CN108191616A - 白及中具有选择性丁酰胆碱酯酶抑制作用的单体成分及其用途 - Google Patents

白及中具有选择性丁酰胆碱酯酶抑制作用的单体成分及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属医药科技领域，具体涉及从兰科植物白及Bletilla striata(Thunb)Reichb.f.中分离得到的具有选择性丁酰胆碱酯酶抑制活性的单体化合物及其可药用盐，以及含有这些化合物的药物组合物。本发明的12个化合物对丁酰胆碱酯酶均具有不同程度的选择性抑制作用，其中5个化合物的IC50值低于10μM，表现出强效的丁酰胆碱酯酶抑制作用，显示出在治疗老年性痴呆疾病中的独特优势。

Description

白及中具有选择性丁酰胆碱酯酶抑制作用的单体成分及其 用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体是天然产物活性成分的提取分离及其用途。本发明涉及从兰科植物白及中分离得到的多种具有较强选择性丁酰胆碱酯酶抑制活性的菲类及二氢菲类化合物和它们的可药用盐，以及含有这些化合物的药物组合物。可以预期它们用于学习记忆障碍和老年性痴呆症的预防和治疗。
背景技术
阿尔兹海默病（AD）发生于老年及老年前期，是一种以行为损害及进行性认知功能障碍为特征的渐进性神经退行性病变。由于尚无有效治愈和控制病情进展的方法，AD已成为继心血管疾病、脑血管病和肿瘤之后威胁老年人健康的重要疾病。并且AD患者的日常行为能力严重受损，给患者家庭带来极大经济负担的同时也给政府财政带来沉重的负担。据统计，仅2010年一年，AD造成的全球经济损失就已达到6040万美元。我国人口基数大，且随着我国人口老龄化问题的日趋严重，AD对我国的影响尤为突出。因此开发出强效的AD治疗药物迫在眉睫。
AD是一种综合病，其发病机制复杂。目前关于其发病机制主要有四种假说，分别是Aβ假说、Tau假说、炎症假说以及基于神经元死亡和突触功能失调的神经保护假说。基于神经保护假说，通过增强胆碱能神经功能来缓解AD病程是当前治疗AD的主要手段。目前经过FDA批准的五种治疗AD的小分子药物中有四种为乙酰胆碱酯酶抑制剂，它们通过抑制乙酰胆碱酯酶来提高神经递质乙酰胆碱在脑内的含量，从而增强胆碱能神经功能。经过多年的临床验证，胆碱酯酶抑制剂确能有效缓解AD病程以及改善患者的认知障碍。基于此，有必要开发新型强效的胆碱酯酶活性抑制药物以应对人口老龄化严重、AD患者日益增多的现状。胆碱酯酶包括乙酰胆碱酯酶及丁酰胆碱酯酶，其中乙酰胆碱酯酶在脑内分布广泛并且在正常大脑中起到主要的水解乙酰胆碱的作用。丁酰胆碱酯酶在脑内的分布相对较少，且其特异性水解丁酰胆碱，但由于其底物特异性相对较差，故对于乙酰胆碱也具有水解作用。研究发现，随着AD病程的发展，脑内的乙酰胆碱酯酶含量从99%下降至65%，与此同时，丁酰胆碱酯酶含量由1%升高至35%，同时脑内乙酰胆碱酯酶活性也随之下降。此时，丁酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的水解作用将不容忽视。因此，对丁酰胆碱酯酶活性的抑制将对AD的发展及控制起到相当重要的作用。
中药白及又名白根、连及草等，为兰科植物白及Bletilla striata (Thunb)Reichb. f.的干燥块茎。白及具有收敛止血，消肿生肌的功效。其药理作用广泛，主要具有抗菌、抗肿瘤、抗纤维化、抗氧化、抗溃疡活性以及促进伤口愈合和止血的作用。白及中主要化学成分为联苄类和菲类及其衍生物，约占其所有化学成分的55%，是白及发挥抗菌活性的主要活性成分；白及多糖具有促进伤口愈合以及抗纤维化的作用。最近，我们从白及中提取、分离得到具有很强选择性丁酰胆碱酯酶抑制作用的几个菲类及二氢菲类化合物，有关这几种化合物的胆碱酯酶抑制活性均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从兰科植物白及中得到有效的选择性抑制丁酰胆碱酯酶的单体化合物的方法和应用，涉及化合物1-12。这12个菲及二氢菲类化合物均具有明显的选择性丁酰胆碱酯酶抑制作用，显示出在治疗老年性痴呆疾病中的独特优势。
本发明的再一目的在于提供含有化合物1-12中的菲类或二氢菲类化合物和制药学上可用的载体的药物组合物。
本发明的又一目的在于提供含有化合物1-12中的菲类或二氢菲类化合物在制备预防和治疗学习记忆障碍和老年痴呆药物及与上述疾病有关的医药或保健品用途。
本发明的化合物1-12，来自兰科植物白及的干燥块茎，经过提取、分离、纯化得到，也可通过半合成或全合成得到。
本发明化合物1-12的提取、分离、纯化的方法包括以下步骤：
1.取白及药材2 kg，粉碎成粗粉后用95%乙醇于50 ℃下热提，乙醇用量为药材重量的5倍，每次提取时间24 h，提取次数为5次。
2.提取液滤过，合并滤液。45 ℃以下减压浓缩成浸膏。
3.用少量蒸馏水使浸膏混悬于其中，分别用石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取浸膏混悬液，萃取时加入有机溶剂采取少量多次的原则对混悬液进行多次萃取。
4. 合并各有机溶剂萃取液，减压浓缩分别得到石油醚。乙酸乙酯、正丁醇部分浸膏。
5. 利用Ellman法测定浓度为100μg/mL下各部分浸膏的乙酰以及丁酰胆碱酯酶抑制活性，发现石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部分浸膏基本无乙酰胆碱酯酶抑制活性，但乙酸乙酯部位浸膏具有较强的丁酰胆碱酯酶抑制活性。因此，对乙酸乙酯部位浸膏进行进一步的分离。
6. 白及乙酸乙酯部分浸膏(60.25 g)干法上样至MCI大孔树脂柱，以PE:acetone（v/v = 10:1、8:1、6:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:5、0:1）体系梯度洗脱，将收集到的流份按照TLC检测结果、用显色剂显色后的颜色以及放置后析出沉淀等性质进行合并浓缩，得到11个部分（A-K）。
7. 使用Ellman法对A-K部分浸膏进行乙酰胆碱和丁酰胆碱酯酶抑制活性测定。结果显示在50μg/ml浓度下各流份对乙酰胆碱酯酶抑制活性均很低，流份D、J、I、H和K具有较强的丁酰胆碱酯酶抑制活性。
8. 对D、J、I、H和K流份通过制备薄层色谱(PTLC)以及高效液相色谱(HPLC)等手段分离得到化合物1-12。
发明人发现本发明的化合物具有很好的选择性丁酰胆碱酯酶抑制活性。
本发明还涉及以化合物1-12中的任意一种或多种作为活性成分的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法进行制备。通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.01-95重量%。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径包括口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、呼吸道、皮肤、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括O/W型、W/O型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括粉针剂、水针剂和输液）、滴鼻剂等；固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气（粉）雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明化合物可以制成普通剂型也可以制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将本发明化合物直接制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可以将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸盐、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：本发明所有化合物的提取、分离、纯化的方法：
1.1植物来源与鉴定:
2015年7月购于成都荷花池药材市场，经四川大学化学工程学院刘文彬老师鉴定为白及Bletilla striata (Thunb) Reichb. f的块茎。
1.2 白及药材的提取分离及化合物的结构鉴定
(1) 取白及药材2 kg，粉碎成粗粉后用95 %乙醇于50 ℃下热提，乙醇用量为药材重量的5倍，每次提取时间24 h，提取次数为5次。
(2) 提取液滤过，合并滤液。45 ℃以下减压浓缩成浸膏。
(3) 用少量蒸馏水使浸膏混悬于其中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏混悬液，萃取时加入有机溶剂采取少量多次的原则对混悬液进行多次萃取。
(4) 合并各有机溶剂萃取液，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部分浸膏。
(5) 利用Ellman法测定浓度为100μg/mL下各部分浸膏的乙酰以及丁酰胆碱酯酶抑制活性，发现石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部分浸膏基本无乙酰胆碱酯酶抑制活性，但乙酸乙酯部位浸膏具有较强的丁酰胆碱酯酶抑制活性。因此，对乙酸乙酯部位浸膏进行进一步的分离。
(6) 白及乙酸乙酯部分浸膏(60.25 g)干法上样至MCI大孔树脂柱，以PE:acetone（v/v = 10:1、8:1、6:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:5、0:1）体系进行梯度洗脱，将收集到的流份按照TLC检测结果、用显色剂显色后的颜色以及放置后析出沉淀等性质将相似流份进行合并浓缩，得到11个流份（A-K）。
(7) 使用Ellman法对流份A-K进行乙酰和丁酰胆碱酯酶抑制活性测定。结果显示在50 μg/mL浓度下各流份对乙酰胆碱酯酶抑制活性均很低，流份D、H、I、J和K具有一定的丁酰胆碱酯酶抑制活性，其中流份J和K活性最强。
(8) 将D流份上样至LH-20柱，用甲醇等度洗脱，经TLC检测合并具有相同Rf值的流份。得到D-1～3。分别对D-2(272 mg)及D-3 (43 mg)以PE:EA:acetone=3:1:1为展开条件进行制备薄层色谱(PTLC)分离，分别得到D-2a～2d以及D-3a～3c共7个流份。合并D-2c (124mg)和D-3b (15.3 mg)两个流份，再次上样至Sepahdex LH-20柱，经甲醇等度洗脱得到化合物1(48 mg)。
化合物1的结构鉴定:
淡黄色粉末，1H NMR(400 MHz, CD3OD):δ6.49(1H, s, H-1), 8.02 (1H, d,J = 8.0Hz, H-5), 6.65 (1H, dd, J = 8.0, 2.4 Hz, H-6), 6.63 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-8),2.60 (4H, m, H-9/10), 3.93(3H, s, OMe)，3.99 (3H, s, OMe);13C NMR (100 MHz,CD3OD):δ112.4 (C-1), 150.1 (C-2), 140.6 (C-3), 152.9 (C-4), 129.3 (C-5),114.2 (C-6), 156.7 (C-7), 115.3 (C-8), 31.1(C-9), 31.2(C-10), 125.7(C-4a),124.9(C-4b), 121.1 (C-8a), 139.1 (C-10a), 60.5 (OMe), 61.3 (OMe); HR-ESI-MS:271.0972 [M-H]-。以上核磁和质谱数据与文献(Yuan-Wah L, Chiang-Cheong K,Harrison L J, et al. Phytochemistry, 1997, 1(44): 157-165.)报道一致，因此确定化合物1为9,10-dihydro-3,4-dimethoxy-2,7-phenanthrenediol。
(9)将流份J浸膏用甲醇溶解，用MCI柱分离，使用acetone:H2O（v/v=1:10～1:0,每个梯度 840 mL），共得到11个流份(J-1～11)，按前述测定方法检测胆碱酯酶的抑制活性。流份J-7～11表现出良好的丁酰胆碱酯酶抑制活性，因而对它们进一步分离纯化。流份J-8共1.83g，用HW-40柱（甲醇）进行分离。收集流份并根据TLC情况进行合并，得到化合物2(1.10 g)。流份J-10共2.39g，用HW-40柱（甲醇）进行分离，根据TLC情况进行流份合并，得到J-10a～10f共6个流份。流份J-10e共131.1 mg，采用PTLC法(CH2Cl2:EtOAc=4:1，PE:acetone= 1.5:1，PE:EtOAc:CH2Cl2=2:1:1)反复进行分离纯化，得到化合物4(7.1 mg)及化合物6(4mg)。流份J-10d共269mg，采用PTLC法反复进行分离纯化，展开条件为CH2Cl2:EtOAc=6:1，得到化合物9(14.3 mg)、化合物5(6.3 mg)和化合物7(45.8 mg)。流份J-10f (128.7 mg)，使用PTLC (CH2Cl2:acetone = 6:1) 对其进行分离纯化，共得到四个流份。采用PTLC法（PE:acetone = 1.5:1）分离第四个流份 (17.2 mg)，得到化合物8 (11.1 mg)。
化合物2的结构鉴定:
暗红色颗粒状晶体，1H NMR(600 MHz, CD3OD):δ6.39(1H, s, H-1), 6.31(1H, s, H-3), 8.01 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.64 (1H, dd, J = 2.4, 9.6Hz, H-6), 6.63(1H, s, H-8), 2.60 (4H, s, H-9/10), 3.78 (3H, s, OMe);13C NMR(150 MHz, CD3OD):δ108.3 (C-1), 155.9(C-2), 99.2(C-3), 159.0(C-4), 130.0(C-5), 115.0(C-6),157.3(C-7), 113.6(C-8), 31.1(C-9), 31.7(C-10), 116.7(C-4a), 126.1(C-4b),141.8(C-8a), 140.5(C-10a), 55.8(OMe); HR-ESI-MS:265.0841[M+H]+。以上核磁和质谱数据与文献（刘美凤, 丁怡, 张东明. 竹叶兰菲类化学成分研究[J]. 中国中药杂志,2005, 30(5): 353-356.）报道相符，因此确定化合物2为coelonin。
化合物4的结构鉴定:
棕色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ6.88(1H, s, H-3), 9.20(1H, d, J = 9.2 Hz,H-5), 7.12(1H, d, J = 9.6 Hz, H-6), 7.79(1H, d, J= 9.6Hz, H-9), 7.89(1H, d, J= 9.6Hz, H-10), 7.00(2H, d, J = 8.8 Hz, H-2´/6´), 6.62(2H, d, J = 8.8Hz, H-3´/5´), 4.31(2H, s, H-7´), 4.07(3H, s, OMe), 3.88(3H, s, OMe);13C NMR(100MHz,CD3OD):δ114.9 (C-1), 154.1(C-2), 100.3 (C-3), 159.1 (C-4), 125.8(C-5), 117.8(C-6), 142.2(C-7), 146.7(C-8), 124.6(C-9), 121.4(C-10), 134.1(C-1´), 130.1(C-2´/6´), 115.9(C-3´/5´), 156.0(C-4´), 30.6(C-7´), 116.8(C-4a), 126.7 (C-5a),127.6 (C-8a), 134.1(C-10a), 55.9(OMe), 61.5 (OMe); HR-ESI-MS:377.1383[M+H]+。以上核磁和质谱数据与文献（Xiao S, Yuan F M, Zhang M S, et al.Journal of AsianNatural Products Research, 2016,19(2): 140-144）报道相符，因此确定化合物4为1-(p-hydroxybenzyl)-4,7-dimethoxyphenanthrene-2,8-diol.
化合物5的结构鉴定:
棕色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ7.02(1H, s, H-1), 9.29(1H, d, J = 9.6 Hz,H-5), 7.20(1H, d, J = 9.2 Hz, H-6), 7.72(1H, d, J = 9.6 Hz, H-9), 7.41(1H, d,J = 9.2 Hz, H-10), 4.36(2H, s, H-1´), 7.01(1H, d, J = 8.4 Hz, H-3´), 6.62(1H,d, J = 8.4 Hz, H-4´), 6.62(2H, d, J = 8.4 Hz, H-6´), 7.01(2H, d, J = 8.4 Hz,H-7´), 4.01(3H, s, OMe), 3.94(3H, s, OMe);13C NMR(100MHz, CD3OD):δ109.9 (C-1),150.1(C-2), 143.4 (C-3), 152.8 (C-4), 127.2 (C-5), 117.1 (C-6), 153.7(C-7),121.9(C-8), 123.9(C-9), 127.5(C-10), 30.9(C-1´), 133.8(C-2´), 130.2(C-3´),115.9(C-4´), 156.1 (C-5´), 115.9(C-6´), 130.22(C-7´), 119.9(C-4a), 125.3 (C-4b), 133.3 (C-8a), 130.3 (C-10a), 61.5(OMe), 60.4 (OMe); HR-ESI-MS:377.1396[M+H]+。以上核磁和质谱数据与文献（Lin C W, Hwang T L, Chen F A, et al. Journalof Natural Products, 2016, 79(8):1911.）报道相符，因此确定化合物5为Bleformin A。
化合物6的结构鉴定:
棕色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ6.88(1H, s, H-3), 9.39(1H, d, J = 9.2Hz,H-5), 7.06(1H, dd, J = 2.8, 9.2Hz, H-6), 7.10(1H, d, J = 2.8Hz, H-8), 7.45(1H, d, J = 9.2Hz, H-9), 7.73(1H, d, J = 9.2Hz, H-10), 6.99(2H, d, J = 8.4Hz,H-2´/6´), 6.62(2H, d, J = 8.4Hz, H-3´/5´), 4.30(2H, s, H-7´),4.08(3H, s,OMe);13C NMR(100MHz, CD3OD):δ114.9 (C-1), 153.9 (C-2), 100.2(C-3), 158.9(C-4),130.5(C-5), 117.2 (C-6), 155.3 (C-7), 112.0 (C-8), 128.2(C-9), 124.6(C-10),134.2(C-1´), 130.1(C-2´/6´), 115.9(C-3´/5´), 156.0(C-4´), 30.7 (C-7´), 134.2(C-1a), 116.8 (C-4a), 125.8(C-5a), 134.1(C-8a), 55.9(4-OMe); HR-ESI-MS:369.1100 [M+Na]+。以上核磁和质谱数据与文献（Matsuda H, Morikawa T, Xie H, et al. Planta Medica, 2004, 70(09):847-855）报道相符，因此确定化合物6为1-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-4-methoxy-2,7-phenanthrenediol。
化合物7的结构鉴定:
棕色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ6.52(1H, s, H-3), 7.97(1H, d, J = 8.4Hz,H-5), 6.61(1H, dd, J = 3.2, 11.2Hz, H-6), 6.60(1H, d, J = 3.2 Hz, H-8), 2.4-2.6(4H, m, H-9/10), 6.94(2H, d, J = 8.4Hz, H-2´/6´), 6.64(2H, d, J = 8.8Hz,H-3´/5´), 3.92(2H, s, H-7´), 3.80(3H, s, OMe);13C NMR(100MHz, CD3OD): δ118.5(C-1), 157.1(C-2), 99.2 (C-3), 155.6(C-4), 130.2(C-5), 114.6(C-6), 155.9(C-7), 113.47(C-8), 30.8(C-9), 27.4(C-10), 133.8(C-1´), 125.9(C-2´/6´), 115.9(C-3´/5´), 155.9(C-4´), 31.0(C-7´), 140.9 (C-1a), 117.4 (C-4a), 126.5 (C-5a),140.3(C-8a), 55.9(OMe); HR-ESI-MS:371.1257 [M+Na]+。以上核磁和质谱数据与文献（王晓娟, 崔保松, 王超,等. 云南独蒜兰的化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2014, 39(5):851-856.）报道相符，因此确定化合物7为Shancidin。
化合物8的结构鉴定:
淡黄色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ 6.87(1H, s, H-3), 9.38(1H, d, J = 9.6Hz, H-5), 7.15(1H, d, J = 9.2 Hz, H-6), 7.73(1H, d, J = 9.6 Hz, H-9), 7.68(1H, d, J = 9.6 Hz), 6.97(2H, d, J = 8.4 Hz, H-2´/6´), 6.60(2H, d, J = 8.4Hz, H-3´/5´), 6.99(2H, d, J = 8.4 Hz, H-2"/H-6"), 6.60(2H, d, J = 8.4 Hz, H-3"/H-5"), 4.07(3H, s, 4-OMe), 4.32(2H, s, -CH2-), 4.26(2H, s, -CH2-); HR-ESI-MS:475.1520[M+Na]+。以上核磁与质谱数据与文献（Bai L, Kato T, Inoue k,etal.Phytochemistry, 1991, 30(8):2733-2735.）报道一致，因此确定化合物8为1,8-bis(4-hydroxybenzyl)-4-methoxyphenanthrene-2,7-diol。
化合物9的结构鉴定:
淡黄色粉末，1H NMR (400MHz, CD3OD): δ9.30(1H, d, J = 9.6 Hz, H-5), 7.08(1H, dd, J = 2.8, 10.8 Hz, H-6), 7.06(1H, s, H-8), 7.37(1H, d, J = 9.2 Hz, H-9), 7.69(1H, d, J = 9.2 Hz, H-10), 4.33(2H, s, H-1´), 6.99(2H, d, J = 8.4 Hz,H-3´/7´), 6.62(2H, d, J = 8.4 Hz, H-4´/6´), 4.05(3H, s, 3-OMe), 3.93(3H, s,4-OMe); 13C NMR(150MHz, CD3OD): δ119.4 (C-1), 148.1 (C-2), 142.8(C-3), 150.7(C-4), 129.23 (C-5), 118.5(C-6), 156.6 (C-7), 112.7 (C-8), 127.1 (C-9), 124.4(C-10), 31.1(C-1´), 133.4(C-2´), 130.2 (C-3´), 116.1(C-4´), 157.6 (C-5´),116.1 (C-6´), 130.2 (C-7´), 119.9 (C-4a), 124.4(C-4b), 134.8(C-8a), 129.2 (C-10a), 61.5(3-OMe), 60.2 (4-OMe); HR-ESI-MS: 375.1233 [M-H]-。以上核磁与质谱数据和文献（Lin CW, Hwang T S, Chen F A, et al. Journal of Natural products,2016, 79, 1911-1921）报道一致，因此确定化合物9为Bleformin B。
(10) 将流份I用甲醇溶解，上样至HW-40柱，用甲醇等度洗脱。收集流份并根据TLC情况进行流份合并，共得到I-1～4四个流份。流份I-2 (3.56g) 用MCI柱进行分离，用acetone:H2O（v/v=50:50～100:0，每个梯度150 mL）进行梯度洗脱，根据TLC情况进行流份合并，共得到I-2a～2f六个流份。将流份I-2d (1.76g)用HW-40柱进行分离，甲醇等度洗脱，得到化合物3(52.6 mg)。
化合物3的结构鉴定:
土黄色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ7.04(1H, s, H-1), 9.25(1H, d, J = 9.2Hz, H-5), 7.10(1H, dd, J = 9.2, 2.4 Hz, H-6), 7.12(1H, d, J = 2.4 Hz, H-8),7.41(1H, s, H-9), 7.41(1H, s, H-10), 3.93(3H, s, OMe), 3.99(3H, s, OMe);13CNMR(100MHz, CD3OD):δ 110.1(C-1), 150.2(C-2), 143.3(C-3), 152.7(C-4), 129.1(C-5), 117.6(C-6), 156.0(C-7), 112.5(C-8), 127.3(C-9), 127.8(C-10), 119.5(C-4a),124.7(C-4b), 135.0(C-8a), 130.8(C-10a), 60.4(OMe), 61.4(OMe); HR-ESI-MS:225.0761[M-H]-。以上核磁和质谱数据与文献（Leong Y W, Kang C C, Harrison L J, et al. Phytochemistry, 1997, 44(1):157-165.）报道相符，因此确定化合物3为2,7-dihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene.
(11) 将流份K用MCI柱进行分离，以acetone/H2O混合溶剂进行梯度洗脱(v/v=40:60～75:25，每个梯度1.5 L)，共得到9个流份K-a～g。流份K-g共1.445g，用HW-40F柱进行分离，甲醇等度洗脱，得到K-g-1～g-8共8个流份。流份K-g-5共303.1mg，使用PTLC法对其纯化，展开条件为PE:EtOAc=1.5:1，得到K-g-5a～K-g-5c三个流份。流份K-g-5b共83.8mg，多次使用PTLC法进行分离纯化，展开条件分别为PE:EtOAc=1.5:1以及PE:EtOAc=2:1，得到K-g-5b2a2共15.4mg即为化合物12。流份K-g-7共124.1mg直接使用PTLC法进行进一步纯化，展开条件为CH2Cl2:EtOAc=6:1，得到K-g-7a～K-g-7d四个子流份。流份K-g-7a共35mg，多次使用PTLC进行分离纯化，展开条件分别为PE:EtOAc=1.8:1以及PE:EtOAc=2:1，共得到两个部分K-g-7a1a(10.8mg)以及K-g-7a1b(14.7mg)即为化合物11和10。
化合物10的结构鉴定:
淡黄色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ6.94(1H, s, H-3), 9.40(1H, d, J = 9.2Hz, H-5), 7.11(1H, dd, J = 9.2, 2.8 Hz, H-6), 7.14(1H, d, J = 2.4 Hz, H-8),7.50(1H, d, J = 9.2 Hz, H-9), 7.66(1H, d, J = 9.2 Hz), 6.66(1H, s, H-1´),6.67(1H, dd, J = 10.4, 2.8 Hz, H-3´), 8.05(1H, d, J = 9.2 Hz, H-4´), 6.39(1H,d, J = 2.4 Hz, H-6´), 6.29(1H, d, J = 2.4 Hz, H-8´), 2.60(4H, s, H-9´/10´),4.12(3H,s, 4-OMe), 3.80(3H, s, 5´-OMe), 13C NMR(150MHz, CD3OD):δ130.8(C-1),147.8(C-2), 100.9(C-3), 157.5 (C-4), 130.4(C-5), 117.7(C-6), 155.7(C-7),112.4 (C-8), 128.9(C-9), 121.3(C-10), 116.6(C-4a), 125.4 (C-4b), 134.7 (C-8a), 129.2 (C-10a), 114.7(C-1´), 158.2 (C-2´), 113.5 (C-3´), 129.9(C-4´),159.3 (C-5´), 99.2 (C-6´), 157.8(C-7´), 108.3(C-8´), 31.2 (C-9´), 31.6(C-10´), 128.1(C-4a´), 116.4 (C-4b´), 142.1 (C-8a´), 140.5(C-10a´), 56.3 (4-OMe),55.9 (5´-OMe); HR-ESI-MS: 503.1471 [M+Na]+。以上核磁和质谱数据与文献（Yamaki M,Bai L, Kato T, et al. Phytochemistry, 1992, 31(11): 3985-3987.）报道一致，因而确定化合物10为Blestrin D。
化合物11的结构鉴定:
淡黄色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ6.94(1H, s, H-3), 9.41(1H, d, J = 9.2Hz, H-5), 7.12(1H, dd, J = 2.8, 9.2 Hz, H-6), 7.15(1H, d, J = 2.8 Hz), 7.52(1H, d, J = 9.2 Hz,H-9), 7.67(1H, d, J = 8.8 Hz, H-10), 6.24(1H, d, J = 2.4Hz, H-1´), 6.58(1H, d, J = 2.4 Hz, H-3´), 8.02(1H, d, J = 9.4 Hz, H-5´), 6.62(1H, dd, J = 2.8, 6.8 Hz, H-6´), 6.60(1H, s, H-8´), 2.58(4H, m, H-9´/10´),4.12(3H, s, 4-OMe), 3.75(3H, s, 4´-OMe); HR-ESI-MS:503.1471[M+Na]+。以上核磁和质谱数据与文献（Yamaki M, Bai L, Kato T, et al. Phytochemistry, 1992, 31(11):3985-3987.）报道一致，因而确定化合物11为BlestrinC。
化合物12的结构鉴定:
淡黄色粉末，1H NMR(400MHz, CD3OD):δ6.60-6.63(1H, m, H-3), 8.05(1H, d, J =8.4 Hz, H-5), 6.64(1H, dd, J = 2.8, 8.8 Hz, H-6), 6.60-6.63(1H, m, H-8), 2.54(4H, s, H-9/10), 6.26(1H, d, J = 2.4 Hz, H-1´), 6.51(1H, d, J = 2.4 Hz, H-3´), 8.01(1H, d, J = 9.6 Hz, H-5´), 6.60-6.63(1H, m, H-6´), 6.60-6.63(1H, m,H-8´), 2.60(4H, s, H-9´/10´), 3.77(3H, s, 4´-OMe), 3.86(3H, s, 4-OMe), 13C NMR(150MHz, CD3OD):δ133.9(C-1), 150.6(C-2), 100.7 (C-3), 155.9(C-4), 130.3 (C-5), 113.7(C-6), 156.5 (C-7), 115.1 (C-8), 30.5(C-9), 24.3(C-10), 117.2 (C-4a), 125.8 (C-5a), 140.2(C-8a), 134.4(C-10a), 107.5 (C-1´), 158.9 (C-2´),99.2 (C-3´), 159.1 (C-4´), 130.2(C-5´), 113.7 (C-6´), 156.5 (C-7´), 115.0 (C-8´), 31.1 (C-9´), 31.8(C-10´), 118.6 (C-4a´), 125.7(C-5a´), 140.7(C-8a´),141.8 (C-10a´), 55.9(4´-OMe), 56.18(4-OMe); HR-ESI-MS:505.1622 [M+Na]+。以上核磁和质谱数据与文献（Bai L, Yamaki M, Inoue K, et al. Phytochemistry, 1990, 29(4):1259-1260.）报道一致，因此确定化合物12为Blestrin A。
实施例2：化合物1-12对胆碱酯酶的体外抑制活性检测
用于活性检测的12个菲类和二氢菲类化合物详见表I:
Table 1 Compounds isolated from EtOAc parts of Bletilla striat
根据文献并优化的乙酰及丁酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型，对化合物1-12进行了胆碱酯酶抑制活性检测，12个化合物均表现出强有力的丁酰胆碱酯酶抑制活性。其活性数据见表Ⅱ:
Table 2 The cholinesterase inhibitory activity of 12 compounds isolatedfrom Bletilla striata in vitro.

Claims (4)

1.下述结构式所述的化合物及其可药用盐或溶剂化物。
2.根据权利要求1所述化合物的制备途径，其主要来源于任意一种中国产的白及属植物任一部位，即可以是中国药品市场上常见的白及药材；可以是干品或鲜品；可以是药材植物的根、茎、叶、花、种子、皮、果实，也可以是它们的混合物。
3.权利要求1所述的化合物1-12在制备预防和治疗学习记忆障碍药物中的应用。
4.权利要求1所述的化合物1-12在制备抗老年痴呆症药物中的应用。
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