CN109876087A - 中草药组合物及其用于制备改善肺功能的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中草药组合物及其用于制备改善肺功能的用途，其中该中草药组合物，包含：白及水萃物、陈皮水萃物、白芷酒精萃物、及五味子水萃物，其中该白及水萃物、该陈皮水萃物、该白芷酒精萃物、及该五味子水萃物的比例为1‑3：1‑3：1‑3：1‑3。本发明另提供一种利用该中草药组合物制备改善肺功能的用途。本发明所提供的中草药可具有抗肺纤维化、抗肺发炎、抗肺过敏、及缓解气喘的能力，并且不具有细胞毒性。

Description

中草药组合物及其用于制备改善肺功能的用途

技术领域

本发明关于改善肺功能的领域，特别是使用中草药复方来改善肺功能的领域。

背景技术

肺部的疾病或征状包括气喘、肺纤维化、发炎、肺过敏等等。其中，发炎可能导致肺炎、慢性支气管炎。导致气喘的因素有例如呼吸道感染、出生时体重过轻、食物、空气污染、二手烟等等。肺纤维化就像肺部的疤痕组织，当肺脏受伤时，纤维母细胞在修复过程中失去了调控，就可能会造成肺部纤维化，纤维化后的肺脏因为失去了应有的弹性，肺泡壁逐渐增厚、僵硬，无法有效交换气体，因此出现喘、干咳、呼吸困难等症状。

支气管炎即指支气管内壁发炎。引发支气管炎的原因可能是病毒或细菌感染。当其发炎时，气道变窄，空气输送减弱，痰液增多。支气管炎通常分为两种:急性及慢性支气管炎。急性支气管炎一般发生在严重伤风感冒之后，当自身免疫系统功能减弱时。

急性支气管炎通常不到两周或在二周内会痊愈。慢性支气管炎多数因吸烟引起，但反复发作的急性支气管炎若治疗不当，可演变为慢性支气管炎。支气管炎若延误治疗，可引致严重的呼吸道疾病，伤害肺部甚至引起心脏衰竭。

肺炎意指炎症侵及肺泡，导致脓液充塞，妨碍氧气输入血中。引致肺炎的原因有多种，可能是感染病毒或细菌，又有可能是不慎吸入食物或液体入肺部，也有可能因久病或手术后长期卧床所致。肺炎更是流行性感冒的一种常见并发症。如不及时加以治疗，严重的肺炎可危及生命。

故，开发一种可以改善各种肺功能或肺部征状的药物是一重要的目标。

发明内容

本发明为解决上述问题，改善现代人各种肺部问题，苦心研究各种中草药，并用科学验证原理，获得本发明的中草药组合物，用于改善肺部功能。

为达上述的目的，本发明提供一种中草药萃取物，包含：白及萃取物、陈皮萃取物、白芷萃取物、及五味子萃取物，其中该白及萃取物、陈皮萃取物、及五味子萃取物为水萃取，该白芷萃取物为酒精萃取或水萃取；白及萃取物、该陈皮萃取物、该白芷萃取物、及该五味子萃取物的比例为1-3：1-3：1-3：1-3。

本发明另提供一种中草药萃取物用于制备治疗或预防肺部问题的组合物的用途，该组合物包含白及水萃物、陈皮水萃物、白芷酒萃物、五味子水萃物、及医药或食品上可接受的载剂与赋形剂，其中该白及水萃物、该陈皮水萃物、该白芷酒萃物、及该五味子水萃物的比例为1-3：1-3：1-3：1-3。

附图说明

图中所述的*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.005，#<0.05，##<0.01,，###<0.001；*为对照组(ctrl)与空白对照组(mock)比较之p值；#为与空白对照组比较之p值。

图1白及水萃取物对小鼠脾脏细胞的抗发炎影响；

图2陈皮水萃取物对小鼠脾脏细胞的抗发炎影响；

图3白芷酒精萃取物对小鼠脾脏细胞的抗发炎影响；

图4五味子水萃取物对小鼠脾脏细胞的抗发炎影响；

图5不同萃取物对于Fibronectin表现量的影响；

图6不同萃取物对于Collagen蛋白质表现量的影响；

图7为白及配伍1号及8号对于抑制iNOS及COX-2蛋白质作用；(A)白及配伍1号共培养于短时间刺激6小时的细胞；(B)白及配伍1号共培养于长时间刺激24小时；(C)白及配伍8号共培养于短时间刺激6小时的细胞；(D)白及配伍8号共培养于长时间刺激24小时的细胞；

图8白及配伍1号及8号对于抑制PGE2的作用；(A)白及配伍1号共培养于短时间刺激6小时的细胞；(B)白及配伍1号共培养于长时间刺激24小时的细胞；(C)白及配伍8号共培养于短时间刺激6小时的细胞；(D)白及配伍8号共培养于长时间刺激24小时的细胞；

图9不同浓度白及配伍1号对于正常肺纤维母细胞的细胞毒性；

图10不同浓度白及配伍1号对于细胞外基质基因表现量的影响；

图11不同浓度白及配伍1号对于细胞内胶原蛋白含量的影响；

图12白及甲醇萃取物萃取的流程；

图13白及甲醇回流萃取物HPLC层析图谱；

图14白及分离出七种有效成分的NO抑制率和存活率；

图15白及配伍1号对于大鼠足掌肿胀的抑制作用；

图16以各种浓度的白及配伍1号处理后血清中OVA专一性抗体IgE的含量；

图17喂食不同剂量样品对小鼠呼吸道阻力测试的影响；

图18喂食不同剂量样品对小鼠肺冲洗液中发炎细胞种类分布的影响；

图19小鼠肺部组织切片H&E染色结果(放大倍率200倍)；(A)控制组；(B)低剂量白及配伍1号；(C)高剂量白及配伍1号；

图20小鼠肺部组织切片PAS染色结果(放大倍率200倍)；

图21不同剂量的白及配伍对肺冲洗液中细胞激素及发炎介质分泌量的影响；

图22喂食白及后对Bleomycin诱导小鼠肺组织中纤维化相关基因及蛋白的表；现，(A)Collagen Type III表现量；(B)TGF-β1表现量；(C)总胶原蛋白表现量；

图23喂食白及后对Bleomycin诱导小鼠肺组织病理切片H&E染色结果(比例尺＝1mm)；

图24喂食白及后对Bleomycin诱导小鼠肺组织病理切片Masson’s Trichrome染色结果(比例尺＝1mm)；

图25喂食白及配伍后对Bleomycin诱导小鼠肺组织中总胶原蛋白表现量的情形，(A)Collagen Type III表现量；(B)TGF-β1表现量；(C)总胶原蛋白表现量；

图26喂食白及配伍后对Bleomycin诱导小鼠肺组织病理切片H&E染色结果(比例尺＝1mm)；

图27喂食白及配伍后对Bleomycin诱导小鼠肺组织病理切片Masson’s Trichrome染色结果(比例尺＝1mm)；

图28为白及配伍1号的NO抑制率和存活率；

图29白及配伍1号不同萃取方式的NO抑制率和存活率。

具体实施方式

为达成上述目的及功效，本发明所采用的技术手段，就本发明较佳实施例详加说明其特征、功能、与技术如下，俾利完全了解，但须注意的是，该等内容不构成本发明的限定。

样品制备

将白及、陈皮、白芷、及五味子利用热水与50％酒精两种溶剂萃取，再将萃取物进行冻干燥后，作为配伍的原料，并分别计算其萃取率，结果如表1所示。两种萃取方法的萃取率最佳中药材为五味子，其热水萃取的萃取率为29.08％，50％酒精萃取的萃取率为24.87％；次佳为陈皮水萃取的萃取率为20.48％，50％酒精萃取的萃取率为20.31％，其余中药材，萃取率则皆低于15％。

表1、各成分的水萃取及酒精萃取的萃取率

各成分对于抗发炎试验及细胞毒性的试验

1.脂多醣(Lipopolysaccharide，LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞发炎及MTT细胞毒性试验

本实施例利用LPS与细胞膜上的受体结合后，诱导一连串的讯息传递，使iNOS与COX-2蛋白质大量表现，继而产生发炎前驱物一氧化氮(NO)。利用此方法追踪分离白及中有效的抗发炎活性成分

将RAW 264.7细胞以4.0×10⁵/ml种于96孔盘，24小时后分别加入分离得到的各成分(白及、陈皮、白芷、及五味子)的萃取物及LPS 500ng/ml。24小时后取出上清液100μl，并加入100μl的Griess reagent，再经ELISA以530nm波长为NO的吸光值测试。

结果显示，NO抑制率效果最佳萃取物为白芷酒精萃取物，在浓度500μg/mL，其对NO抑制率为97.73±1.04μg/mL，具有显着抑制的功效；细胞存活率为88.75±0.86μg/mL，不具有细胞毒性。次佳为陈皮水萃物，在浓度400μg/mL有些微细胞毒性，细胞存活率为76.45±1.49μg/mL，NO抑制率为78.02±0.76μg/mL，其IC50为138.51±11.30μg/mL。第三为五味子水萃物，在浓度400μg/mL，NO抑制率为36.12±5.08μg/mL。其余中药材则无显着NO抑制率。结果如表2及表3所示。

表2、各中药的水萃物对NO抑制率和细胞存活率

表3、各中药的酒精萃物对NO抑制率和细胞存活率

2.LPS及抗CD3的单株抗体活化的小鼠脾脏细胞

以取自BALB/c小鼠的脾脏细胞为筛选平台，在脾脏细胞、中药萃取物与细胞刺激物共培养下，检测细胞分泌细胞激素interleukin(IL)-5、IL-13、tumor necrosis factor(TNF)-α以及interferon(IFN)-γ表现量，以此来评估中药对发炎反应的调控功效。

本实验用到的细胞刺激物有两种，分别为抗T淋巴球细胞CD3的抗体(anti-CD3antibody)以及LPS。T淋巴球细胞会使用1μg/ml的anti-CD3antibody刺激培养，而抗原呈现细胞则以100ng/ml LPS来刺激。

首先将BALB/c小鼠脾脏取出并制备成单一细胞悬浮液，更进一步利用缓冲液将红血球去除，而白血球则利用HBSS溶液清洗后再进行下一步的实验。将分离出的细胞调好适当的浓度(1x10⁷cells/ml)后，置于48孔培养盘中，利用已经定量过的抗体或脂多醣来刺激这些细胞。经过48小时的培养后，收集细胞培养液以测定其细胞激素(T细胞：IL-5、IL-13、IFN-γ；抗原呈现细胞：TNF-α)分泌量。

利用ELISA测定细胞激素的分泌量，此分析方法叙述如下。收集细胞培养液以ELISA检测细胞培养液中的细胞激素浓度变化。分别取抗细胞激素IL-5、IL-13、TNF-α以及IFN-γ的抗体溶于缓冲液中，置于室温隔夜，隔天用洗涤缓冲液冲洗，加入填充缓冲液在室温下静置2小时，然后用洗涤缓冲液冲洗，加入待测的细胞培养液在室温下作用，接着用洗涤缓冲液冲洗，加入biotin联结的抗细胞激素及发炎介质的抗体，室温下静置2小时后，用洗涤缓冲液冲洗，再加入酵素于室温下作用，之后用洗涤缓冲液冲洗，加入TMB呈色剂呈色，最后再加入stop solution来停止反应，以ELISA reader测特定波长吸光值来换算出待测液所含的浓度。

先以MTT方法检测该等中药(白及、陈皮、白芷、五味子)的各种剂量对脾脏细胞毒性的影响，由结果显示：白及水萃取物的使用安全剂量为小于1000μg/ml，细胞存活率大于90％(如图1中的A图所示)，故取1000μg/ml以下的不同剂量的白及萃取物进行抗发炎的检测。

白及：如图1中的B图所示，负对照组：未加入任何刺激物培养；正对照组：加入LPS以及anti-CD3抗体刺激物培养；125μg/ml：在刺激物存在下，加入125μg/ml的萃取物共培养；250μg/ml：在刺激物存在下，加入250μg/ml的萃取物共培养；500μg/ml：在刺激物存在下，加入500μg/ml的萃取物共培养。与正对照组进行统计分析，确认在125μg/ml的白及萃取物作用下，细胞分泌TNF-α的能力有被抑制下来，呈现有意义的统计差异。

陈皮：经MTT检测陈皮水萃物对小鼠脾脏细胞的毒性，结果显示陈皮水萃取物的使用安全剂量为小于500μg/ml作用下，细胞存活率大于90％(如图2中的A图)。故取500μg/ml以下的不同剂量的陈皮萃取物进行抗发炎的检测。如图2B所示，与正对照组进行统计分析，确认在125μg/ml的陈皮水萃取物作用下，细胞分泌IL-5、IL-13、IFN-γ以及TNF-α的能力即可被抑制下来，呈现有意义的统计差异。

白芷：白芷酒精萃取物的使用安全剂量经MTT检测为小于1000μg/ml作用，细胞存活率大于90％(如图3中的A图)。之后取不同安全剂量的白芷萃取物进行抗发炎的检测。如图3B所示，与正对照组进行统计分析，确认在250μg/ml的白芷萃取物作用下，细胞分泌IL-5、IL-13、IFN-γ以及TNF-α的能力皆被抑制下来，呈现有意义的统计差异。

五味子：五味子水萃取物的使用安全剂量经MTT检测为为小于500μg/ml作用，细胞存活率大于90％(如图4中的A图)。之后取不同安全剂量的五味子萃取物进行抗发炎的检测。如图4中的B图所示，与正对照组进行统计分析，确认需在500μg/ml的五味子萃取物作用下，才能抑制细胞分泌IFN-γ细胞激素，但因IFN-γ属于Th1细胞所分泌，此抑制作用对Th2无影响，亦无法降低抗原呈现细胞分泌前发炎激素TNF-α的能力。

各成分对于抑制肺纤维化的试验

白及和配伍中药材对于纤维连接蛋白(Fibronectin)与胶原蛋白(Collagen)蛋白质表现量的影响

利用TGF-β1诱导MRC-5细胞外基质增生。将7×10⁴个人类正常肺纤维母细胞(MRC-5)接种于24孔培养盘中。培养24小时细胞贴附后，将旧培养液去除并以PBS清洗，接着将培养液置换成Opti-MEM，同时间加入2.5ng/mL TGF-β1刺激以及不同浓度的五味子、陈皮、白芷及白及4种水萃取物。24小时后，各萃取物各自以浓度25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml下去做纤维化反应治疗。并且设一组Control组及一组TGF-β1刺激且并无萃取物治疗的Mock组。在各组细胞分别治疗24小时后，将细胞收集下来萃取细胞RNA以realtime RT-PCR检测细胞外基质基因表现量及检测细胞内胶原蛋白累积情形作为评估抗纤维化的指标。

实验中使用的Primer序列如下表4：

表4、Primer序列

参照图5，结果显示，Mock组与Control组比较，显着提高Fibronectin表现量，然而以四种萃取物不同浓度处理下，Fibronectin表现量皆显着降低，其中抑制Fibronectin表现效果最佳的为白及水萃物，在最低浓度25μg/ml时，即显着抑制Fibronectin的mRNA表现量，具有抗纤维化的作用。

参照图6，在Collagen表现量评估抗纤维化试验结果显示，四种萃取物在不同浓度处理下，与Mock组相比，萃取物皆具明显抑制TGF-β1刺激产生Collagen的表现量。

正交试验设计

依据上述结果确定其改善肺功能的组成萃取物，选用陈皮(水萃)、白芷(酒萃)、五味子(水萃)，将此三种萃取物与白及，利用正交试验设计原理，设计出9种不同比例的配方。以LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞发炎产生NO，筛选抗发炎功效最佳白及配伍处方。

本发明依照正交实验设计做配伍研究，本试验采用L9(34)正交表。设计如下表5：

表5、正交试验设计表

结果如表6所示，NO抑制效果最佳组成为试验编号1号，白及：陈皮：白芷：五味子的组成比例为1：1：1：1，其IC50为85.45±6.08μg/mL。再者为试验编号2号，白及：陈皮：白芷：五味子组成比例为1：2：2：2，其IC50为114.63±2.39μg/mL。接着为试验编号3号，白及：陈皮：白芷：五味子组成比例为1：3：3：3，其IC50为159.08±3.51μg/mL。影响主次因素为白及>五味子>白芷>陈皮。因此下述试验以配伍一号作为配比。

表6、白及配伍正交试验设计的NO抑制能力

白及配伍In vitro对于抗发炎的试验

由白及与其它中药材配伍的抗发炎作用结果显示，其白及配伍1号抑制一氧化氮的效果最好(如上表格6所示)，此外再选择另一组白及配伍8号，将两种配伍组成，利用西方墨点法进一步了解抗发炎的作用机转。

1.LPS诱导RAW264.7巨噬细胞发炎

细胞经LPS刺激后，COX-2、iNOS蛋白质会大量表现，因此本实施例以白及配伍1号、白及配伍8号，分别与LPS刺激的RAW 264.7细胞共同短时间培养6小时以及长时间24小时后，分别观察COX-2及iNOS蛋白质表现量。

结果如图7所示，白及配伍1号及白及配伍8号，在LPS短时间6小时刺激下，皆具有显着抑制iNOS蛋白质的表现，呈现剂量相关性，但对于COX-2蛋白质的表现量抑制效果较不显着(图7中的A图及图7中的C图)。然而白及配伍1号及白及配伍8号，在长时间24小时刺激下，两种配伍组成皆明显抑制COX-2及iNOS蛋白质的表现，且具有剂量相关性(图7中的B图及图7中的D图)。

2.LPS诱导RAW 264.7细胞产生PGE2

此外，本实施例以白及配伍1号及白及配伍8号试验，观察两种配伍对于抑制LPS诱导RAW 264.7细胞的PGE2的效果。

白及配伍1号和白及配伍8号分别与500ng/mL的LPS刺激的RAW 264.7细胞共同短时间培养6小时以及长时间24小时后，再观察两个配伍对PGE2的抑制作用。

结果如图8所示，白及配伍1号短时间刺激6小时，在浓度50μg/ml下，对PGE2抑制率具有显着的抑制作用，其抑制率约60％左右(图8中的A图)；长时间24小时刺激下，也有抑制PGE2的能力，其IC50为153.43±6.27μg/mL(如图8中的B图)。而白及配伍8号不管短时间或长时间刺激，皆可显着地抑制PGE2的表现量。短时间6小时刺激其IC50为196.55±48.45μg/mL(图8中的C图)；长时间24小时刺激，其IC50为185.20±13.10μg/mL(图8中的D图)。

由上述结果显示：抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞的发炎反应，白及配伍1号比白及配伍8号抑制作用显着。

白及配伍1号in vitro对于抑制肺纤维化的试验

1.白及配伍1号的细胞毒性测试

在此实施例中，检测白及配伍1号对于肺纤维化的影响。利用TGF-β1诱导人类正常肺纤维母细胞细胞外基质表现。首先，先测试不同浓度的白及配伍1号对于正常肺纤维母细胞的细胞毒性。结果如图9所示，白及配伍1号在浓度200μg/ml下对人类正常肺纤维母细胞皆无细胞毒性，但在浓度400μg/ml处理下有些微毒性，存活率为87.2±5.8％。

2.白及配伍1号的细胞外基质基因表现量抑制功效

接着，测试不同浓度白及配伍1号对于细胞外基质基因表现量的影响。以TGF-β1诱导MRC-5细胞，让细胞因为TGF-β1刺激产生纤维化机制。结果如图10所示，比较Mock组与Control组，Mock组显着提高细胞外基质基因表现量(包括Fibronectin、Collagen type I及Vimentin)，白及配伍1号不同浓度治疗下与没有治疗的Mock组相比，细胞外基质基因表现量皆显着降低，在白及配伍1号最低浓度25μg/ml时即有显着抑制细胞外基质基因的表现，其中Fibronectin抑制率为35.9±12.8％；Collagen type I抑制率为32.2±6.1％；Vimentin抑制率为42.8±20.9％。而随着白及配伍1号浓度提高，抑制效果亦有明显提高，在浓度200μg/ml时达到最佳抑制效果，其中Fibronectin抑制率为54.1±8.8％；Collagentype I抑制率为39.5±6.5％；Vimentin抑制率为79.8±5.1％。由结果可知，白及配伍1号具有抗纤维化的效果。

3.白及配伍1号的细胞胶原蛋白含量(collagen content)抑制功效

另一测试不同浓度白及配伍1号对于肝纤维化的影响，是采用细胞胶原蛋白含量评估抗纤维化。结果如图11所示，白及配伍1号在不同浓度治疗下，与没有治疗的Mock组相比，白及配伍1号皆具明显抑制TGF-β1诱导产生胶原蛋白的表现量。

白及萃取物抗发炎活性成分的分离纯化

1.白及萃取物抗发炎活性成分分离

白及利用甲醇加热回流萃取，甲醇萃取物以RP-18、Sephadex LH-20、硅胶、制备级RP-18等管柱进行层析，并以TLC或HPLC追踪分离出的划分部，如果成分相同则加以合并，最后分离出白及的活性成分。以NMR、2D-NMR、UV、ESI-Mass等仪器进行化合物结构鉴定。

根据图12中的A图白及萃取流程的方法，将白及630g以3000ml甲醇回流萃取两次，收集萃取液经减压浓缩去除甲醇溶剂，得到白及甲醇萃取物，再进一步冷冻干燥得到冻干粉59.918g，产率为9.5％。

再依据图12中的B图的萃取流程，将取得的白及甲醇萃取物38.7497g，以SephadexLH-20管柱(5cm i.d.x 47cm)，利用移动相MeOH进行冲提，每15分钟换瓶收集一次，再进一步将白及萃取物33.99g，每次取5g利用LiChroprep RP-18管柱进行层析，共进行四次层析。

结果显示如图13层析图谱所示，于滞留时间24.168分钟时出现波峰1、滞留时间32.718分钟时出现波峰2、37.793分钟时出现波峰3、45.127分钟时出现波峰4与46.622分钟时出现波峰5，成功分离出五种有效成分，分别为Bleformin J、Militarine、Coelonin、Batatasin III、Gymnoside VII，其中含量最高的成分为Militarine，有194.61mg/g，其余含量皆小于10mg/g。分离成分结果如表7所示。

表7、白及甲醇回流各化合物含量

2.白及甲醇回流各化合物抑NO能力评估

根据上述分离纯化流程，白及萃取物成功分离出五种有效成分，Bleformin J、Militarine、Coelonin、Batatasin III、Gymnoside VII；成分在浓度20μM剂量下，皆不具有细胞毒性，然而将得到的有效成分Militarine，进行体外抗发炎筛选试验，结果并不具有抑制一氧化氮的作用，因此推测白及萃取物主要抗发炎作用的成分不是Militarine。一氧化氮抑制功效比较，效果最佳为Coelonin，其IC50＝5.00±0.19μM，次佳为BatatasinⅢ，其NO抑制率为46.7％。结果如图14所示。

白及配伍In vivo对于抗发炎的试验

1.鹿角菜胶诱导足肿的清咽动物模式

利用皮下注射鹿角菜胶引起异物侵入性发炎的产生，异物侵入生物体后会局部诱导发炎介质合成及释放，如PGE2、histamine及IL-1β等，此反应会引起足部发炎肿胀而体积上升。其评估指标是评估由鹿角菜胶诱导后其足掌肿胀的变化大小，若可以抑制足肿，则具有利咽作用。

实验流程是将雄性Wistar大鼠分为四组，空白组、控制组、低剂量实验组30mg/kg、高剂量实验组150mg/kg，每组各10只，Carrageenan诱导前一小时，实验组分别管喂30mg/kg及150mg/kg的白及配伍1号配方，控制组管喂去离子水。经一小时后，于左足掌注射1％鹿角菜胶50μL，并于第1、3、5小时测量大鼠的足肿。利用足掌测定仪测量足掌肿胀情形，并于监测至第五小时后牺牲大鼠。

鹿角菜胶诱导足掌肿胀的大鼠，喂服白及配伍1号萃取物实验中，结果如图15所示：注射Carrageenan第1个小时后，喂服白及配伍1号萃取物，低浓度30mg/kg与控制组比较，就具有抑制大鼠足掌肿胀的作用(***：p<0.005)；且喂服高浓度150mg/kg下，抑制Carrageenan诱导大鼠足肿的能力更为显着(***：p<0.005)。

然而在第3个小时和第5个小时后，发现喂30mg/kg及150mg/kg白及配伍1号萃取物，仍有意义抑制足掌肿胀(***：p<0.005)。显示白及配伍1号萃取物，能够有效抑制大鼠足掌肿胀，具有显着利咽的功效。

白及配伍1号in vivo对过敏的气喘动物模式

1.白及配伍1号对OVA专一性抗体IgE的抑制作用

选用BALB/c雌鼠(此乃用于进行改善过敏体质认证实验公认可用的小鼠品系)。每组小鼠(n＝6只/组)分别饲养于不钢笼中，自由摄食饮水及饲料。小鼠随机分组，并开始以管喂方式额外给白及配伍1号样品；管喂六周后则进行牺牲，以进行减少过敏免疫反应的功能评估。

小鼠共分三组：控制组(control)管喂蒸馏水；低剂量试验组(low dose)管喂白及配伍1号样品30mg/kg；高剂量试验组(high dose)管喂白及配伍1号样品150mg/kg。

第一次腹腔注射OVA抗原：每只小鼠的使用剂量为50μg OVA。将此剂量的OVA与佐剂充分混合均匀后，共200μl注入小鼠腹腔中。之后OVA剂量调为30μg/mouse，仍是配合佐剂，每隔两周即对BALB/c小鼠进行腹腔注射。小鼠牺牲前会进行采血，收集血清，保存在-20℃以进行后续抗体的酵素免疫分析法分析。管喂白及配伍1号样品六周后，则进行给予小鼠连续五天的吸入性抗原OVA刺激。之后检测小鼠的呼吸道阻力的变化，并牺牲小鼠收集肺冲洗液來进行细胞分析、测量肺冲洗液中细胞激素及发炎介质的分泌量等检测。

此实施例中检测小鼠喂食不同剂量白及配伍1号六周后血清中OVA专一性抗体IgE的含量。

替小鼠采血测量anti-OVA的IgE的抗体效价。首先将OVA溶于carbonate coatingbuffer中，配好的OVA抗原溶液以100μl/well加到96-well microtiter plates中，置于4℃冰箱隔夜，隔天用洗涤缓冲液冲洗，然后加入填充缓冲液，在室温下静置2小时，再用洗涤缓冲溶液冲洗，加入待测的血清分别以填充缓冲液稀释，将已稀释的样品取100μl/well，放置于4℃冰箱隔夜后，用洗涤缓冲溶液冲洗，再加入biotin-conjugated anti-mouse IgE抗体，静置于室温反应后，用洗涤缓冲溶液冲洗，再加入酵素静置于室温反应后，用洗涤缓冲溶液冲洗，后加入TMB呈色剂呈色，最后再加入stop solution来停止反应，以ELISA reader判读机测吸光值并计算出抗体浓度。

结果如图16所示，在气喘发病的动物模式上，可检测到控制组的小鼠体内有较高量OVA专一性IgE抗体的产生。结果显示，与控制组相比，可观察到低剂量组以及高剂量组的小鼠，在经长期喂食样品后，皆可明显降低OVA专一性IgE抗体的产生。

2.呼吸道阻力测试

过敏性气喘是一种慢性的呼吸道疾病，其主要的特征除了发炎以外还有呼吸道过度反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)。当呼吸道反复接受刺激时，因为反复的发炎反应，而促使呼吸道纤维化和平滑肌增厚，所造成的呼吸道重塑现象。本实施例刺激呼吸道收缩的方式为小鼠一开始先接受生理食盐水的刺激，再依序接受浓度由低往高的methacholine(1、2、4、8、16mg/mL)刺激，各浓度皆在刺激三分钟后，再纪录三分钟的呼吸道生理变化。记录三分钟内各分钟平均值。在数据表示上，以每个不同浓度时间点所得到的呼吸道肺阻力(Lung Resistance，RL)平均值除以每只小鼠只吸入生理食盐水后所得的RL值，可得到相对增加的比例，以relative RL表示。

结果如图17所示，从图中可知，在控制组小鼠的呼吸道阻力数值随着吸入methacholine剂量增加而上升。与控制组的过敏小鼠相比，发现喂食低剂量的白及配伍1号样品的小鼠，其呼吸道阻力严重的程度有获得明显改善。喂食配伍1号即可以降低methacholine浓度为2至16mg/ml刺激下所造成的呼吸道收缩情形。整体而言，与控制组相比，小鼠喂食低剂量的样品，即可得缓解气喘的功效。

3.肺冲洗液之中的发炎细胞

在未致敏的健康小鼠，其肺中因无发炎现象，所以一般多存在巨噬细胞，几乎无嗜酸性白血球或嗜中性白血球的聚集。而在致敏的控制组小鼠，其肺中因有Th2细胞、肥大细胞以及巨噬细胞被活化并释放出特有的细胞激素与发炎介质，吸引嗜酸性白血球与嗜中性白血球的聚集，共同来造成肺部的发炎与气喘的发生。故本实施例检测肺冲洗液中各种发炎细胞种类。

在接受呼吸道过敏原刺激后，牺牲小鼠进行肺冲洗液的收集。将肺冲洗液離心，上清液取出置于-20℃保存，至于冲洗出来的细胞则用cytospin的机器将细胞打在玻片上后风干，接着进行刘氏染色，将染剂冲干净后玻片风干，之后由显微镜下计数不同视野下至少200颗细胞。依据染色结果及细胞型态來判定，将细胞分为四大類：巨噬细胞(macrophage)、淋巴(lymphocyte)、嗜酸性白血球(eosinophil)及嗜中性白血球(neutrophil)。

结果如图18所示，将试验组与控制组做比较，观察到在喂食低剂量组的小鼠，经由喂食可以有效减少巨噬细胞、嗜酸性白血球、嗜中性白血球以及淋巴球细胞浸润到肺中，明显减低发炎细胞的聚集；而高剂量组则是减少肺中嗜中性白血球以及淋巴球细胞的聚集。

4.H&E和PAS染色

评估实验动物肺部发炎反应状况小鼠牺牲后取出完整的肺组织，于1倍PBS中洗去多余的血水后，置于10％福尔马林溶液中固定。组织用石蜡包埋，经切片机切片成5μm厚度片后，固定于玻片后，进行Hematoxylin-Eosin(H&E)与Periodic acid–Schiff(PAS)染色，即可在显微镜下观察肺组织的病理变化。

H&E染色结果如图19所示，在控制组气喘小鼠肺部组织发炎与细胞浸润的情况非常明显(图19中的A图)，而在给予白及配伍1号低剂量(图19中的B图)及高剂量(图19中的C图)喂食组的小鼠，其肺部组织细胞聚集发炎的现象则有改善。

PAS染色结果如图20所示，肺叶中小支气管杯状细胞(goblet cell)增生状况以及黏液产生(紫红色区域)的情形。由图结果显示，控制组中杯状细胞增生与黏液产生有明显增加，反之在喂食白及配伍1号的两组，黏液产生则都有稍减少的现象。

5.肺冲洗液中细胞激素及发炎介质分泌量的测量

Interleukin-4(IL-4)可由CD4+Th2细胞和肥大细胞所分泌，其可刺激抗体IgE的产生。另外，CC趋化激素中的eotaxin可由肺部的内皮细胞、上皮细胞与T细胞所释放，其可吸引嗜酸性白血球在肺部聚集。因此，此实施例检测该等发炎介质的分泌量。

先收集肺冲洗液，以ELISA检测肺冲洗液中的细胞激素IL-4及发炎介质eotaxin浓度变化。分别取抗细胞激素IL-4及抗发炎介质eotaxin的抗体溶于缓冲液中，置于室温隔夜，隔天用洗涤缓冲液冲洗，加入填充缓冲液在室温下静置2小时，然后用洗涤缓冲液冲洗，加入待测的肺冲洗液在室温下作用，接着用洗涤缓冲液冲洗，加入biotin联结的抗细胞激素及发炎介质的抗体，室温下静置2小时后，用洗涤缓冲液冲洗，再加入酵素于室温下作用，之后用洗涤缓冲液冲洗，加入TMB呈色剂呈色，最后再加入stop solution来停止反应，以ELISA reader测特定波长吸光值来换算出待测液所含的浓度。

结果如图21显示，在与控制组比较之下，虽各剂量组分泌IL-4的量虽有降低的趋势，但尚无统计差异。至于在趋化激素eotaxin表现方面，相对于控制组，高剂量组可有效降低肺中趋化激素eotaxin的分泌量。

白及配伍1号in vivo对小鼠肺纤维化影响的动物模式

建立Bleomycin诱导肺纤维化小鼠与样品喂食方法

选用八周大的C57BL/6品系公鼠。小鼠随机分组，每组6只，实验期间自由摄食饮水及饲料。利用气管内滴注(intratracheal injection)方式一次性给予Bleomycin(1.5mg/kg)诱导小鼠肺纤维化。第3天后，开始每天以喂食针给予200μl两种不同剂量的白及及其他组合物共18天。小鼠共分为八组：PBS组、Bleomycin组、Bleomycin+低剂量白及组(6.25mg/kg)、Bleomycin+高剂量白及组(25mg/kg)、Bleomycin+低剂量白及配伍1号组(25mg/kg)、Bleomycin+高剂量白及配伍1号组(100mg/kg)、Bleomycin+低剂量白及玉米淀粉组(75mg/kg)及Bleomycin+高剂量白及玉米淀粉(300mg/kg)。经气管内滴注Bleomycin 21天后，进行牺牲，采集四片肺叶利用液态氮冷冻并保存，后续使用real time PCR检测纤维化基因及胶原蛋白表现；单一肺叶则保存于福尔马林中，后续利用组织病理染色评估改善肺纤维化的效果。实验中使用的Primer序列如前表4。

白及在剂量6.25及25mg/kg连续喂食18天并未对小鼠造成死亡的情形，而在Bleomycin诱导21天后，肺组织中纤维化相关基因(包括Collagen Type III及TGF-β1)皆显着提高，如图22中的A图及图22中的B图所示。然而不同剂量白及治疗下与没有治疗的Bleomycin-control组相比，纤维化相关基因皆显着降低，低剂量时即有显着抑制纤维化相关基因的表现；Collagen type III抑制率为58.9±14.9％；TGF-β1抑制率为61.6±17.6％。而高剂量白及喂食下亦有显着抑制纤维化相关基因的表现；Collagen type III抑制率为46.3±23.4％；TGF-β1抑制率为49.5±13.3％。Bleomycin诱导21天后，肺组织中总胶原蛋白表现量亦显着提高，PBS组：6.2±2.1μg/mg；Bleomycin组:35.1±9.1μg/mg，然而不同剂量白及治疗与没有治疗的Bleomycin-control组相比，总胶原蛋白量皆显着降低，如图22中的C图所示，低剂量时即有显着抑制总胶原蛋白的表现，其抑制率为73.3±8.4％，而高剂量白及喂食下亦有显着抑制总胶原蛋白的表现，其抑制率为67.0±10.7％。结果显示低剂量与高剂量白及治疗下，纤维化相关基因与总胶原蛋白表现量下降情形并无明显差异。

在Bleomycin-control组，肺泡壁明显增厚及发炎细胞浸润的情形非常明显，如图23所示，而在给予低剂量及高剂量的白及治疗组发现，肺泡壁增厚及发炎细胞浸润的情形明显改善，结果亦显示喂食低剂量白及组改善肺纤维化效果较高剂量组明显。

利用Masson’s trichrome staining可在富含胶原的构造，包括血管或纤维化的部位呈现蓝色。染色结果如图24所示，在给予Bleomycin-control组中肺泡壁增厚部位有明显观察到蓝色讯号，即代表有明显胶原堆积。而在给予低剂量及高剂量的白及治疗组发现，肺泡壁胶原堆积的情形明显改善，结果亦显示喂食低剂量白及组减少胶原堆积的情形较高剂量组明显。

而至于白及配伍1号在剂量25及100mg/kg连续喂食18天并未对小鼠造成死亡的情形，在Bleomycin-control组中，肺组织中纤维化相关基因，包括Collagen Type III及TGF-β1，皆显着提高，如图25所示。然而不同剂量白白及配伍1号治疗下与没有治疗的Bleomycin-control组相比，纤维化相关基因皆显着降低，低剂量时即有显着抑制纤维化相关基因的表现，其中Collagen type III抑制率为62.0±29.2％；TGF-β1抑制率为58.4±16.2％。高剂量白及配伍1号喂食下亦有显着抑制纤维化相关基因的表现，其中Collagentype III抑制率为63.2±28.7％；TGF-β1抑制率为63.6±21.2％。Bleomycin诱导21天后，肺组织中总胶原蛋白表现量显着提高，然而不同剂量白及配伍1号治疗与没有治疗的Bleomycin-control组相比，总胶原蛋白量皆显着降低，低剂量时即有显着抑制总胶原蛋白的表现，其中抑制率为67.8±6.9％；而高剂量白及配伍1号喂食下亦有显着抑制总胶原蛋白的表现，其中抑制率为81.7±7.5％。

透过H&E染色结果(如图26)亦可看到，给予Bleomycin-control组观察到肺泡壁明显增厚及发炎细胞浸润的情形非常明显，而在给予低剂量及高剂量的白及配伍1号治疗组发现，肺泡壁增厚及发炎细胞浸润的情形明显改善。

白及配伍1号处理后的Masson’s Trichrome染色结果(如图27)同样地也看出，在给予Bleomycin-control组中肺泡壁增厚部位有明显观察到蓝色讯号，即代表有明显胶原堆积。而在给予低剂量及高剂量的白及配伍1号治疗组发现，肺泡壁胶原堆积的情形皆明显改善。

白及配伍1号的萃取物质量标准

白及最佳配伍处方为白及：陈皮：白芷：五味子组成比例为1：1：1：1为白及配伍1号，进一步以管柱：LiChrospher 100RP-18e(4mm i.d.×250mm,5μm)；移动相：0.05％Trifluoroacetic acid-CH3CN(0分钟，95:5；50分钟，60:40；55分钟，60:40；56分钟，95:5；66分钟，95:5)；流速：1.0ml/min；管柱温度：40℃；检测波长：230nm，层析条件探讨活性成分的含量。

结果如图28的HPLC层析图谱及表格8显示，于滞留时间23.152分钟时出现波峰为Bleformin J其含量为0.89mg/g；滞留时间33.028分钟时出现波峰为Militarine其含量为21.59mg/g；滞留时间36.857分钟时出现波峰为Coelonin其含量为0.25mg/g；滞留时间45.623分钟时出现波峰为Batatasin III其含量为0.38mg/g；然而未检测到GymnosideVII。根据抗发炎活性试验结果，Coelonin的抑制作用最强，因此建议白及配伍1号的指标成分为Militarine及Coelonin。管柱层析的各成分滞留时间及含量如表8所示。

表8、白及配伍1号各化合物含量

在另一实施例中，该白及、陈皮、白芷及五味子的各药材先以重量比1:1:1:1比例一起混合，接着再以热水一起煎煮萃取。将煎煮后的产物进行NO抑制率及细胞存活率的测试。结果如图29所示，依照此比例的白及配伍1号具有显着抑制NO的能力，其IC50＝285.26±7.82，具有抗发炎的功效。此外，细胞存活率亦高达约90％，显示本实施例的配伍不具有细胞毒性。

Claims (10)

1.一种中草药组合物，其特征在于，包含：白及萃取物、陈皮萃取物、白芷萃取物、及五味子萃取物，其中该白及萃取物、陈皮萃取物、及五味子萃取物为水萃取，该白芷萃取物为酒精萃取或水萃取；白及萃取物、该陈皮萃取物、该白芷萃取物、及该五味子萃取物的比例为1-3：1-3：1-3：1-3。

2.如权利要求1的组合物，其特征在于，该比例为1：1：1：1。

3.如权利要求1的组合物，其特征在于，各该萃取物的浓度为25-500μg/ml。

4.一种中草药组合物用于制备改善肺功能的用途，其特征在于，该中草药组合物包含白及萃取物、陈皮萃取物、白芷萃取物、及五味子萃取物，其中该白及萃取物、陈皮萃取物、及五味子萃取物为水萃取，该白芷萃取物为酒精萃取或水萃取；白及萃取物、该陈皮萃取物、该白芷萃取物、及该五味子萃取物的比例为1-3：1-3：1-3：1-3。

5.如权利要求5的用途，其特征在于，该比例为1：1：1：1。

6.如权利要求4的组合物，其特征在于，各该萃取物的浓度为25-500μg/ml。

7.如权利要求5的用途，其特征在于，该改善的肺功能包括：抗肺纤维化、抗发炎、抗过敏、及缓解气喘。

8.如权利要求5的用途，其特征在于，该中草药组合物的浓度为20-400μg/ml。

9.如权利要求5的用途，其特征在于，该中草药组合物包含至少0.25mg/g的Coelonin。

10.一种中草药组合物，其包含以下述制备步骤所萃取的萃取物，其特征在于，(a)取白及、陈皮、白芷及五味子以重量比1:1:1:1比例混合形成一混合物；及

(b)以热水煎煮该混合物以获得一萃取物。