的，步骤(S3)将得到的28个流份减压浓缩，经过薄层层析点板检测，根据显色合并相似流份最终得到20个流份。
优选的，步骤(S4)中所述反相柱是C18材料填充的柱子。
优选的，步骤(S4)中以体积百分含量为10％～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱包括：依次以体积百分含量为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的甲醇水溶液进行洗脱，每个洗脱梯度的洗脱时间相等，洗脱总时间为36～60小时。
由于同一个浓度的甲醇水冲洗下来的成分会不同，因此最终获得15个流份。
优选的，步骤(S5)中所述凝胶柱色谱是Sephadex LH-20材料填充的柱子。
优选的，步骤(S5)中用甲醇进行洗脱包括：取流份Fr.16.10过凝胶柱色谱，用甲醇进行洗脱，得到11个流份，记为Fr.16.10.1～Fr.16.10.11。
由于化合物分子量大小不同，从柱子上先后洗脱下来的化合物不同，总共获得11个流份。
优选的，步骤(S6)中所述半制备高效液相色谱是安捷伦公司1260型号的仪器。
优选的，步骤(S6)中以体积百分含量为40％的甲醇水溶液进行洗脱，在保留时间tR＝12.3min得到氮取代量为甲基，双键为Z型(式I)所示的化合物，在保留时间tR＝21.1min得到氮取代量为氢，双键为E型的(式II)所示的化合物。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的从黄皮叶子中提取的化合物在制备具有预防和/或治疗高血糖效果的药物制剂方面的应用。
优选的，所述具有预防和/或治疗高血糖效果包括由于机体胰岛素缺少或者合成障碍造成的血糖含量升高、尿糖含量升高或长期高血糖进而引起机体多组织器官发生病变而导致的急慢性并发症的发生的预防和/或治疗效果。
本发明还提供了一种药物制剂，包括上述的化合物以及药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明从黄皮叶子中提取的化合物来源于药食同源植物黄皮叶子中的活性成分，是机体友好型的抗高血糖活性药物；
(2)本发明从黄皮叶子中提取的化合物可以对α-葡萄糖苷酶均有一定程度的抑制活性、对高血糖模型小鼠具有明显的降血糖作用且小鼠无明显的毒副作用，能够作为药物先导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中式I所示化合物的1H-NMR图谱；
图2是本发明实施例1中式I所示化合物的13C-NMR图谱；
图3是本发明实施例1中式Ⅱ所示化合物的1H-NMR图谱；
图4是本发明实施例1中式Ⅱ所示化合物的13C-NMR图谱；
图5是本发明实施例3中化合物毒性研究小鼠血清的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性测定结果；
图6是本发明实施例4中化合物给药高血糖模型小鼠相对血糖分数测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种从黄皮叶子中提取化合物的工艺，其提取包括以下步骤：
(S1)将黄皮叶干燥粉碎，用体积百分含量不低于95％的乙醇水溶液浸提2～5次，所得浸提液过滤后合并浓缩得浸膏A；
(S2)将所述浸膏A加水制备成混悬液，以此用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，筛选三种萃取液后，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
(S3)取浸膏B，过减压柱，经石油醚、乙酸乙酯混合洗液以及氯仿、甲醇梯度洗脱，合并得到20个流份，记为Fr.1～Fr.20；
(S4)将流份Fr.16过反相柱，以10％～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到15个流份，记为Fr.16.1～Fr.16.15；
(S5)取流份Fr.16.10过凝胶柱色谱，用甲醇进行洗脱，得到11个流份，记为Fr.16.10.1～Fr.16.10.11；
(S6)将流份Fr.16.10.4经半制备高效液相色谱色谱分离，以甲醇水溶液进行洗脱，在tR＝12.3min得到式1所示化合物，在tR＝21.1min得到式II所示化合物。
黄皮(Clausenalansium(Lour.)Skeels)芸香科，又名黄弹，黄弹子，黄段，是药食同源植物，其果实是南方的重要果品，果皮和果核可以入药。在我国的南方广东、广西和海南均有分布。在本发明中，优选黄皮经干燥的叶子为原料进行分离提取。
本发明将经过干燥的黄皮叶子进行粉碎，用体积百分含量不低于95％的乙醇水溶液(其中乙醇水溶液与黄皮叶子的用量关系为1～3L：1kg)浸提2～5次，所得浸提液过滤后合并浓缩得浸膏A。
在本发明中，所述黄皮叶子的粉碎粒径优选为0.01～0.5cm，更优选为0.2～0.3cm。
所述乙醇水溶液中乙醇与水的体积比优选为(99～85)∶1，更优选为(99～95)∶1。
所述浸提液浓缩的浓缩比优选为(3～5)∶1，更优选为4∶1。浓缩比是指浓缩前的体积和浓缩后的体积的比例。
得到浸膏A后，本发明将所述浸膏A加水制备成混悬液，然后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取层萃取至萃取液无色停止萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B。
石油醚、乙酸乙酯和正丁醇极性依次增大，具体实验时选择乙酸乙酯萃取液。
在本发明中，所述浸膏A与水的体积比优选为1：(0.5～2)，更优选为1：(1～1.5)；所述浸膏A与石油醚的体积比为1：(0.5～2)，更优选为1：(1～1.5)；具体的，在本发明的实施例中，浸膏A：水：石油醚的体积比＝1：1：1；所述浸膏A与乙酸乙酯的体积比为1：(0.5～2)，更优选为1：(1～1.5)；具体的，在本发明的实施例中，浸膏A：水：乙酸乙酯的体积比＝1：1：1；所述浸膏A与正丁醇的体积比为1：(0.5～2)，更优选为1：(1～1.5)；具体的，在本发明的实施例中，浸膏A：水：正丁醇的体积比＝1：1：1。
依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，因为三种溶剂的极性大小不一样，通过这种方法将浸膏A的成分分成3个不同极性的大流份，后面接着的实验用的是乙酸乙酯的萃取液。
在本发明中，所述乙酸乙酯萃取液的浓缩比优选为(2～5):1，更优选为(3～4):1。
得到浸膏B后，本发明将浸膏B过减压柱，经石油醚-乙酸乙酯混合洗液以及氯仿-甲醇混合洗液梯度洗脱，收集流份，将所得各个流份浓缩合并，通过薄层色谱检测，最终获得20个流份，记为Fr.1～Fr.20。
在本发明中，所述减压柱优选为硅胶柱层析，所述硅胶柱优选为硅胶H。
所述石油醚-乙酸乙酯混合溶液中石油醚与乙酸乙酯的体积比为(100～0)：1，所述氯仿-甲醇的混合溶液中氯仿与甲醇的体积比为(100～0)：1。
具体的，在本发明的实施例中，所述梯度洗脱的具体过程为：
石油醚与乙酸乙酯的混合溶液的体积比初始为100:1，随着梯度洗脱的进行体积比均匀减小(浓度梯度分别为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1)，直至降为0:1，所述梯度洗脱的总时间优选为80～120小时，更优选为90～110小时，最优选为100小时；所述梯度洗脱的温度优选为室温，即20～35℃，优选为25～30℃，每个梯度所用洗脱液的体积优选为4～5升。
氯仿与甲醇的混合溶液的体积比初始为100：1，随着梯度洗脱的进行体积比均匀减小(浓度梯度分别为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1)，直至降为0:1，所述梯度洗脱的总时间优选为80～120小时，更优选为90～110小时，最优选为100小时；所述梯度洗脱的温度优选为室温，即20～35℃，优选为25～30℃，每个梯度所用洗脱液的体积优选为4～5升。
洗脱完成后，收集流份，优选的，每500mL收集一次，将所得各个流份经过薄层层析(TLC)点板检测，合并相似流份，最终获得20个流份，记为Fr.1～Fr.20。
在本发明中，得到的各个流份经过薄层层析(TLC)点板检测，浓硫酸-乙醇溶液显色，肉眼观察，主点相同或者类似的合并到一起，最后共获得20个流份。
经薄层层析分析后，Fr.16的点板呈点性比较明显，将其过反相柱(填料为C18)，依次以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇水溶液梯度洗脱，100mL收集一次，每个梯度用2L混合液，所得各个流份经过薄层层析(TLC)点板检测，肉眼观察，主点相同或者类似的合并到一起，得到15个流份，记为Fr.16.1～Fr.16.15。
在本发明中，所述梯度洗脱中，每个梯度的洗脱时间相等，所述洗脱的总时间优选为36～60小时，更优选为46～50小时。
取流份Fr.16.10过葡聚糖Sephadex LH-20凝胶柱，以甲醇进行洗脱，室温条件下，2～3秒一滴，每5mL收集一管，所得各个流份减压浓缩，经过薄层层析(TLC)点板检测，合并相似流份，得到11个流份，记为Fr.16.10.1～Fr.16.10.11。
Fr.16.10.4呈点明显，经半制备HPLC(C18色谱柱，40％甲醇-水洗脱)分离，得到式I所示化合物(tR＝12.3min)和式II化合物(tR＝21.1min)。
本发明还提供一种上文所述的工艺提取得到的式I所述化合物和式II所示化合物在制备预防和/或治疗高血糖的应用。优选的，式I所和式II所示化合物作为抑制剂，参与调控α-葡萄糖苷酶活性，从而干涉机体的糖代谢途径，有效的调控水解葡萄糖苷键的速率，控制释放出葡萄糖，达到预防和/或治疗高血糖的应用。
优选的，所述的化合物预防和/或防治由于机体胰岛素缺少或者合成障碍造成的血糖含量升高，尿糖含量升高等，防止长期高血糖进而引起机体多组织器官发生病变，导致急慢性并发症的发生。
本发明进一步还提供了一种药物制剂，包括上文所述的工艺提取得到的式I所示化合物或式II所示化合物以及药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
更优选的，所选片剂为口含片剂或者吞服片剂，更优选的口含片剂有舌下片、口含片、分散片，更优选的吞服片剂有包衣片、普通压制片、多层片、咀嚼片、泡腾片及缓控释片可以延长药物作用时间或者控制药物作用速度。本发明将结合片剂开展实施案例。
优选的，药用辅料起到赋形、充当载体、提高稳定性，同时还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，所选的类型包括溶剂、助溶剂、乳化剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、整合剂、pH值调节剂、增塑剂、包合剂、吸收剂、稀释剂、释放阻滞剂等一种或几种的混合物。
因此，本发明提供了一种从黄皮叶子中提取化合物的工艺，其提取包括以下步骤：
S1)将黄皮叶干燥粉碎，用1～3倍体积的且体积分数不低于95％的乙醇水溶液浸提2～5次，所得浸提液过滤后合并浓缩得浸膏A；
S2)将所述浸膏A加水制备成混悬液，以此用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，筛选三种萃取液后，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
S3)取浸膏B，过减压柱，经石油醚、乙酸乙酯混合洗液以及氯仿、甲醇梯度洗脱，得到20个流份，记为Fr.1～Fr.20；
S4)将流份Fr.16过反相柱，以10％～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到15个流份，记为Fr.16.1～Fr.16.15；
S5)取流份Fr.16.10过凝胶柱色谱，用甲醇进行洗脱，得到11个流份，记为Fr.16.10.1～Fr.16.10.11；S6)将流份Fr.16.10.4经半制备高效液相色谱分离，以甲醇水进行洗脱，在tR＝12.3min得到式1所示化合物，在tR＝21.1min得到式II所示化合物。
本发明提取得到的式I所述化合物和式II所示化合物在制备预防和/或治疗高血糖的应用。用于由机体胰岛素缺少或者合成障碍造成的血糖含量升高，尿糖含量升高等，防止长期高血糖进而引起机体多组织器官发生病变，导致急慢性并发症的发生。本发明的化合物来源于药食同源植物的活性成分，是机体友好型的抗高血糖活性药物。
为了进一步说明本发明一种从黄皮叶提取物及其两种新化合物抗高血糖的作用，将结合具体的实施案例进行详细描述。本发明中所用到的黄皮叶及提取用到的试剂原料均可以从市场买到。
实施例1黄皮叶中化合物的分离提取
(S1)选用干燥处理的黄皮叶15Kg粉碎，用30L体积百分含量为95％的乙醇水溶液浸提3次，所得浸提液过滤后合并浓缩得浸膏A；
所述浸提液浓缩的浓缩比为4∶1，浓缩比是指浓缩前的体积和浓缩后的体积的比例，下同。
(S2)将所述浸膏A加水制备成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
浸膏A与水的体积比为1：1；浸膏A与石油醚的体积比为1：1；所述浸膏A与乙酸乙酯的体积比为1：1，浸膏A与正丁醇的体积比为1：1。
依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，因为三种溶剂的极性大小不一样，通过这种方法将浸膏A的成分分成3个不同极性的大流份，后面接着的实验用的是乙酸乙酯的萃取液。
乙酸乙酯萃取液的浓缩比为4:1。
(S3)取浸膏B，过减压柱，经石油醚-乙酸乙酯混合溶液以及氯仿-甲醇混合溶液梯度洗脱，合并得到20个流份，记为Fr.1～Fr.20；
具体为：
石油醚与乙酸乙酯混合溶液的体积比初始为100:1，随着梯度洗脱的进行体积比均匀减小，直至降为0:1，浓度梯度分别为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，梯度洗脱的总时间为100小时，梯度洗脱的温度为室温，每个梯度所用洗脱液的体积为4升。
氯仿与甲醇的混合溶液的体积比初始为100：1，随着梯度洗脱的进行体积比均匀减小，直至降为0:1，浓度梯度分别为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，梯度洗脱的总时间为100小时，梯度洗脱的温度为室温，每个梯度所用洗脱液的体积为4升。
洗脱完成后，收集流份，每500mL收集一次，将所得各个流份经过薄层层析(TLC)点板检测，合并相似流份，最终获得20个流份，记为Fr.1～Fr.20。
在本发明中，得到的各个流份经过薄层层析(TLC)点板检测，浓硫酸-乙醇溶液显色，肉眼观察，主点相同或者类似的合并到一起，最后共获得20个流份。
(S4)将流份Fr.16过反相柱，以10％～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到15个流份，记为Fr.16.1～Fr.16.15；
经薄层层析分析后，Fr.16的点板呈点性比较明显，将其过反相柱(填料为C18)，依次以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇水溶液梯度洗脱，100mL收集一次，每个梯度用2L混合液，所得各个流份经过薄层层析(TLC)点板检测，肉眼观察，主点相同或者类似的合并到一起，得到15个流份，记为Fr.16.1～Fr.16.15。
梯度洗脱中，每个梯度的洗脱时间相等，洗脱的总时间为48小时。
(S5)取流份Fr.16.10过凝胶柱色谱，用甲醇进行洗脱，得到11个流份，记为Fr.16.10.1～Fr.16.10.11；
取流份Fr.16.10过葡聚糖Sephadex LH-20凝胶柱，以甲醇进行洗脱，室温条件下，2～3秒一滴，每5mL收集一管，所得各个流份减压浓缩，经过薄层层析(TLC)点板检测，合并相似流份，得到11个流份，记为Fr.16.10.1～Fr.16.10.11。
(S6)将流份Fr.16.10.4经半制备高效液相色谱分离，以体积百分含量为40％的甲醇水溶液进行洗脱，在tR＝12.3min得到式1所示化合物，在tR＝21.1min得到式II所示化合物。
Fr.16.10.4呈点明显，经半制备HPLC(C18色谱柱，40％甲醇-水洗脱)分离，得到式I所示化合物(tR＝12.3min)和式II化合物(tR＝21.1min)。
式I和式II所示结构化合物的鉴定图谱如图1～4所示。
式I和II所示结构鉴定数据如下：
式I：高分辨质谱m/z:443.1948[M+Na]+，分子式为C24H29NO7；1H-NMR(500MHz)和13C-NMR(125MHz)数据如表1所示；
式II：高分辨质谱m/z:452.1638[M+H]+，分子式为C23H27NO7；1H-NMR(500MHz)和13C-NMR(125MHz)数据如表1所示。
表1式I和式II所示化合物的1H和13CNMR数据(溶剂为氘代甲醇)
实施例2制备含有本发明化合物的片剂
按下述重量称取各原料(单位：g)：
将黄皮叶子通过实施例1中制备的两种主要化合物(Z)-N-(2-O-glucoside-2-phenylethyl)-N-methyl-3-phenylacrylamide和(E)-N-(2-O-gl ucoside-2-phenylethyl)-3-phenylacrylamide各50g。
将两种化合物各50g加入乙醇100mL，过滤，加入羧甲淀粉钠，充分混匀，分别喷雾干燥制成颗粒，送至压片机压片即得。
实施例3式I和Ⅱ化合物对a-葡萄糖苷酶的抑制作用研究
α-葡萄糖苷酶购自索莱宝生物科技有限公司，式I和Ⅱ化合物对a-葡萄糖苷酶的抑制作用
测试样品预混液的配制：取540μL配置好的2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液(用pH＝5.0的PBS溶液稀释)于1.5mL离心管中，取待测化合物溶解于DMSO后(浓度为2mM)，取54μL的溶解液加入离心管中，充分混匀，取120μL的混合液于96孔板中，并设置4个重复处理；(空白组与阴性组：取540μL配置好的2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液于1.5mL离心管中，另取54μL的DMSO溶液加至离心管中，充分混匀，取120μL的混合液于96孔板中，并设置4个重复处理)
将96孔板于恒温箱中50℃条件下静置10分钟，将各组均加入45μL(2.5mmol/L的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)PNPG溶液；(空白：加入45μL(0.1mol/L)PBS溶液)
将96孔板于恒温箱中50℃条件下静置10分钟后，设置酶标仪于405nm波长下测量每孔的OD值吸光度.
计算化合物对α-糖苷酶的抑制活性，计算公式如下：
抑制率＝(ODDMso-OD样)/(ODDMSO-ODPBS)×100％
将化合物倍半稀释几个梯度后，以相同的检测方法检测不同浓度样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率，利用Graph Pad Prism 7软件计算其IC50值。
表2两种化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
结果如表2所示，两种化合物对α-葡萄糖苷酶均有一定程度的抑制活性且抑制效果优于阳性对照阿卡波糖。
实施例4本发明所述化合物毒性研究
选取健康状况的昆明种小鼠40，随机分成4个剂量组，给与本发明的药物(实施例2所制备的化合物片剂)，分别按照0、1、2、5g/Kg的剂量对小鼠进行灌胃处理，每天1次，连续给药14天。实验结束后，对各试验组小鼠进行静脉取血，血样4℃冰箱静止3-4h，3000r/min冷却离心15min，制备小鼠的血清样品，用于测定血清的理化指标(选取测定血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶)。准确称量每只小鼠的体重，然后处死各组试验小鼠，解剖后观察查各组小鼠的肝、脾、肾脏、心脏、脑、肺、大肠、小肠、胃等组织器官，进行病理学检查并对小鼠的各组织器官称重记录数据。器官指数＝器官重量/小鼠重量。
表3灌胃本发明药物小鼠14天的器官指数
| 器官 | 0g/Kg | 1g/Kg | 2g/Kg | 5g/Kg |
| 心 | 4.67±0.13 | 4.45±0.24 | 4.72±0.16 | 4.54±0.02 |
| 肝 | 29.32±0.25 | 28.88±0.33 | 30.01±0.07 | 29.77±0.21 |
| 脾 | 2.23±0.08 | 2.21±0.13 | 2.34±0.11 | 2.19±0.04 |
| 胃 | 7.01±0.23 | 6.92±0.17 | 7.11±0.13 | 6.98±0.22 |
| 肾 | 11.82±0.43 | 11.88±0.17 | 12.02±0.51 | 11.90±0.13 |
| 肺 | 5.03±0.12 | 4.89±0.10 | 4.94±0.25 | 5.07±0.17 |
| 脑 | 8.88±0.32 | 8.74±0.18 | 8.93±0.27 | 8.97±0.19 |
| 肠 | 37.65±1.02 | 38.44±0.88 | 38.78±0.79 | 37.92±0.47 |
结果如表3所示，灌胃本发明药物小鼠14天的各器官指数大小均未出现显著差异(P>0.05)，且经过病理学检查，灌胃组小鼠的心、肝、脾、胃、肾、肺、脑、大小肠与对照组相比均没有显现出中毒迹象，说明本发明中的化合物和提取物是安全没有毒性的，能够作为药物先导。
结果如图5所示，灌胃组小鼠的谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)在血清中的酶活性与对照组小鼠相比，未出现显著差异(P>0.05)，说明本发明中的化合物和提取物是无明显的毒副作用，能够作为药物先导。
实施例5本发明所述化合物对高血糖小鼠模型的影响
购买2龄昆明种高血糖模型小鼠50只，由海南启源生物科技有限公司购买，随机分成5组，每组10只小鼠，分为高、中、低剂量组，依次为给本发明药(实施例2所制备的化合物片剂)500、300、100mg/Kg，阿卡波糖组100mg/Kg，生理盐水组。在相同的条件下饲养各组小鼠，观察小鼠的健康状况，并进行记录。在给药后的0、0.5、1、2、3、4、5、6h用血糖仪测定血糖值。计算不同时间的小鼠的血糖值分数。
血糖值分数(m)＝给药t小时的血糖值/给药0小时的血糖值*100％
设定给药0小时的血糖质量分数为100％。
结果如图6所示，给与高血糖模型小鼠高(150mg/Kg)、中(100mg/Kg)、低(150mg/Kg)本发明药物在0.5-3h都能够降低小鼠的血糖值，其中低剂量组降血糖能力较差，中、高剂量组降血糖效果相当明显，于阳性对照阿卡波糖降血糖能力相当。用药3h达到降血糖的最低值，6h回到用药前水平，说明本发明中的化合物和提取物具有良好的降血糖作用，可以作为降血糖药物先导。
以上所述是本发明较优的实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在本发明原理的前提下，对本发明进行优化、改进、组合、替代等应视为本发明的保护范围以内。
Claims (6)
1.一种从黄皮叶子中提取的化合物的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(S1)将黄皮叶干燥粉碎，用乙醇溶液浸提多次，所得浸提液过滤后合并浓缩得浸膏A；
(S2)将浸膏A加水制成混悬液，并依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，选取乙酸乙酯萃取液，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
(S3)取浸膏B，过减压柱，依次经石油醚-乙酸乙酯混合溶液以及氯仿-甲醇混合溶液梯度洗脱，合并得到20个流份，记为Fr.1～Fr.20；
(S4)将流份Fr.16过反相柱，以体积百分含量分别为10％～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，得到15个流份，记为Fr.16.1～Fr.16.15；
(S5)取流份Fr.16.10过凝胶柱色谱，用甲醇进行洗脱，得到11个流份，记为Fr.16.10.1～Fr.16.10.11；
(S6)将流份Fr.16.10.4经半制备高效液相色谱分离，用甲醇水溶液进行洗脱，得到(式II)所示化合物；
(式II)所示化合物如下：
2.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是：步骤(S1)中所述乙醇溶液的体积百分含量为95～99.5％，其与所述黄皮叶的用量关系为1～3L：1kg，浸提次数为2～5次。
3.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是：步骤(S2)中所述浸膏A与水的体积比为1：(0.5～2)，所述浸膏A与石油醚的体积比为1：(0.5～2)；所述浸膏A与乙酸乙酯的体积比为1：(0.5～2)；所述浸膏A与正丁醇的体积比为1：(0.5～2)。
4.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是：步骤(S3)中石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱包括：将石油醚和乙酸乙酯的体积比在80～120小时内由100：1均匀降至0：1，浓度梯度分别为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1；氯仿-甲醇混合溶液梯度洗脱包括：将氯仿和甲醇的体积比在80～120小时由100：1均匀将至0：1，浓度梯度分别为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，总共获得28个流份；步骤(S3)将得到的28个流份减压浓缩，经过薄层层析点板检测，根据显色合并相似流份最终得到20个流份。
5.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是：步骤(S4)中以体积百分含量分别为10％～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱包括：依次以体积百分含量为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的甲醇水溶液进行洗脱，每个洗脱梯度的洗脱时间相等，洗脱总时间为36～60小时。
6.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是：步骤(S6)中用体积百分含量为40％的甲醇水溶液进行洗脱，在保留时间tR＝21.1min得到(式II)所示的化合物。
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| A new amide and a new monoterpene from the seeds of Clausena lansium;Guo-Cai Wang等;《Natural Product Research》;第1–5页 * |
| Discovery of Flazin, an Alkaloid Isolated from Cherry Tomato Juice, As a Novel Non-Enzymatic Protein Glycation Inhibitor via in Vitro and in Silico Studies;Seong, Su Hui等;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;第69卷(第12期);第3647-3657 页 * |
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| GR01 | Patent grant | ||
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