CN111714492B - 一种杂萜类天然药物hypemonone A在制备抗糖尿病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从中国黄花香(Hypericum beanii L.)中首次提取分离得到的杂萜类化合物Hypemonone A，其制备方法及其用途。生物活性测试显示：该化合物在葡萄糖消耗实验中表现良好活性，从而它可用于制备抗糖尿病药物。

Description

一种杂萜类天然药物hypemonone A在制备抗糖尿病药物中的 应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域。涉及从中国黄花香(Hypericum beanii L.)地上部分提取分离得到的具有抗糖尿病活性的杂萜类天然药物Hypemonone A及其制备方法和在抗糖尿病活性治疗中的应用。

背景技术

黄花香为藤黄科金丝桃属植物，别名：栽秧花，过路黄。分布于我国贵州，云南等地。黄花香味苦、性寒；具有具有清热利湿，解毒散瘀之功效。用于治疗湿热黄疸，泄泻，痢疾，跌打损伤，筋骨疼痛等。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了从黄花香中首次提取分离得到的杂萜类化合物Hypemonone A及其药学上可接受的盐制备抗糖尿病药物中的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了杂萜类化合物Hypemonone A及其药学上可接受的盐制备抗糖尿病药物中的应用，其化合物结构如下：

所述杂萜类化合物Hypemonone A的制备方法，它是从黄花香地上部分中分离得到的，具体步骤如下：

提取：将粉碎的黄花香地上部分用乙醇提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏；将该粗浸膏溶于水，混悬均匀后用石油醚萃取，所得萃取液浓缩后得到石油醚浸膏。

分离：将所述石油醚浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到12个组分Fr.1～12；其中组分Fr.3即石油醚/乙酸乙酯体积比20：1洗脱部分进一步进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮体积比4：1等度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到6个组分A、B、C、D、E、F。组分E进一步硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，石油醚/乙酸乙酯体积比9：1洗脱部分E2经制备型HPLC，以甲醇/水体积比75：25洗脱，得到本发明化合物Hypemonone A。

在上述制备方法中，在提取步骤中，采用的乙醇为95％乙醇。

在上述制备方法中，在提取步骤中，所述提取采用的方法为加热回流提取。

在上述制备方法中，在分离步骤中，第一次石油醚/乙酸乙酯的梯度洗脱的浓度依次为体积比1：0，20：1，9：1，4：1，1：1，0：1。

在上述制备方法中，在分离步骤中，第二次石油醚/乙酸乙酯的梯度洗脱的浓度依次为体积比1：0，9：1，4：1，2：1，0：1。

在上述制备方法中，在分离步骤中，所述制备型HPLC的色谱柱填料为反相十八烷基键合硅胶。

本发明技术方案的第二方面是提供了一种药物组合物制备抗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的的杂萜类化合物及药学上可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助溶剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助溶剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助溶剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助溶剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-5mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

本发明采用单体化合物对葡萄糖消耗实验的方法。实验证实Hypemonone A具有较好的降糖效果。因此，本发明的Hypemonone A可用作制备抗糖尿病类药物。

附图说明

图1：Hypemonone A对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。Veh：正常对照；Ins：胰岛素。

图2：Hypemonone A对HepG2细胞活力的影响。Veh：正常对照；Ins：胰岛素。

具体实施方式

实施例中所指的Hypemonone A的化学结构式(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)如下所示：

实施例1所述Hypemonone A的制备

提取：将干燥的黄花香(Hypericum beanii)地上部分30.0kg,粉碎后用95％乙醇(150L)加热(80℃)回流提取3次，所得提取液减压浓缩(37℃)后得粗浸膏(1990.3g)；将该粗浸膏(1990.3g)溶于水(2000mL)，混悬均匀后用石油醚(2000mL)萃取三次，所得萃取液减压浓缩(37℃)后得到石油醚浸膏(998.5g)。

分离：石油醚浸膏(998.5g)进行硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱。

石油醚/乙酸乙酯的梯度洗脱的浓度依次为体积比1：0，20：1，9：1，4：1，1：1，0：1，每个浓度洗脱液的体积为2500ml，每个浓度洗脱两个柱体积(2×2500ml)。

根据TLC显色(茴香醛显色剂)合并相似流份得到12个组分Fr.1～12；

其中组分Fr.3(55g)即石油醚/乙酸乙酯体积比20：1洗脱部分进一步进行硅胶(300-400目)柱层析，以石油醚/丙酮4：1体积比洗脱，洗脱液的体积为950ml，洗脱两个柱体积(2×950ml)。

根据TLC显色(茴香醛显色剂)合并相似流份得到6个组分A-F。

组分E(6.2g)进一步硅胶(300-400目)柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱。

石油醚/乙酸乙酯的梯度洗脱的浓度依次为体积比1：0，9：1，4：1，2：1，0：1，每个浓度洗脱液的体积为450ml，每个浓度洗脱两个柱体积(2×450ml)。

根据TLC显色(茴香醛显色剂)合并相似流份得到7个组分，石油醚/乙酸乙酯体积比9：1洗脱部分即组分E2.

经制备型HPLC【C₁₈柱(10μm，250×20mm)甲醇/水75：25体积比洗脱，流速6mL/min,254nm波长下检测保留时间为18.6min】，得到本发明化合物Hypemonone A(885mg)。

结构鉴定：按常规经NMR、HRESIMS、UV、IR及旋光等多种现代光谱技术，确定了化合物Hypemonone A的化学结构，其理化性质如下：

黄色针状，分子式为C₁₆H₁₄O₃；

紫外光谱UV(MeOH)λ_max(logε)250(4.12)，271(3.31)，320(2.23)nm；

红外光谱IR(KBr)ν_max：3096，1694、1547、1598、1423；

高分辨质谱HRESIMS m/z 254.2637[M+H]⁺(calculated for C₁₆H₁₄O₃,254.2641)；

核磁共振氢谱¹H NMR(500MHz)及核磁共振碳谱¹³C NMR(125MHz)数据见表一，

表一所述Hypemonone A的¹H和¹³C NMR(ppm in CDCl₃)

实施例2 Hypemonone A对细胞葡萄糖消耗的影响

实验样品

被测样品溶液的配置：测试样品为实施例1中制备的纯品化合物(Hypemonone A)。准确称取适量样品，使用DMSO配制成0.1M的储存溶液，供药理活性测试。

细胞株：人肝癌HepG2细胞。在含10％胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中生长，培养条件为37℃、5％CO₂，饱和湿度。用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA液消化传代。

实验方法

HepG2细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，第二天换低糖培养基加药，同时设阳性药物对照组(胰岛素，insulin)、溶剂空白对照组及模型组，insulin浓度0.03μM，药物作用浓度0.1μM和1μM。孵育24h后取上清检测葡萄糖消耗，加CCK8检测细胞活力，每孔吸取上清培养基10μL，标曲(0，0.8125，1.625，3.25，6.5，13mM)每孔10μL于96孔板。采用中生北控葡萄糖检测试剂盒(己糖激酶法)检测，先加R1，37℃孵育5min，于波长340nm读取吸光度值。再每孔加R2，37℃孵育5min，于波长340nm读取吸光度值。根据标准曲线计算绝对葡萄糖消耗量，再根据细胞活力值计算相对葡萄糖消耗量。

实验结果

Hypemonone A明显促进HepG2细胞葡萄糖的消耗，其促进作用呈浓度依赖性，与阳性药胰岛素相近，与正常对照组比较有显著统计学差异(见表1与图1)。同时，Hypemonone A对HepG2细胞活力无影响。因此，Hypemonone A具有较好的降糖效果，对细胞无毒性(见表1与图2)。

表1.Hypemonone A对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响与对HepG2细胞活力的影响。

实验结论

化合物Hypemonone A具有较好的降糖效果，因此，本发明的Hypemonone A可用于制备抗糖尿病类药物。

Claims (8)

1.化合物Hypemonone A或其药学上可接受的盐在制备抗糖尿病药物中的应用，Hypemonone A的结构式为如下所示：

2.化合物Hypemonone A的一种制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

提取：将粉碎的黄花香Hypericum beanii地上部分用乙醇提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏；将该粗浸膏溶于水，混悬均匀后用石油醚萃取，所得萃取液浓缩后得到石油醚浸膏；

分离：石油醚浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，其中，石油醚/乙酸乙酯体积比20：1的洗脱部分进一步进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮体积比4：1洗脱，洗脱液进一步进行硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，其中石油醚/乙酸乙酯体积比9：1的洗脱部分经制备型高效液相HPLC，以甲醇/水体积比75：25洗脱，得到目标化合物Hypemonone A，Hypemonone A的结构式为如下所示：

3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，提取步骤中，采用的乙醇为95％乙醇。

4.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，提取步骤中，所述提取采用的方法为加热回流提取。

5.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，分离步骤中，第一次石油醚/乙酸乙酯的梯度洗脱的浓度依次为体积比1：0，20：1，9：1，4：1，1：1，0：1。

6.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，分离步骤中，第二次石油醚/乙酸乙酯的梯度洗脱的浓度依次为体积比1：0，9：1，4：1，2：1，0：1。

7.根据权利要求2的制备方法，其特征是，在分离步骤中，所述制备型高效液相HPLC的色谱柱填料为反相十八烷基键合硅胶。

8.一种药物组合物在制备抗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物由化合物Hypemonone A或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体制备而成，HypemononeA的结构式为如下所示：

Images