CN111454342A - 一种苦瓜籽中降糖多肽k的提取方法 - Google Patents

一种苦瓜籽中降糖多肽k的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然活性物质提取技术领域，具体涉及一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法。一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，包括如下步骤：(1)称取苦瓜籽蛋白粉，装入试管中，然后再加入清水，摇匀，用NaOH溶液调节料液的pH值，然后置于超声波提取装置超声处理10min；(2)将装有料液的试管置于水浴中浸提，然后再将试管放在离心机中离心10min；(3)取上清液，用1M HCL调整pH值，静置30min，然后置于离心机中离心10min，收集沉淀；(4)再用2mL NaOH溶液溶解步骤(3)中所得沉淀，即获得降糖多肽K溶液。本发明的苦瓜籽中降糖多肽K的提取工艺简单，降糖多肽K提取率高，得到降糖多肽K产品的纯度和活性较好，为进一步筛选出多肽K的含量高的苦瓜品种，为开发苦瓜降糖功能产品提供依据。

Description

一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法
技术领域
本发明属于天然活性物质提取技术领域，具体涉及一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法。
背景技术
苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科苦瓜属一年生攀缘草本植物。具有较高的营养价值和保健功能，是一种药食同源的蔬菜。近年来，苦瓜种植面积逐渐增加，已成为“南菜北运”的主要蔬菜品种和特色产业。苦瓜富含多肽、多糖、皂苷、类黄酮等多种生物活性成分，具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力及预防肥胖等药用价值。近年来，随着人们生活水平的提高和消费观念的改变，Ⅱ型糖尿病和营养性肥胖成为影响人类身体健康的主要慢性疾病之一。但是改善血糖的药物普遍具有副作用，探寻天然有效的改善胰岛素抵抗药物迫在眉睫。苦瓜多肽能有效改善胰岛素抵抗状态，进一步减缓Ⅱ型糖尿病的发病进程，其中在类胰岛素研究方面降糖多肽P和降糖多肽K备受关注。
苦瓜降糖多肽K的分子量为18000kD，由18种氨基酸组成，性质比较稳定。经过小鼠和临床实验发现，降糖多肽K无需注射，口服就具有较好的降糖效果。但是关于苦瓜多肽K提取工艺，以及对不同品种苦瓜的多肽K含量比较研究尚未见报道。
因此，本发明的方法以苦瓜籽为原料，通过碱提酸沉法优化苦瓜多肽K提取方法，所得的降糖多肽K含量为0.18mg/g，不同的苦瓜品种间显著差异。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种产品纯度高、活性高、制备工艺简单的苦瓜降糖多肽K的提取方法，为进一步筛选出多肽K的含量高的苦瓜品种，为苦瓜降糖功能产品的开发提供依据。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，包括如下步骤：
(1)称取苦瓜籽蛋白粉，装入试管中，然后再加入清水，摇匀，用NaOH溶液调节料液的pH值，然后置于超声波提取装置超声处理10min；
(2)将装有料液的试管置于水浴中浸提，然后再将试管放在离心机中离心10min；
(3)取上清液，用1M HCL调整pH值，静置30min，然后置于离心机中离心10min，收集沉淀；
(4)再用2mL NaOH溶液溶解步骤(3)中所得沉淀，即获得降糖多肽K溶液。
作为优选，步骤(1)中苦瓜籽蛋白粉和清水的料液比为1:10-50。
作为优选，所述的苦瓜籽蛋白粉和清水的料液比为1:20。
作为优选，步骤(1)中NaOH浓度为0.1M，调节料液的pH值为9.5。
作为优选，步骤(1)中超声波提取装置的功率为380W，频率为100kHz。
作为优选，步骤(2)中水浴的温度为40-60℃。
作为优选，所述水浴的温度为50℃。
作为优选，步骤(2)中浸提的时间为30-120min。
作为优选，所述浸提的时间为60min。
作为优选，步骤(2)、步骤(3)中离心机的参数为：温度4℃，转速10000rpm。
作为优选，步骤(3)中上清液的pH值为3-7。
作为优选，所述上清液的pH值为3。
作为优选，步骤(4)中NaOH溶液的浓度为0.1M，调节料液的pH值为9.0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法工艺简单，降糖多肽K提取率高，得到降糖多肽K产品活性高，为进一步筛选出多肽K的含量高的苦瓜品种，为开发苦瓜降糖功能产品的提供依据。
附图说明
图1为苦瓜籽碱提酸沉法提取的蛋白电泳图；
有关附图标记的说明：
1-碱提酸沉的苦瓜籽蛋白；2-蛋白Marker；3-BSA。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1：
一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，包括如下步骤：
(1)称取苦瓜籽蛋白粉0.5g，装入试管中，然后再加入10mL清水，摇匀，加入NaOH溶液(0.1M)调节料液的pH值为9.5，料液比为1：20，置于超声提取装置中超声10min(超声波提取装置的功率为380W，频率为100kHz)；
(2)在50℃水浴上静置60min，然后在4℃，10000rpm离心10min；
(3)取上清液，用1M HCl调整pH值至3.0，静置30min，4℃，10000rpm离心10min，收集沉淀；
(4)用2mL NaOH溶液(0.1M，pH＝9.0)溶解所得沉淀，即获得多肽K溶液。
实施例2：
一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，包括如下步骤：
(1)称取苦瓜籽蛋白粉0.5g，装入试管中，然后再加入5mL清水，摇匀，加入NaOH溶液(0.1M)调节料液的pH值8.0，料液比为1：10，超声10min(超声波提取装置的功率为380W，频率为100kHz)；
(2)在40℃水浴上静置30min，然后在4℃，10000rpm离心10min；
(3)取上清液，用1M HCl调整pH值至3.0，静置30min，4℃，10000rpm离心10min，收集沉淀；
(4)用2mL NaOH溶液(0.1M，pH＝9.0)溶解所得沉淀，即获得多肽K溶液。
实施例3：
一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，包括如下步骤：
(1)称取苦瓜籽蛋白粉0.5g，装入试管中，然后再加入清水，摇匀，加入NaOH溶液(0.1M)调料液的pH值10.0，料液比为1：50，超声10min(超声波提取装置的功率为380W，频率为100kHz)；
(2)在60℃水浴上静置120min，然后在4℃，10000rpm离心10min；
(3)取上清液，用1M HCl调整pH值至7.0，静置30min，4℃，10000rpm离心10min，收集沉淀；
(4)用2mL NaOH溶液(0.1M，pH＝9.0)溶解所得沉淀，即获得多肽K溶液。
对照例：
以成熟苦瓜果实中的苦瓜籽的原料，手工将种籽剖开，用水彻底清洗后用吸水纸，吸干表面的水分，真空干燥，粉碎成细粉备用。用丙酮：己烷为1：2的溶剂混合物处理细粉，种仁粉末与丙酮己烷混合物的使用比例为1：2(m/v)，振荡摇匀，残留物溶解于20％丙酮，转速150r/m，18℃摇动6小时。加入氢氧化铵缓冲液，将pH调至9.5，获取上清液，用H2SO4调至pH至3，获取絮凝状沉淀，收集沉淀，用乙酸锌结晶，得到多肽K(参照专利CN100413884C)。
上述实施例1-3中苦瓜籽蛋白粉的酶解提取方法，具体操作步骤如下：
以授粉22天后的苦瓜籽为原料。将苦瓜种子干燥后，将未剥壳的苦瓜籽粉碎成细粉，过40目筛，备用；称取苦瓜籽细粉加入10倍量的水，室温下超声波提取装置提取20min后，水浴中保温6h；稀盐酸(1M)调整pH值到5.5；在料液中加入果胶酶0.2g，纤维酶1.0g，缓慢的搅拌均匀，置于53℃水浴中静置6h；边加边搅拌，用氢氧化钠溶液(1M)调整pH值到8.5；加入脂肪酶1.0g，缓慢的搅拌均匀，45℃水浴中静置12h；将溶液的pH值用氢氧化钠溶液(1M)调至9.5，静置3h；离心10min，取上清液，滤纸过滤；滤液用1M的盐酸调整pH值至3.0，静置6h以上；离心10min，弃去上清液，取沉淀；将沉淀至半透膜上，用10倍量的纯水洗去盐和其它杂质；将除杂后的蛋白用冻干法冻干，得到浅黄色的粉末，得到苦瓜籽蛋白粉，即为苦瓜籽的总蛋白。
3苦瓜籽蛋白的电泳分析
以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，分离胶浓度为4-20％，每个泳道蛋白上样量约为50ug，以广谱蛋白分子量Maker作为分子量大小的对照，以牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(1mg/mL)作为蛋白定量的对照，在110V电压下电泳90min。电泳后用考马斯亮蓝G250染色液染色60min，在纯水脱色16小时，直至背景清晰，拍照(详见图1)。蛋白电泳的结果采用分析软件Image Lab 6.0进行分析。
4苦瓜多肽K的纯化回收
染色后，将page胶上的目标蛋白条带用刀片切割下来，并剪成小碎块。将剪碎的胶在液氮下研磨成细粉，每0.05g胶粉加入蛋白裂解液(索莱宝，BC3720)0.5mL，冰上孵育25min，不时涡旋振荡，然后在4℃，14000rpm离心30min，收集上清液得到蛋白提取液。然后将蛋白提取液置透析袋中，4℃透析24小时，将透析后的蛋白液冻干，得到目标蛋白多肽K。
5苦瓜多肽K含量
Figure BDA0002465957210000051
CBSA：标准蛋白上样浓度(ug/uL)；
ABSA：标准蛋白电泳分析条带响应值；
Ak：多肽k电泳分析条带响应值；
n：样品稀释倍数；
L：样品上样量(uL)；
W：苦瓜籽粉末称样量(g)。
对实施例1、实施例2、实施例3和对照例中的提取方法提取得到多肽K的提取率和多肽K的纯度进行测定，统计。
表1本发明苦瓜籽多肽K的提取效果
Figure BDA0002465957210000061
由表1可知，本发明实施例1-3中的提取方法得到多肽K的提取率明显高于对照例，提取得到多肽K的纯度与对照例保持一致，均为95％。
表2不同苦瓜种子中籽粒和种壳的质量
Figure BDA0002465957210000062
由表2可知，不同苦瓜品种种子间的千粒重和种壳重具有明显差异，而籽粒重基本相当。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (9)

1.一种苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取苦瓜籽蛋白粉，装入试管中，然后再加入清水，摇匀，用NaOH溶液调节料液的pH值，然后置于超声波提取装置超声处理10min；
(2)将装有料液的试管置于水浴中浸提，然后再将试管放在离心机中离心10min；
(3)取上清液，用1M HCL调整pH值，静置30min，然后置于离心机中离心10min，收集沉淀；
(4)再用2mL NaOH溶液溶解步骤(3)中所得沉淀，即获得降糖多肽K溶液。
2.根据权利要求1所述的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，步骤(1)中苦瓜籽蛋白粉和清水的料液比为1:10-50。
3.根据权利要求1所述的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，步骤(1)中NaOH浓度为0.1M，调节料液的pH值为9.5。
4.根据权利要求1所述的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，步骤(1)中超声波提取装置的功率为380W，频率为100kHz。
5.根据权利要求1所述的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，步骤(2)中水浴的温度为40-60℃。
6.根据权利要求1所述的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，步骤(2)中浸提的时间为30-120min。
7.根据权利要求1所述的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(3)中离心机的参数为：温度4℃，转速10000rpm。
8.根据权利要求1所述的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，步骤(3)中上清液的pH值为3-7。
9.根据权利要求1所述的苦瓜籽中降糖多肽K的提取方法，其特征在于，步骤(4)中NaOH溶液的浓度为0.1M，调节料液的pH值为9.0。
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