CN114107414B - 一种发酵法制备苦瓜多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵法制备苦瓜多肽的方法，可有效解决现有制备方法苦瓜多肽得率低，多肽分子量大，多肽不易舌下吸收，制备的多肽复溶率低的问题，方法是，苦瓜籽预处理，米曲霉菌种活化，米曲霉液体培养基扩培；将扩培的菌种接种到苦瓜籽预处理料中，进行发酵，发酵完成后将发酵料干燥，粉碎；采用乙醇溶液提取苦瓜籽多肽，离心收集过滤，蒸馏，获得苦瓜多肽水溶液，加水调整溶液体积，用氨水调pH，离心，取上清液；用酸调pH值，加入无水乙醇，进行沉淀，收集沉淀，烘干得苦瓜多肽。本发明制备方法科学合理，易操作，使用效果好，产品得率高，分子量易于舌下吸收，不使用有机溶剂丙酮，明显提升产品复溶率，即保证了产品质量，又提高了药用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是属于天然产物提取技术领域的一种发酵法制备苦瓜多肽的方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。近几十年中，全球糖尿病患者的人数以惊人的速度迅速增长。据统计，2007年全球约2.46亿人患有糖尿病，预计到2030年，糖尿病患者将增长到3.8亿，且大部分集中于发展中国家。预计中国受糖尿病影响的人群达到9300万，目前已成为影响中国人身心健康的主要公共卫生问题。2002年中国无并发症Ⅱ型糖尿病的年人均直接医疗成本为13833.3元，全国城市Ⅱ型糖尿病及其并发症的年总成本为233.8亿元，其中，直接医疗成本为187.5亿元，占全国医疗卫生总费用的3.94%，直接非医疗成本为22.8亿元，间接成本为23.5亿元。
糖尿病给社会和家庭都带来了沉重的经济负担。针对糖尿病的发病机理情况，国外开发的许多西药存在一定的副作用。目前，口服药物主要包括磺脲类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素分泌促进剂、胰岛素增敏剂等，使用胰岛素，不易控制给药量，且长期使用会产生胰岛素抵抗。α-葡萄糖苷酶抑制剂最常见的不良反应是肠胃道副作用，如腹部不适、胀气、排气、腹泻等。磺脲类药物常见的不良反应有：食欲减退、恶心、呕吐、腹泻及腹痛等肠胃反应；皮肤瘙痒、红斑、寻麻疹、麻疹样皮疹或斑丘疹等皮肤反应；白细胞减少、粒细胞缺乏、血小板减少、溶血性贫血、再生不良性贫血及全血细胞减少等血液系统疾病；及中毒性肝炎等。使用胰岛素增敏剂药物，如曲格列酮，使心率危险性增加，并且对肝脏具有不同程度的毒性。
因此，如何进行糖尿病的防治保健，寻找安全、有效的治疗糖尿病的新功能物质，特别是从天然资源中去筛选和研究降糖成分，进行绿色降糖，已成为国内外医药工作者们所关注的重要课题和迫在眉睫的任务。在各种药食同源植物资源中，苦瓜作为一种极具开发潜力和开发价值的植物，引起了食品界和医学界专家们极大的兴趣。
苦瓜作为世界范围内的广泛种植的药食同源的植物，对其降血糖作用的进一步研究有助于资源的开发，减少患者的经济费用和副作用的发生。苦瓜降糖多肽降糖效果安全、可靠，无毒副作用，但其在肠道极易被降解。目前苦瓜多肽有口含片，其存在舌下吸收较慢，需长时间含服，服药顺应性差的缺点。其主要原因在于在制备方法上存在产品质量差，特别是产品分子量分布大，不易于舌下吸收，生产中使用有机溶剂丙酮，产品复溶率低，因此，苦瓜多肽制备方法的改进和创新势在必行。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种发酵法制备苦瓜多肽的方法，可有效解决现有制备方法苦瓜多肽得率低，多肽分子量大，多肽不易舌下吸收，制备的多肽复溶率低的问题。
本发明解决的技术方案是，一种发酵法制备苦瓜多肽的方法，包括以下步骤：
a）苦瓜籽预处理，米曲霉菌种活化，米曲霉液体培养基扩培；
所述米曲霉（Aspergillus oryzae）为产纤维素酶和/或脂肪酶和/或蛋白酶的米曲霉菌株（市售产品）；
b）将扩培的菌种接种到苦瓜籽预处理料中，进行发酵，发酵完成后将发酵料干燥，粉碎；
c）采用乙醇溶液提取苦瓜籽多肽，离心收集过滤，蒸馏，获得苦瓜多肽水溶液，加水调整溶液体积，用氨水调pH，离心，取上清液；
d）用酸调pH值，加入无水乙醇，进行沉淀，收集沉淀，烘干得苦瓜多肽。
本发明制备方法科学合理，易操作，使用效果好，产品得率高，分子量易于舌下吸收，不使用有机溶剂丙酮，明显提升产品复溶率，即保证了产品质量，又提高了药用价值。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种发酵法制备苦瓜多肽的方法，包括以下步骤：
a）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料或浸泡后的干苦瓜籽料碾碎成大小为0.5-1.5mm颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为55-75%，进行米曲霉菌种活化和米曲霉液体培养基扩培；
所述的米曲霉菌种活化是，将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，土豆培养基是，马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 15~20g，加蒸馏水1000mL制成（公知技术），然后将接种后的斜面或平板在26～30℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
所述的米曲霉液体培养基扩培，方法是，取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉10-30g、蛋白胨50g、苦瓜籽油2-8mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到23-27℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在26-30℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
b）将扩培菌种接种到预处理料的苦瓜籽中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为18-22︰1 g/mL，质量体积是指固体质量以g计，液体以mL计，进行发酵，温度28-32℃，湿度85-95%，发酵48-72h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
c）乙醇溶液提取苦瓜籽多肽，发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%乙醇浸没，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水悬浮，用氨水调pH 9.7，离心，得上清液；
d）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入等体积的无水乙醇，4℃下放置16小时，得沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，即得苦瓜多肽，多肽分子量分布在5-6kDa。
实施例2
本发明一种发酵法制备苦瓜多肽的方法，包括以下步骤：
a）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料或浸泡后的干苦瓜籽料碾碎成大小为0.8-1.2mm颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为60-70%，进行米曲霉菌种活化和米曲霉液体培养基扩培；
所述的米曲霉菌种活化是，将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，土豆培养基是，马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 15~20g，加蒸馏水1000mL制成（公知技术），然后将接种后的斜面或平板在27-29℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
所述的米曲霉液体培养基扩培，方法是，取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉15-25g、蛋白胨50g、苦瓜籽油4-6mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到24-26℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在27-29℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
b）将扩培菌种接种到预处理料的苦瓜籽中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为20︰1 g/mL，质量体积是指固体质量以g计，液体以mL计，进行发酵，温度30℃，湿度90%，发酵60h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
c）乙醇溶液提取苦瓜籽多肽，发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%乙醇浸没，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水悬浮，用氨水调pH 9.7，离心，得上清液；
d）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入等体积的无水乙醇，4℃下放置16小时，得沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，制得苦瓜多肽。
实施例3
本发明一种发酵法制备苦瓜多肽的方法，包括以下步骤：
1）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料或浸泡6h后的干苦瓜籽50kg，碾碎成大小为1.0mm颗粒，苦瓜籽的质量含水量为65%；
2）菌种活化：将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，土豆培养基是，马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 15~20g，加蒸馏水1000mL制成（公知技术），然后将接种后的斜面或平板在28℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
3）菌种扩培：取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉20g、蛋白胨50g、苦瓜籽油5mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到23-27℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在26-30℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
4）苦瓜籽发酵：将扩培菌种接种到预处理料的苦瓜籽中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为20︰1 g/mL，质量体积是指固体质量以g计，液体以mL计，进行发酵，温度30℃，湿度90%，发酵60h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
5）乙醇提取：发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%乙醇250L，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水100L悬浮，用氨水调pH 9.7，离心，得上清液；
6）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入无水乙醇100L，4℃下放置16小时，得沉淀，
7）沉淀用无水乙醇溶解洗涤3次，每次15min，回收乙醇，收集固体沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，即得苦瓜多肽。
实施例4
本发明一种发酵法制备苦瓜多肽的方法，包括以下步骤：
1）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料50kg，碾碎成大小为1.5mm颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为65%；
2）菌种活化：将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，然后将接种后的斜面或平板在28℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
3）菌种扩培：取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉10g、蛋白胨50g、苦瓜籽油2mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到25℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在26℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
4）苦瓜籽发酵：扩培菌种接种到预处理料的苦瓜籽中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为18︰1 g/mL，进行发酵，温度28℃，湿度85%，发酵48h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料40℃干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
5）乙醇提取：发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%乙醇250L，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水100L悬浮，用氨水调pH 9.7，离心，得上清液；
6）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入无水乙醇100L，4℃下放置16小时，得沉淀，
7）沉淀用无水乙醇溶解洗涤3次，每次15min，回收乙醇，收集固体沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，即得苦瓜多肽。
实施例5
本发明一种发酵法制备苦瓜多肽的方法，包括以下步骤：
1）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料50kg，碾碎成大小为0.8mm颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为65%；
2）菌种活化：将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，然后将接种后的斜面或平板在28℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
3）菌种扩培：取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉30g、蛋白胨50g、苦瓜籽油8mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到25℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在30℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
4）苦瓜籽发酵：扩培菌种接种到预处理料的苦瓜籽中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为22︰1 g/mL，进行发酵，温度32℃，湿度95%，发酵72h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料40℃干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
5）乙醇提取：发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%乙醇250L，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水100L悬浮，用氨水调pH 9.7，离心，得上清液；
6）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入无水乙醇100L，4℃下放置16小时，得沉淀，
7）沉淀用无水乙醇溶解洗涤3次，每次15min，回收乙醇，收集固体沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，即得苦瓜多肽。
本发明方法与现有方法制备的产品，经多肽得率、纯度、分子量及复溶率测定，有实质性区别，产品质量得到了明显提高，药用价值也得到了明显提高，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
与现有制备方法实验对比，本发明采用实施例3-5，对比组现有方法制备的产品，实验对比的现有方法是：
1）苦瓜籽预处理
选取干燥的苦瓜籽50kg，碾碎并粉碎成粉末。
2）乙醇提取
加250LpH值为9.5的75%的乙醇溶液，于22℃下浸泡提取24h，离心后过滤。滤液蒸馏回收乙醇，加100L水，用氨水调pH值至9.5，离心；
3）丙酮提取
取上清液，用1N的盐酸调pH值至3.5，加入45L丙酮，于4℃下放置16h，沉淀；
4）干燥粉碎
加适量无水乙醇脱洗，回收乙醇，收集固体沉淀，于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，制得苦瓜多肽。
A、本发明方法制备的多肽与现有方法制得的产品多肽得率测定：
多肽含量的测定：采用双缩脲法，以牛血清白蛋白V为标准绘制标准曲线，精确称取牛血清白蛋白V0.5000g，配制成5mg/mL标准蛋白溶液，取6支试管，编号1-6，一次加入标准蛋白溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，加蒸馏水补足至2.0mL，即蛋白质含量分别为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，各加入4.0mL双缩脲试剂，混匀后室温静置15min，于540nm下测定其吸光值，根据吸光值（y）与蛋白质含量（x）绘制标准曲线。建立的回归方程为y=4.028＋0.0428，R2=0.9987。根据得到的多肽含量计算苦瓜多肽纯度和得率。采用SDS-PAGE凝胶电泳对比marker测定苦瓜多肽主条带分子量分布范围并记录。
B、本发明方法制备的多肽与现有方法制得的产品复溶率测定：
称取实施例3-5和对比例制备份苦瓜多肽，放入试管中(每个样品三个平行实验)，加入用氨水调至pH为9.0的水5mL，超声震荡3min，4000rpm离心10min，倒去上清液，烘干试管至恒重，减去试管质量得到为溶解的苦瓜多肽质量，计算复溶率，测试结果见下表：
| 组别 | 得率（%） | 纯度（%） | 多肽主条带分子量分布范围kDa | 复溶率（%） |
| 实施例3组 | 15.23 | 97.2 | 5-6 | 98.6 |
| 实施例4组 | 14.86 | 97.2 | 5-6 | 98.4 |
| 实施例5组 | 15.02 | 97.0 | 5-6 | 98.5 |
| 对比例组 | 6.52 | 95.4 | 9-11 | 52.4 |
从上表可以清楚的看出，本发明方法制备的苦瓜多肽电泳主条带分子量分布在分子量5-6kDa范围内，而现有方法制备的苦瓜多肽电泳主条带分子量分布在分子量9-11kDa范围内，远大于本发明制备的分子量，不利于舌下吸收，影响服用效果，从复溶率的结果可以看出，现有方法制备工艺过程包含有机溶剂丙酮提取，其苦瓜多肽复溶率52.4%显著低于本发明组98%以上的复溶率，可见，有机溶剂丙酮对苦瓜多肽复溶率影响较大。
在对上述实施例进行实验时，同时还对其它实施例进行了实验，均取得了相同或相似的疗效，这里不再一一列举。而且在实验中未发现不良反应、药物刺激，表明用药安全，不但可以用于制备药物，还可用于制备食品和保健品，开拓了苦瓜的商业价值和经济价值，为工业化生产苦瓜多肽提供了技术保障，与现有技术相比，本发明苦瓜多肽的制备方法具有如下优点：
1.本发明所制备的苦瓜多肽分子量较低，大部分多肽分子量分布在5-6kDa之间，相较于传统苦瓜多肽更易于舌下吸收。
2.本发明采用的米曲霉作为菌种，采用米曲霉发酵后的苦瓜籽物料有利于苦瓜多肽的溶出，大大提高了多肽溶出率，得率高，得率提高1倍以上。
3.本发明苦瓜多肽的制备工艺与传统工艺相比，减少了有机溶剂脱脂工序，可降低由于有机溶剂处理过程中造成的苦瓜多肽复溶率低的问题，复溶率高达98%以上，同时减少了有机溶剂用量。
4.本发明所制备的低分子苦瓜多肽，口感较好无油腻感，且调节血糖能力较强。
Claims (5)
1.一种发酵法制备苦瓜多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料或浸泡后的干苦瓜籽料碾碎成大小为0.5-1.5mm的颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为55-75%，进行米曲霉菌种活化和米曲霉液体培养基扩培；
所述米曲霉（Aspergillus oryzae）为产纤维素酶和/或脂肪酶和/或蛋白酶的米曲霉菌株；
所述的米曲霉菌种活化是，将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，土豆培养基是，马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 15～20g，加蒸馏水1000mL制成，然后将接种后的斜面或平板在26～30℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
所述的米曲霉液体培养基扩培，方法是，取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉10-30g、蛋白胨50g、苦瓜籽油2-8mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到23-27℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在26-30℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
b）将扩培菌种接种到预处理的苦瓜籽料中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为18-22︰1 g/mL，质量体积是指固体质量以g计，液体以mL计，进行发酵，温度28-32℃，湿度85-95%，发酵48-72h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
c）乙醇溶液提取苦瓜籽多肽：发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%的乙醇浸没，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水悬浮，用氨水调pH值至9.7，离心，得上清液；
d）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入等体积的无水乙醇，4℃下放置16小时，得沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，即得苦瓜多肽，多肽分子量分布在5-6kDa。
2.根据权利要求1所述的发酵法制备苦瓜多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料或浸泡后的干苦瓜籽料碾碎成大小为0.8-1.2mm的颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为60-70%，进行米曲霉菌种活化和米曲霉液体培养基扩培；
所述的米曲霉菌种活化是，将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，土豆培养基是，马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 15~20g，加蒸馏水1000mL制成，然后将接种后的斜面或平板在27-29℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
所述的米曲霉液体培养基扩培，方法是，取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉15-25g、蛋白胨50g、苦瓜籽油4-6mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到24-26℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在27-29℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
b）将扩培菌种接种到预处理的苦瓜籽料中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为20︰1g/mL，质量体积是指固体质量以g计，液体以mL计，进行发酵，温度30℃，湿度90%，发酵60h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
c）乙醇溶液提取苦瓜籽多肽：发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%的乙醇浸没，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水悬浮，用氨水调pH值至9.7，离心，得上清液；
d）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入等体积的无水乙醇，4℃下放置16小时，得沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，制得苦瓜多肽。
3.根据权利要求1所述的发酵法制备苦瓜多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料或浸泡6h后的干苦瓜籽50kg，碾碎成大小为1.0mm的颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为65%；
2）菌种活化：将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，土豆培养基是，马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 15~20g，加蒸馏水1000mL制成，然后将接种后的斜面或平板在28℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
3）菌种扩培：取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉20g、蛋白胨50g、苦瓜籽油5mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到23-27℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在26-30℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
4）苦瓜籽发酵：将扩培菌种接种到预处理的苦瓜籽料中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为20︰1 g/mL，质量体积是指固体质量以g计，液体以mL计，进行发酵，温度30℃，湿度90%，发酵60h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
5）乙醇提取：发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%的乙醇250L，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水100L悬浮，用氨水调pH值至9.7，离心，得上清液；
6）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入无水乙醇100L，4℃下放置16小时，得沉淀；
7）沉淀用无水乙醇溶解洗涤3次，每次15min，回收乙醇，收集固体沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，即得苦瓜多肽。
4.根据权利要求1所述的发酵法制备苦瓜多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料50kg，碾碎成大小为1.5mm的颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为65%；
2）菌种活化：将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，然后将接种后的斜面或平板在28℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
3）菌种扩培：取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉10g、蛋白胨50g、苦瓜籽油2mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到25℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在26℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
4）苦瓜籽发酵：将扩培菌种接种到预处理的苦瓜籽料中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为18︰1 g/mL，进行发酵，温度28℃，湿度85%，发酵48h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料40℃干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
5）乙醇提取：发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%的乙醇250L，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水100L悬浮，用氨水调pH值至9.7，离心，得上清液；
6）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入无水乙醇100L，4℃下放置16小时，得沉淀；
7）沉淀用无水乙醇溶解洗涤3次，每次15min，回收乙醇，收集固体沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，即得苦瓜多肽。
5.根据权利要求1所述的发酵法制备苦瓜多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）苦瓜籽预处理：将新鲜苦瓜籽料50kg，碾碎成大小为0.8mm的颗粒，使苦瓜籽的质量含水量为65%；
2）菌种活化：将米曲霉菌种接种于经过无菌验证的土豆培养基的试管斜面或平板中，然后将接种后的斜面或平板在28℃下培养72h，得活化米曲霉菌种；
3）菌种扩培：取500mL的锥形瓶，添加液体培养基200mL，每升液体培养基中含有苦瓜籽粉30g、蛋白胨50g、苦瓜籽油8mL、硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、氯化钠0.5g和硫酸亚铁0.01g，将液体培养基进行湿热灭菌，灭菌温度121℃，时间为15min；培养基温度降到25℃，移至超净工作台，接入活化米曲霉菌种，在30℃恒温摇床中培养，摇床振荡频率为200r/min，培养时间为36h，得扩培菌种；
4）苦瓜籽发酵：将扩培菌种接种到预处理的苦瓜籽料中，苦瓜籽料与扩培菌种的质量体积比为22︰1 g/mL，进行发酵，温度32℃，湿度95%，发酵72h，发酵期间每8h翻拌一次，再将发酵料40℃干燥，粉碎，得干燥的发酵苦瓜籽粉；
5）乙醇提取：发酵苦瓜籽粉加入质量浓度85%的乙醇250L，22℃下浸泡提取30h，离心、过滤，滤液蒸馏回收乙醇，得固体物，固体物用水100L悬浮，用氨水调pH值至9.7，离心，得上清液；
6）调pH值：上清液用1N的盐酸调pH值至3.5，加入无水乙醇100L，4℃下放置16小时，得沉淀；
7）沉淀用无水乙醇溶解洗涤3次，每次15min，回收乙醇，收集固体沉淀，沉淀于44℃以下进行真空干燥，干燥后粉碎，过 100 目筛，即得苦瓜多肽。
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