CN105524138A

CN105524138A - 薏苡仁源降压多肽及其应用

Info

Publication number: CN105524138A
Application number: CN201610041773.3A
Authority: CN
Inventors: 王灵芝; 乔延江; 李斌; 张燕玲; 李玲玲; 张小华
Original assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Current assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2036-01-22
Also published as: CN105524138B

Abstract

本发明公开了一种薏苡仁源降压多肽及其应用。该多肽的基酸序列如序列表中序列1所示。该多肽可用于制备血管紧张素转化酶抑制剂，可用于制备降压药物。本发明的多肽对血管紧张素转化酶具有明显的抑制作用，具有显著的降压效果。

Description

薏苡仁源降压多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种薏苡仁源降压多肽及其应用。

背景技术

薏苡仁为禾本科植物薏苡(Coixlacryma-jobiL.var.meyuan(Romen.)Stapf)的干燥成熟种仁，主产于福建、河北、辽宁等地。性甘、淡、微寒，归脾、胃、肺经。具有利水渗湿、健脾止泻、清热排脓、除弊的功效。《本草纲目》将其列为上品养心药。根据现代药理研究表明薏苡仁具有降压作用并可药食兼用，薏苡仁在临床上具有明确的降压疗效。

近年来，高血压患病主体越来越年轻化，患病率呈逐年增加的趋势。目前我国成人高血压患病率已达到25％-30％，成为世界上高血压患病大国。治疗高血压的药物多为化学合成药物，患者长期服用会产生各种各样的副作用。随着人们健康意识的不断提高，具有降压作用的非化学合成替代品日益受到人们的亲睐。

发明内容

本发明的目的是提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

本发明的多肽对血管紧张素转化酶具有抑制作用。

本发明的多肽具有降压作用。

本发明的多肽可用于制备血管紧张素转化酶抑制剂。

本发明的多肽可用于制备降压药物。

本发明的另一个目的是提供一种小分子量多肽提取物，其由如下方法制备：

将薏苡仁药材粉碎，脱脂，干燥，然后室温下使用硼酸钠缓冲液提取谷蛋白；将获得的谷蛋白溶解于胃蛋白酶溶液中，37℃进行水解，所述胃蛋白酶与所述谷蛋白的质量比为1:10；反应终止后离心，取上清液，过滤；采用截留分子量为3KDa的超滤膜在0.1Mpa下进行超滤，收集≤3KDa组分，获得所述小分子量多肽提取物，即下文中所述的≤3KDa组分。

本发明的又一个目的是提供一种多肽提取物，其由如下方法制备：

所述的小分子量多肽提取物经冷冻干燥，采用SephadexG-10进行凝胶过滤色谱(1.6×60cm)纯化；色谱条件为超纯水作为洗脱液，流速1mL/min，使用HD-4核酸蛋白检测仪在220nm下检测，收集出峰时间为75-100min的组分，获得所述多肽提取物，即下文中所述的组分F5。

本发明的又一个目的是提供一种具有增强免疫调节活性的保健食品，其包含所述的小分子量多肽提取物。

本发明的另一个目的是提供一种血管紧张素转化酶抑制剂，所述血管紧张素转化酶抑制剂的活性成分为所述的多肽、所述小分子量多肽提取物或所述多肽提取物。

本发明的又一个目的是提供一种降压药物，所述降压药物的活性成分为所述的多肽、所述小分子量多肽提取物或所述多肽提取物。

本发明的多肽、小分子量多肽提取物和多肽提取物对血管紧张素转化酶具有明显的抑制作用，具有显著的降压效果。

附图说明

图1显示了≤3KDa组分凝胶过滤色谱图。

图2显示了反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)的色谱图，

其中，a为HA对照品，b为HHL对照品，c为空白对照，d为卡托普利阳性对照，e为七肽GAAGGAF。

图3显示了七肽GAAGGAF单次给药SHR大鼠血压变化图。

图4显示了组分F5单次给药SHR大鼠血压变化图。

图5显示了≤3KDa组分单次给药SHR大鼠血压变化图。

图6显示了≤3KDa组分对腹腔巨噬细胞的ACP活性的影响，

其中，每个值表示为平均值±标准差；不同的字母表示显著差异(P<0.05)。

图7显示了≤3KDa组分对RAW264.7细胞中NO生成的影响，

其中，不同的字母表示显著差异(P<0.05)。

图8显示了重复给药21天后≤3KDa组分对小鼠体重的影响。

具体实施方式

本发明的发明人通过如下研究发现了可能具有血管紧张素转化酶抑制(ACEI)活性的七肽GAAGGAF：

薏苡仁药材(产地福建)经粉碎，过40目筛，石油醚脱脂，低温振荡4h，离心弃上清，真空干燥。使用0.0125M硼酸钠缓冲液(1％SDS，2％β-巯基乙醇，pH＝10.0)室温下从干燥后的薏苡仁粉末中提取谷蛋白。谷蛋白提取液于4℃低温透析24h，期间换水数次，谷蛋白液冷冻干燥获得谷蛋白。

准确称取谷蛋白(作为底物，浓度为2％(w/v)，胃蛋白酶与底物的比为1:10(w/w))，将其溶于胃蛋白酶溶液(0.01MHCl)中，37℃恒温水浴48h，反应结束后,100℃煮沸5min终止反应，冰浴至室温，在10000rmp，4℃离心，取上清液，经G4漏斗过滤。

经过G4漏斗的收集液，置于卷式膜小型实验机中进行超滤，其中卷式膜的截留分子量为3KDa，超滤压力为0.1Mpa，温度25℃。收集≤3KDa组分。

超滤所得的≤3KDa组分冷冻干燥，然后通过SephadexG-10(1.6×60cm)凝胶过滤色谱。色谱条件：超纯水为洗脱液，恒流泵调节流速1mL/min，使用HD-4核酸蛋白检测仪在220nm下检测，根据洗脱峰收集各组分。收集到分子量不同的5个组分，分别标记为组分F1-F5(如图1所示)。

使用高效液相色谱法对组分F1-F5进行体外ACEI活性的测定。

检测体外ACEI活性的原理为人工合成的三肽底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL，美国Sigma公司)，在ACE酶的作用下生成马尿酸，通过228nm检测马尿酸的生成量来评价ACEI活性。当ACE抑制剂与ACE作用后，ACE活性受到抑制，与HHL作用生成的马尿酸量减少，因此测定加入抑制剂前后马尿酸的生成量即可反映抑制剂对ACE的抑制程度。

反应体系：总反应液为50μL，其中样品溶液10μL、ACE溶液20μL(2mU)和HHL溶液20μL(2mM)。样品与ACE溶液充分混匀后，于37℃恒温水浴10min，加入HHL溶液充分混匀继续37℃保温60min，乙腈终止反应。反应液经C₁₈色谱柱(250×4.6mm,5μm,Tianhe)进行分析测定，色谱条件：柱温30℃，流速1mL/min，流动相：乙腈:水(0.05％三氟乙酸)＝25:75等度洗脱，进样体积10μL，检测波长228nm，根据HA的峰面积计算ACE抑制率，公式如下：

ACE抑制率(％)＝(b-a)/b×100％

式中，a为样品反应液HA的峰面积，b为空白对照液HA的峰面积

在终浓度为0.02mg/mL下，5个组分F1-F5的ACEI活性分别为68.60±0.21％，77.91±1.09％，70.50±1.12％，75.43±0.37％，84.75±0.42％。组分F5具有较高的体外ACEI活性(P＜0.05)，其IC₅₀＝14.6±0.58μg/mL。

组分F5经RP-HPLC分离。使用SymmetryPrepTMC₁₈column(7um，7.8×300mm)柱。色谱条件为：流速2mL/min，检测波长220nm；流动相A：超纯水(含0.1‰三氟乙酸，v/v)，流动相B：乙腈；洗脱条件：0-30min，5％-15％B；30-55min，15％-30％B。根据洗脱峰收集各组分，冷冻干燥。

RP-HPLC分离获得9个组分分别标记为F5-1至F5-9。在终浓度为0.01mg/mL下，F5-3具有较高的ACEI活性(60.06％)，F5-9具有较低的ACEI活性(9.61％)。进一步测得F5-3的IC₅₀＝9.80±0.02μg/mL。

组分F5-3通过基于TripleTOF5600的LC-ESI-MS/MS进行多肽序列分析，Mascot2.3.02软件搜索Uniprot和NCBInr数据库鉴定出6条多肽序列，分子量范围在756.40和1966.95之间。

对已鉴定的6个多肽进行构象分析，采用Best的方法(能量收敛值为20.0kcal/mol，最大构象数目为255个)得到多肽的多构象，进而分别与ACE药效团模型进行匹配。ACE药效团模型的特征主要包括一个氢键受体，一个氢键给体，一个疏水基团，一个负电离子化基团。

已鉴定的6个多肽分别与ACE药效团模型进行匹配，结果显示QSGDQQEF和VGQLGGAAGGAF与药效团模型完全匹配，适合值(Fitvalue)分别为0.97和0.96。

将匹配成功的多肽QSGDQQEF和VGQLGGAAGGAF进一步与4BZR、1O86、4CA5进行对接筛选。4BZR：配体K-26，-CDOCKER_ENERGY＝156.907；活性口袋半径1O86：配体赖诺普利(lisinopril)，-CDOCKER_ENERGY＝106.292；活性口袋半径4CA5：配体：膦三肽(phosphinictripeptide)FI，-CDOCKER_ENERGY＝102.324，活性口袋半径：综合分析多肽与药效团及分子对接模型的匹配结果，VGQLGGAAGGAF可能具有较高的ACEI活性。

将VGQLGGAAGGAF进一步进行模拟水解。采用BIOPEP和PeptideCutter软件对所获活性较高的多肽进一步进行模拟胃肠道消化酶(胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶)酶解。水解产生VGQ、VGQL、GGAAGGAF、GGAAGGA、L、F多肽及氨基酸。进一步对VGQ、VGQL、GGAAGGAF、GGAAGGA进行药效团匹配和与4BZR、1O86、4CA5进行对接筛选，结果显示GGAAGGAF与药效团完全匹配，与1O86对接成功，但与4BZR对接苯环位于活性口袋外，与4CA5对接显示，氨基位于活性口袋外面。因此，将GGAAGGAF进一步结构优化，基于药效团匹配结果苯环与药效团疏水性芳香基团相互作用，因此保留C端含有苯环的氨基酸，切除N端的氨基酸从而获得GAAGGAF。将GAAGGAF与药效团及分子对接模型筛选，结果显示：与药效团完全匹配，分子对接(4BZR、1O86、4CA5)成功。

在下文中，在实施例1中合成了七肽GAAGGAF，并验证了其确实具有ACEI活性，具有显著的降压效果。在实施例2中验证了组分F5确实具有ACEI活性，具有显著的降压效果。在实施例3中验证了≤3KDa组分确实具有显著的降压效果，具有增强免疫调节活性的作用。

实施例1.七肽GAAGGAF

(一)人工合成七肽GAAGGAF

在北京中科亚光生物科技有限公司人工合成七肽GAAGGAF。

(二)体外血管紧张素转化酶抑制(ACEI)活性检测

本实施例所用材料和仪器如无特殊说明均可从商业途径获得，例如：

马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)美国Sigma公司

马尿酸(HA)美国Sigma公司

血管紧张素转化酶(ACE)美国Sigma公司

卡托普利对照品中国药品生物制品检定所

分析型高效液相色谱仪Waters公司

采用高效液相色谱法进行ACEI体外活性的测定。

将七肽GAAGGAF溶于硼酸缓冲液(0.1M硼酸，0.3MNaCl，pH8.3)配制成样品溶液，反应体系为：10μL样品溶液、20μLACE和20μLHHL。样品溶液与ACE混合后37℃温育10min，加入HHL后继续温育60min，最后加入乙腈终止反应。以卡托普利为阳性对照，硼酸缓冲液为空白对照。

经C₁₈色谱柱(250×4.6mm，5μm，TIANHE)进行分析，流动相A为H₂O(含0.05％三氟乙酸，V/V)，B为100％乙腈，洗脱条件A：B＝75：25，流速1mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，在228nm下进行检测，根据HA峰面积计算ACE抑制率：

ACE抑制率(％)＝(b-a)/b×100

式中，a为在样品参与反应的条件下所产生的HA峰面积，b为空白对照所产生的HA峰面积。

反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)测定七肽GAAGGAF的体外ACEI活性的结果如图2所示。HA和HHL标准品分别在5.38和9.5min出峰(图2a，b)；空白对照无ACEI活性，因而生成较高量的HA；阳性对照在2×10^-8mol/L的浓度下的ACE抑制率为86.43±0.61％；七肽GAAGGAF(终浓度为1.46×10^-5mol/L)对ACE具有明显的抑制作用，经测定其IC₅₀＝14.19±0.34μM。

(三)七肽GAAGGAF单次给药药效学评价

卡托普利上海双基药业有限公司

原发性高血压大鼠(SHR)北京维通利华实验动物技术有限公司

BP-98A型大鼠无创血压测试仪北京软隆生物科技有限公司

原发性高血压大鼠(SHR)，9周，雄性，SPF，尾收缩压基本都在180mmHg以上。SHR大鼠均饲养于北京中医药大学动物室屏障环境内，实验前提前适应一周，在温度25℃，相对湿度50％的环境中喂养，12h光暗循环。均用标准饲料饲养，自由饮食和进水。

SHR随机分成5组，每组6只，分别为A：SHR空白对照组，B：SHR卡托普利阳性对照组，C：SHR高剂量组，D：SHR中剂量组，E：SHR低剂量组，灌胃给药，给药体积为5mL/kg动物，饲喂剂量如表1所示。

表1.七肽GAAGGAF单次给药实验给药剂量表

大鼠血压的测定：将大鼠按编号放入BP-98大鼠无创血压测定仪的保温袋内，38℃预热10min，待电脑监测器上出现稳定的大鼠脉搏波形图后，加压，保气10s后放气，记录波形图中收缩压(SBP)数值。如此反复数次，选取最接近的3个血压值，进行统计分析。

单次给药实验：按表1设计的剂量进行灌胃给药，分别在给药前(0h)和给药后2、4、6、8、10、12、24h测量大鼠尾动脉血压，观察各个实验组大鼠血压随时间变化情况。

单次给药实验SHR血压变化趋势如图3和表2所示。SHR卡托普利阳性对照组于4h血压下降至166.00±4.60mmHg，收缩压最多可下降28.17mmHg，降压作用时间可维持10h左右，12h后血压基本恢复常态。7.5mg/kgSHR低剂量组给药4h后血压降至最低值176.83±4.36mmHg，与给药前相比下降了15.67mmHg，12h基本恢复常态。15mg/kgSHR中剂量组给药4h后血压降至最低值165.67±3.56mmHg，血压下降了27.50mmHg左右。30mg/kgSHR高剂量组给药6h后血压降至最低值144.50±3.62mmHg，血压下降49.67mmHg左右，24h基本恢复。SHR空白对照组在整个测量时间内血压无显著变化。

由表2可知，给药2-10h后，各给药组SHR血压与SHR空白对照组相比差异均极显著。七肽GAAGGAF具有显著的降压效果。

表2.七肽GAAGGAF单次给药实验SHR大鼠血压测量值

注：与SHR空白对照组血压值比较，*代表差异显著(P＜0.05)，**代表差异极显著(P＜0.01)

实施例2.组分F5

卡托普利上海双基药业有限公司

原发性高血压大鼠(SHR)北京维通利华实验动物技术有限公司

BP-98A型大鼠无创血压测试仪北京软隆生物科技有限公司

SHR随机分成5组，每组6只，分别为A：SHR空白对照组，B：SHR卡托普利阳性对照组，C：SHR高剂量组，D：SHR中剂量组，E：SHR低剂量组，灌胃给药，给药体积为5mL/kg动物，饲喂剂量如表3所示。

表3.组分F5单次给药实验给药剂量表

单次给药实验：按表3的剂量进行灌胃给药，分别在给药前(0h)和给药后2、4、6、8、10、12、24h测量大鼠尾动脉血压，观察各个实验组大鼠血压随时间变化情况。

单次给药实验SHR血压变化趋势如图4所示。SHR卡托普利对照组血压下降至165.17±3.43mmHg，作用时间能维持10h左右，12h后血压基本恢复。25mg/kgSHR低剂量组给药4h后血压降至最低值176.83±3.00mmHg，整体下降11.5mmHg，10h基本恢复。50mg/kgSHR中剂量组给药4h后血压降至最低值171.50±5.32mmHg，血压下降20.33mmHg左右，12h基本恢复。100mg/kgSHR高剂量组给药6h后血压降至最低值163.33±4.63mmHg，血压下降26.84mmHg左右，24h基本恢复。SHR空白对照组在整个测量时间内血压无显著变化。由表4可知，给药2-6h后，各给药组血压与SHR空白对照组相比差异均极显著。

表4.组分F5单次给药实验SHR血压测量值

注：与CK组血压值比较，*代表差异显著(P＜0.05)，**代表差异极显著(P＜0.01)

实施例3.≤3KDa组分

胃蛋白酶美国Sigma公司

α-糜蛋白酶美国Sigma公司

胰蛋白酶美国Sigma公司

马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)美国Sigma公司

马尿酸(HA)美国Sigma公司

血管紧张素转化酶(ACE)美国Sigma公司

(一)溶解性评价

取0.5g≤3KDa组分冻干样品，加入15mL超纯水中，用1.0mol/LHCl和1.0mol/LNaOH溶液调节pH至2.0-12.0，室温下用1000r/min磁力搅拌器搅拌30min，10000rpm/min离心10min，测定上清液中多肽的含量。计算公式如下：

式中：M₁为样品质量；M₂为上清液中的多肽质量

≤3KDa组分在pH2.0-12.0范围内，其溶解度变化幅度较小，溶解度均大于70％(表5)，说明≤3KDa组分的溶解度基本不受pH的影响，具有较好的溶解性。

表5.≤3KDa的溶解性

(二)热稳定性评价

精确称量≤3KDa组分冻干粉，用超纯水配成1mg/mL的溶液，并调节pH为7.0，分别精确量取5mL并置于0℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的水浴中，保温2h，迅速取出冷却至室温，定容离心，然后分别取上清液测定其ACEI活性，每个温度下重复3次实验。

相同浓度(1mg/mL，pH＝7.0)的≤3KDa组分分别于0、20、40、60、80、100℃处理2h后，由表6可知，其ACE抑制率分别为63.54％、63.83％、62.60％、60.08％、62.56％、65.96％，结果表明在0-100℃不同温度条件下，其ACEI活性基本保持不变，具有较好的热稳定性。

表6.温度对≤3KDa组分的稳定性的影响

(三)pH稳定性评价

精确称量≤3KDa组分冻干粉，用超纯水配制成浓度为1mg/mL的溶液，分别精确量取5mL并用HAc-NaAc缓冲溶液调节pH为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，于37℃水浴中保温2h，分别定容离心取上清液测定其ACEI活性，每个pH值下重复3次实验。

相同浓度(1mg/mL)的≤3KDa组分分别于pH为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0的条件下，室温放置2h后，其ACEI活性存在一定的波动性(表7)。在pH2.0～6.0之间，随着pH值的增加，≤3KDa组分的ACEI活性也随之增大，当pH＝6.0时，具有最高的ACEI活性，其抑制率为66.37±0.70％；在pH6.0～12.0之间，随着pH值的增大其ACEI活性降低，当pH＝12.0时，≤3KDa组分的ACE抑制率最低(57.60±0.89％)，与最高值相差8.77％。因此，pH对≤3KDa组分的ACEI活性存在一定影响，但幅度不大，≤3KDa组分在强酸或强碱条件下能保持较完整的结构和活性。

表7.pH对≤3KDa组分的稳定性的影响

(四)耐酶稳定性评价

取适量≤3KDa组分冻干粉用超纯水配成1mg/mL溶液，分别精确量取25mL，加入0.05％(w/v)胃蛋白酶(0.1MHClpH＝2)、0.05％(w/v)胰凝乳蛋白酶(0.1MK₂HPO₄，pH＝8.0)、0.05％(w/v)胰蛋白酶溶液(0.1MK₂HPO₄，pH＝8.0)、0.025％(w/v)胰凝乳蛋白酶、0.025％(w/v)胰蛋白酶溶液(0.1MK₂HPO₄，pH＝8.0)，充分混匀，于37℃水浴保温模拟消化2.5h，煮沸5min终止反应，立即冷却至室温，用0.1MK₂HPO₄调pH＝8.0。分别取上述酶解液10000rpm离心10min，取上清液测定ACEI活性；在剩余的胃蛋白酶酶解液中加入0.025％(w/v)胰凝乳蛋白酶和0.025％(w/v)胰蛋白酶，混匀，于37℃水浴保温模拟消化2.5h，煮沸5min终止反应，立即冷却至室温，10000rpm离心10min，取上清液测定ACEI活性。同时以HCl和K₂HPO₄的混合溶液为空白对照，所有实验重复3次。

不同蛋白酶及组合酶的水解能够显著提高≤3KDa组分的体外ACEI活性(表8)。空白对照组的ACE抑制率为59.92±0.44％。经各种蛋白酶进一步消化后，≤3KDa组分的ACEI活性显著提高，其中胃蛋白酶(0.05％，w/v)、凝乳蛋白酶(0.025％，w/v)、胰蛋白酶(0.025％，w/v)连续酶解的≤3KDa组分ACE抑制率最高为78.98±0.28％，说明消化酶对≤3KDa组分进一步水解，可增强其ACEI活性。

表8.消化酶对≤3KDa组分的稳定性的影响

注：与空白对照组比较*p<0.05

(五)≤3KDa组分单次给药药效学评价

卡托普利上海双基药业有限公司

原发性高血压大鼠(SHR)北京维通利华实验动物技术有限公司

BP-98A型大鼠无创血压测试仪北京软隆生物科技有限公司

SHR随机分成5组，每组6只，分别为A：SHR空白对照组，B：SHR卡托普利阳性对照组，C：SHR高剂量组，D：SHR中剂量组，E：SHR低剂量组，灌胃给药，给药体积为5mL/kg动物，饲喂剂量如表9所示。

表9.≤3KDa组分单次给药实验给药剂量表

单次给药实验：按表9设计的剂量进行灌胃给药，分别在给药前(0h)和给药后2、4、6、8、10、12、24h测量大鼠尾动脉血压，观察各个实验组大鼠血压随时间变化情况。

单次给药实验SHR血压变化趋势图5所示。SHR卡托普利对照组血压下降至163.33±3.14mmHg，作用时间能维持8h左右，10h后血压基本恢复。100mg/kgSHR低剂量组给药4h后血压降至最低值174.33±3.33mmHg，血压下降12.84mmHg，8h基本恢复。200mg/kgSHR中剂量组给药4h后血压降至最低值168.83±3.82mmHg，血压下降20.50mmHg左右，10h基本恢复。400mg/kgSHR高剂量组给药4h后血压降至最低值160.83±3.31mmHg，血压下降27.67mmHg左右，10h基本恢复。SHR空白对照组在整个测量时间内血压无显著变化。由表10可知，给药2-6h后，各给药组血压与SHR空白对照组相比差异均极显著；给药8h后,除了3KDa组分低剂量组与SHR空白对照组相比差异显著之外,各给药组血压与SHR空白对照组相比差异均极显著。

表10.≤3KDa组分单次给药实验中SHR血压测量值

(六)≤3KDa组分免疫调节活性

ICR和BALB/c小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，所有动物在屏障环境中在22±2℃，50％±5％相对湿度，12小时光暗循环的条件下饲养。均用标准饲料饲养，自由饮食和进水。

脾细胞增殖试验(体外)

颈椎脱位处死BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄，SPF级)。在无菌环境下收集脾脏，置于含有3mLRPMI-1640的无菌培养皿中，采用无菌不锈钢筛网按压的方法获得脾细胞。收集细胞悬浮液并用红细胞裂解缓冲液处理后，用培养基洗涤两次，离心(1000转，4℃)5分钟。然后将获得的脾细胞重悬于RPMI-1640完全培养基(10％FBS，100U/mL青霉素和10μg/mL链霉素)中，采用台盼蓝染色法进行细胞计数，并调整细胞浓度至2.4×10⁶细胞/mL。

取100μL脾细胞接种于96孔平板中，分别加入终浓度为25、50、100和200μg/mL的≤3KDa组分，每孔终体积为150μL。RPMI-1640培养基和Con-A(10μg/mL)分别用作阴性对照和阳性对照，采用MTT比色法。平板在37℃、5％CO₂培养箱中孵育68h，然后每孔添加20μLMTT(1mg/mL)在相同条件下温育4小时。培养结束，弃上清液，每孔中加入DMSO(150μL/孔)。于570nm处测定吸光度。按照以下公式计算脾细胞增殖率：

增殖率＝(OD_T/OD_N-1)*100％

其中，OD_N＝空白对照的光密度值，OD_T＝试验样品的光密度值。

如表11所示，在Con-A(10μg/mL)的刺激下淋巴细胞的增殖反应显著改善。使用≤3KDa组分的处理与阴性对照相比提高了增殖率。25μg/mL的≤3KDa组分处理，最大的增殖率提高到15.60％。然而，≤3KDa组分对脾细胞的作用是非剂量依赖的，50μg/mL≤3KDa组分和100μg/mL≤3KDa组分的刺激作用与25μg/mL≤3KDa组分没有显著差异。相反，与低浓度(为25μg/mL)相比，≤3KDa组分浓度越高(150μg/mL和200μg/mL)，增加幅度相对较低。结果表明，≤3KDa组分具有促进小鼠脾细胞增殖的作用。

表11.≤3KDa组分对小鼠脾细胞增殖的影响

每个实验至少重复三次，所有数据均表示为平均值±标准偏差(SD)。不同的字母列代表显著差异(P<0.05)

腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶活性的测定

颈椎脱位处死ICR小鼠(25±2g，雌性，SPF级)，75％酒精处理60-90s。将小鼠腹部向上固定，腹腔注射5mL预冷的DMEM(3％FBS，100U/mL青霉素和10μg/mL链霉素)，轻轻按摩腹部5分钟。然后抽取培养基并离心(1000rpm，5分钟，和4℃)。重悬细胞于DMEM(10％FBS，100U/mL青霉素和10μg/mL链霉素)中，调整细胞浓度至2.4×10⁶细胞/mL。细胞悬浮液接种于96孔组织培养板，每孔100μL，培养板在37℃，5％CO₂下孵育4小时。除去未贴壁细胞，用培养基洗涤培养板三次。用不同浓度的≤3KDa组分(终浓度25、50、100和200μg/mL)分别处理腹腔巨噬细胞。DMEM和LPS(20μg/mL)分别作为阴性对照和阳性对照。

培养48h后，轻轻除去培养，用PBS洗涤两次。每孔加入100μL生理盐水(pH＝5.5)，通过在±20℃反复冻融裂解巨噬细胞。轻轻收集巨噬细胞裂解物，离心(10000rpm，10min，4℃)。使用BCA法测定总蛋白浓度。在520nm处测定光密度，根据试剂盒说明书测定ACP活性。按下式计算ACP活性：

ACP活性(磷酸酶效能单位/g蛋白)＝(OD_T-OD_B)/(OD_S-OD_B)*0.1/蛋白浓度

其中，OD_B：空白(双蒸水)对照的光密度值，OD_S：标准(酚，0.1mg/mL)的光密度值，OD_T：测试样品的光密度值(巨噬细胞裂解物)。

数据(如图6)表明，≤3KDa组分对小鼠腹腔巨噬细胞的ACP活性具有明显促进作用。与阴性对照组相比，不同浓度的≤3KDa组分的腹腔巨噬细胞的ACP活性均显著高于阴性对照的ACP活性，其中最高达73.46磷酸酶效能单位/g蛋白(25μg/mL≤3KDa)。然而，≤3KDa组分对ACP活性的作用是非剂量依赖的。此外，阳性对照组(20μg/mLLPS)的ACP活性显著高于空白对照组，也显著优于四个≤3KDa组分(P<0.05)。

RAW264.7培养液中的NO浓度测定

在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM中培养RAW264.7细胞至对数生长期。以2×10⁶个细胞/mL的密度、100μL的体积接种于96孔板中，孵育细胞24小时。然后弃上清液，细胞用≤3KDa组分和LPS处理48小时。使用NO检测试剂盒测定上清液中的NO，在550nm处测定吸光度。按下式计算NO浓度(N值)：

N(μmol/L)＝(OD_T-OD_B)/(OD_S-OD_B)*20*4

其中，OD_B＝空白(双蒸水)的光密度值，OD_S＝标准(亚硝酸钠，20μmol/L)的光密度值，OD_T＝测试样品的光密度值。

相比于空白对照组，LPS(20μg/mL)组大幅度增加RAW264.7细胞的NO含量，如图7所示的。≤3KDa组分对培养物上清液NO浓度的作用显示正剂量依赖性模式，最高数值为18.46μg/mL(100μg/mL≤3KDa组分)。另一个结果显示，≤3KDa组分能显著抑制RAW264.7细胞的LPS诱导的NO生成。

通过反复口服给药评价动物的免疫反应

将55只ICR(雄性，20±2g，SPF级)随机分为5组，即阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(V_C100mg/kg)，≤3KDa组分低剂量组(200mg/kg)，≤3KDa组分中剂量组(400mg/kg)和≤3KDa组分高剂量组(800mg/kg)。所有小鼠每日灌胃给药一次，灌胃时间持续3周，剂量为0.1mL/10g体重。每天记录症状。末次给药24h后，颈椎脱位处死ICR小鼠，取出肺、脾、胸腺和肝脏并称重。

以相对器官重量表示器官指数。

器官指数(mg/g)＝器官重量/空腹体重重量。

灌胃给药后每周记录一次体重，如图8所示，≤3KDa组分低剂量组和≤3KDa组分中剂量组均比空白对照组的体重略高，而给药后7天阳性对照组与≤3KDa组分高剂量组的小鼠体重均低于阴性对照组比，差异显著(P>0.05)。另外，在给药后14天和21天，≤3KDa组分中剂量组的小鼠的平均体重显著高于≤3KDa组分高剂量组(P<0.05)。

表12表明，≤3KDa组分的三组的脾指数以剂量依赖的方式增加，而只有高剂量组显示统计学上显著增加(P<0.05)。此外，胸腺指数在5组之间没有显著性差异。对于肝指数，除了≤3KDa组分高剂量组的肝指数显著高于阳性对照组(P<0.05)，其他两组与阴性和阳性对照相比无显著性差异。

表12.重复给药≤3KDa组分对小鼠器官指数的影响

不同的字母代表显著性差异(P<0.05)。

Claims

1.一种多肽，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽对血管紧张素转化酶具有抑制作用。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽具有降压作用。

4.权利要求1所述的多肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。

5.权利要求1所述的多肽在制备降压药物中的应用。

6.一种小分子量多肽提取物，其由如下方法制备：

将薏苡仁药材粉碎，脱脂，干燥，室温下用硼酸钠缓冲液提取谷蛋白；将获得的谷蛋白溶解于胃蛋白酶溶液中，37℃进行水解，所述胃蛋白酶与所述谷蛋白的质量比为1:10；反应终止后离心，取上清液，过滤；采用截留分子量为3KDa的超滤膜在0.1Mpa下进行超滤，收集≤3KDa组分，获得所述小分子量多肽提取物。

7.一种多肽提取物，其由如下方法制备：

将权利要求6所述的小分子量多肽提取物冷冻干燥，然后用SephadexG-10进行凝胶过滤色谱(1.6×60cm)纯化；色谱条件为超纯水作为洗脱液，流速1mL/min，使用HD-4核酸蛋白检测仪在220nm下进行检测，收集出峰时间为75-100min的组分，获得所述多肽提取物。

8.一种具有增强免疫调节活性的保健食品，其包含权利要求6所述的小分子量多肽提取物。

9.一种血管紧张素转化酶抑制剂，其活性成分为权利要求1所述的多肽、权利要求6所述的小分子量多肽提取物或权利要求7所述的多肽提取物。

10.一种降压药物，其活性成分为权利要求1所述的多肽、权利要求6所述的小分子量多肽提取物或权利要求7所述的多肽提取物。