CN116042504A - 枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用 - Google Patents

枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用 Download PDF

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岳坤
姜交华
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Guangzhou Sailaila Biological Gene Engineering Co ltd
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Guangdong Sailaila Stem Cell Research Institute
Guangzhou Sailaila Biological Gene Engineering Co ltd
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Abstract

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用。本发明提供了枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用，该方法包括匀浆、过滤、离心分离上清液和浓缩的步骤。本发明提供的制备枸杞细胞外囊泡的方法操作流程简单，纯度高，整体形态良好，且具有良好的生理功能。

Description

枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用。
背景技术
植物细胞外囊泡是由植物细胞分泌的纳米级小囊泡，内含DNA、小RNA(small RNA，sRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)和蛋白质等物质介导细胞间的通讯。植物细胞外囊泡具有体积小、组织穿透性强等优点，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性。另外植物细胞外囊泡兼具纳米载体的形态与特点，在生物相容性、稳定性、体内分布、延长半衰期和细胞内化等方面都表现出显著的优势。来源于药用植物细胞外囊泡富含各种具有生物活性的脂质、蛋白质、RNA等成分，在皮肤修复、免疫调节、抗炎抗感染与再生医学等方面具有显著的调控作用。
近年来，研究人员对植物细胞外囊泡进行了研究，发现植物细胞外囊泡具有多种特殊功效。如姜的外囊泡纳米粒子可降低炎性细胞因子(TNF-α，IL-6,IL-1β)表达，增加结肠炎模型中的抗炎细胞分子(IL-10,IL-22)的表达。小麦外囊泡对内皮细胞、上皮细胞和真皮成纤维细胞具有促增殖和迁移作用，增加了内皮细胞的管状结构形成，增强伤口愈合相关基因的表达，修饰协调血管的形成，促进伤口愈合。柑橘柠檬汁中外囊泡能通过诱导TRAIL介导的细胞死亡抑制肿瘤细胞生长而不影响正常细胞。葡萄柚产生的细胞外纳米囊泡装载甲氨碟呤递送给小鼠，能显著降低MTX毒性，并提高其在硫酸葡聚糖钠诱导的小鼠结肠炎中的治疗作用。
枸杞子(拉丁名Lycium chinense)为茄科植物枸杞的成熟果实，具有多种保健功效，是卫生部批准的药食两用食物。枸杞子药食同源历史悠久，是驰名中外的名贵中药材，具有延衰抗老的功效，又名“却老子”。枸杞子中含有多种氨基酸，并含有枸杞多糖、酸浆果红素、玉蜀黍黄素、核黄素、烟酸、维生素B1等特殊营养成分，使其具有非常好的保健功效。目前枸杞来源的细胞外囊泡尚未见报道，因此如何有效提取枸杞细胞外囊泡和其应用研究具有重要价值。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用。
本发明提供了枸杞细胞外囊泡制备方法，其包括：
步骤1：将枸杞果实与PBS缓冲液混合后，经匀浆、超声、过滤后，8000～12000g/min离心20～30min收集上清液A；
步骤2：所述上清液A过30kDa浓缩管，2000～3000g离心浓缩后，取浓缩液经8000g～12000g离心8min～12min，收集上清液B；
步骤3：所述上清液B于45000rpm～55000rpm离心85min～95min，分离获得细胞外囊泡；
其中，步骤1中所述枸杞与PBS缓冲液的质量体积比为1：(2.5～3.5)；所述匀浆的条件包括转速为8000～12000rpm，匀浆2～4次，每次50～70s；所述超声的条件包括：能量20％～30％，时间为15～25min。
本发明的方法中主要包括三个步骤，这三个步骤及其参数之间，比如离心转数、离心时间、超声的条件、实验温度、实验用料比之间彼此互相支持，存在相互作用，共同取得良好的制备枸杞细胞外囊泡的效果。所得的细胞外囊泡收率高，且生理活性良好。
本发明提供的方法，先对枸杞果实进行匀浆，在匀浆过程中添加PBS缓冲液，相对于添加水或其他缓冲液，添加PBS缓冲液能够更好维持细胞外囊泡的生理活性。
枸杞与PBS缓冲液的质量-体积比对提取效率产生影响，本发明实验表明，当枸杞与PBS缓冲液的质量-体积比接近1:4时，枸杞细胞外囊泡的得率显著降低，而在枸杞与PBS缓冲液的质量-体积比为1：3时，能够获得更高的收率。
为了更好的获得细胞外囊泡，采用匀浆的方式对枸杞组织进行破碎，本发明中，所述匀浆包括匀浆2～4次，每次50～70s。作为优选，所述匀浆的条件包括转速为10000rpm，匀浆3次，每次60s能够更好的配合其他参数，获得良好的细胞外囊泡提取效果。
枸杞经匀浆后，进行超声进一步破碎细胞结构，超声能量设置25％和超声时间20min时，能够在保证枸杞组织破碎的同时更好的维持细胞外囊泡的外形结构完整。
本发明在匀浆后经过过滤除去一部分杂质，然后再离心分离上清液，一些实施例中，步骤1中所述过滤的滤径为200目；所述离心的条件包括10000g/min离心30min，从而最大限度的保证减少杂质、提高收率。离心后获得的上清液可以直接用于细胞外囊泡的提取，也可以冻存后用于细胞外囊泡的提取。所述冻存的温度为-20℃，试验表明，冻存与否对提取效果并无显著影响。
本发明实施例中采用过滤离心的方式提取细胞外囊泡，上清液经2000～3000g离心过30kDa浓缩管，此后，浓缩液再经8000g～12000g离心8min～12min，本发明中，这样的离心参数搭配可以更有效分离去除上清和不溶性杂质，所得产物更纯净且不产生损失，同时所提取的细胞外囊泡具有更良好生理活性。作为优选，步骤2包括：所述上清液A过30kDa浓缩管，2500g离心浓缩后，取浓缩液经10000g离心10min，收集上清液B。
本发明提供的所述的方法中，步骤3所述离心的条件包括50000rpm离心90min。实验表明，当离心的条件包括50000rpm离心90min时，可以更好的与其他步骤参数配合，获得良好的细胞外囊泡制备效果。
本发明提供的所述的方法中，所述分离获得细胞外囊泡后，还包括以PBS缓冲液复溶后，过滤除菌的步骤。一些实施例中，所述过滤除菌使用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。
本发明提供的所述的方法中，步骤1～3中的温度为0～4℃。一些实施例中，所述步骤1～3中的温度为4℃，实验表明，当所述步骤1～3中的温度为4℃时，可以更好的与其他步骤参数配合，获得良好的制备效果。
本发明中，各个步骤的条件皆经过优化，优化后的参数在彼此配合，相互作用共同使制得的细胞外囊泡能够具有得率高、纯度高、杂质少、蛋白质含量高、形状规则完整、完整典型的膜结构、粒径分布集中、抗炎、抗氧化和/或促进细胞增殖功能良好的优势。
本发明还提供了所述制备方法制得的细胞外囊泡。一些实施例中，所述细胞外囊泡包括枸杞细胞外囊泡。
本发明所述的细胞外囊泡中，所述细胞外囊泡的直径分布于50nm～100nm，所述细胞外囊泡中的蛋白/枸杞果实重量约为24μg/g～34μg/g。一些实施例中，所述外囊泡的直径分布于60nm～80nm；一些具体实施例中，所述细胞外囊泡的直径分布于69.75nm；另一些具体实施例中，本发明所述细胞外囊泡中的蛋白/枸杞果实重量约为24μg/g～34μg/g。
本发明还提供了所述细胞外囊泡在制备舒缓、抗氧化、修护产品中的应用。一些实施例中，所述抗炎包括降低细胞中IL-6、IL-1β和/或TNF-α的水平。另一些实施例中，所述促进细胞增殖包括促进成纤维细胞的增殖，具体为促进成纤维细胞3T3的增殖。
本发明对细胞外囊泡进行了多方面的功效检测，能更好的了解枸杞细胞外囊泡的功能，达到充分应用的目的。
本发明所述的应用中，所述抗氧化包括清除自由基。一些实施例中，本发明所述枸杞细胞外囊泡自由基清除率约为23.5％。
本发明提供了舒缓、抗氧化和/或修护产品，其含有所述的细胞外囊泡。试验表明，该产品对肌肤无刺激，且具有良好的生理活性。
本发明所述的产品包括化妆品。
本发明所述化妆品，其包括所述的细胞外囊泡。一些实施例中，所述的化妆品包括冻干粉、面霜、面膜和精华等，要求pH在(4～8之间)在配方最后阶段加入。所述化妆品还包括化妆品机制，更进一步的，所述化妆品中还包括其他具有护肤功效的成分，例如保湿成分、补水成分、修复成分、淡斑成分、隔离成分和/或防晒成分。
本发明还提供了一种舒缓、抗氧化和/或修护的方法，其包括给予本发明所述的化妆品。
本发明提供了枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用，本发明制备枸杞细胞外囊泡的操作流程简单，纯度高，整体形态良好。参考蛋白检测数据，本方法枸杞细胞外囊泡提取率较高，根据电镜图和粒径分布图得出本发明方法分离得到的枸杞细胞外囊泡纯度高，整体形态良好。并且制备的枸杞细胞外囊泡多方面功效检测结果良好，其他方法分离到的细胞外囊泡存在没有膜结构，有效成分流失等缺点，检测结果显示本发明方法得到的细胞外囊泡纯度高，细胞增殖及抗炎效果更佳。对细胞外囊泡进行的多方面的功效检测，能更好的了解枸杞细胞外囊泡的功能，达到充分应用的目的，为枸杞细胞外囊泡的研究应用贡献了宝贵价值，并具有较好的工业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1示枸杞细胞外囊泡电镜图；
图2示枸杞细胞外囊泡粒径分布；
图3示IL-6基因相对表达量；
图4示IL-1β基因相对表达量；
图5示TNF-α基因相对表达量；
图6示枸杞细胞外囊泡对3T3细胞增殖影响；
图7示枸杞细胞外囊泡提取整体工艺流程图；
图8示优化过程中枸杞细胞外囊泡粒径分布图；
图9示优化过程中细胞外囊泡特征结构。
具体实施方式
本发明提供了枸杞细胞外囊泡制备方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
枸杞提取液制备：
1.取新鲜冷冻枸杞，置于匀浆机中，加入PBS缓冲液(枸杞：PBS缓冲液＝1:3/W:W破碎成匀浆(3次10000rpm，每次60s)，超声能量25％，超声20min。
2.使用200目滤袋过滤，滤液于4℃，10000g/min离心30min，收集上清，保存在-20℃。
枸杞细胞外囊泡提取：
1.枸杞PBS提取液分装入浓缩管中(膜为30kD)，于4℃，2500g/min离心浓缩。
2.浓缩液于4℃，10000g离心10min，除去杂质，收集上清。
3.步骤2中上清液转至离心管中，于4℃，50000rpm离心90min，得到枸杞细胞外囊泡(沉淀)。加入PBS缓冲液，充分吹打，在超净工作台将细胞外囊泡溶液用0.22μm滤膜过滤除菌备用。
对比例1
枸杞提取液制备：
1.取新鲜冷冻枸杞，置于匀浆机中，加入PBS缓冲液(枸杞：PBS缓冲液＝1:3/W:W)破碎成匀浆(3次5000r，每次1min)，超声能量25％，超声20min。
2.使用200目滤袋过滤，滤液于4℃，10000g/min离心25min，收集上清，保存在-20℃。
枸杞细胞外囊泡提取：
1.枸杞PBS提取液分装入浓缩管中(膜为30kD)，于4℃，2500g/min离心浓缩。
2.浓缩液于4℃，10000g离心10min，除去杂质，收集上清。
3.步骤2中上清液转至离心管中，于4℃，50000rpm离心90min，得到枸杞细胞外囊泡(沉淀)。加入PBS缓冲液，充分吹打，在超净工作台将细胞外囊泡溶液用0.22um滤膜过滤除菌备用。
对比例2
枸杞提取液制备：
1.取新鲜冷冻枸杞，置于匀浆机中，加入PBS缓冲液(枸杞：PBS缓冲液＝1:3/W:W)破碎成匀浆(3次10000r，每次1min)，超声能量25％，超声20min。
2.使用200目滤袋过滤，滤液于4℃，10000g/min离心25min，收集上清，保存在-20℃。
枸杞细胞外囊泡提取：
1.枸杞PBS提取液分装入浓缩管中(膜为30kD)，于4℃，2500g/min离心浓缩。
2.浓缩液于4℃，10000g离心10min，除去杂质，收集上清。
3.步骤2中上清液转至离心管中，于4℃，4 0000rpm离心60min，得到枸杞细胞外囊泡(沉淀)。加入PBS缓冲液，充分吹打，在超净工作台将细胞外囊泡溶液用0.22um滤膜过滤除菌备用。
枸杞细胞外囊泡提取：
实施例1所得细胞外囊泡检测：
通过透射电镜(TEM，JEM-1200EX)对提取得到的枸杞细胞外囊泡进行观察，其结果如图1所示，从图1中可以看到细胞外小囊泡。鉴于细胞外囊泡的直径约为30～200nm(实施例1提取的细胞外囊泡分布范围)，因此，实验者又利用仪器纳米流式检测仪(厦门福流生物)检测了上述细胞外囊泡的直径大小(检测的步骤是将细胞外囊泡稀释适当倍数，滴加到仪器上，打开程序开始检测，根据仪器读数就可以得到直径的大小分布)，如图2所示，从图2中可以看出大部分细胞外囊泡的直径都集中在50nm～100nm之内。通过测试证明了上述方法成功提取了枸杞细胞外囊泡。
对比例1～2所得细胞外囊泡检测：
对比例1:组织破碎不彻底，超高速离心转速低和离心时间短情况下(破碎5000r/min，3min，超声能量15％；离心40000rpm，60min)，得到的枸杞细胞外囊泡得率低，纯度不好，有杂质小颗粒，细胞外囊泡形状不完整(没有典型的膜结构)，部分破碎。对比例方案粒径分布在0nm～400nm之间，且粒径分布不集中(46nm,82nm,148nm,308nm均为主要检测出的粒径)。对比例2与此类似。
相应实验对比数据：根据得到的细胞外囊泡蛋白检测数据实施例1方法的蛋白得率高到达29μg/g，对比例1和2得到的细胞外囊泡蛋白得率约为16.4μg/g，实验者还摸索了其它参数，其他参数得到的细胞外囊泡蛋白得率均为16.4μg/g左右，距离29μg/g相差甚远，且对比例1方案的电镜图和粒径检测报告(形状不完整，没有膜结构，大多是不规则球状，粒径分布不集中)，功能检测效果不好；现有方法获得的枸杞细胞外囊泡蛋白的率高，形态完整，粒径分布集中，功能性检测结果良好(参考检测数据)。
枸杞细胞外囊泡蛋白含量检测：
通过使用Thermo PierceTMBCA Protein Assay Kit试剂盒对实施例1中获得的细胞外囊泡进行蛋白含量检测，结果表明，其产量约为29μg/g(细胞外囊泡中的蛋白/枸杞果实重量)。
效果验证
1、实施例1制得的枸杞细胞外囊泡抗氧化效果验证：
按照《T/SHRH006-2018《化妆品-自由基(DPPH)清除实验方法》团体标准测试方法》检测实施例1制得枸杞细胞外囊泡抗氧化功效，结果显示枸杞细胞外囊泡自由基清除率约为23.5％。
2、实施例1制得的枸杞细胞外囊泡红细胞溶血实验
通过测定血红蛋白漏出量及变性程度来评价化学品对眼组织细胞的损伤。取红细胞悬液与浓度为100mg/L的SDS溶液进行1:1混合，在32℃条件下孵育10min，孵育结束后在10000r/min条件下离心1min以终止反应。吸取上清液560nm处测定吸光度值(A3)；样品实验组参照下表1：
名称 <![CDATA[样品孔(A<sub>1</sub>)]]> <![CDATA[样品本底(A<sub>0</sub>)]]> <![CDATA[溶剂孔(A<sub>2</sub>，自溶血对照组)]]>
样品溶液(μL) 150 150 --
红细胞悬液(μL) 150 -- 150
PBS缓冲液(μL) -- 150 150
平行次数 3/样 1/样 3/样
按照如下公式计算：
Figure BDA0004029961210000081
Figure BDA0004029961210000091
枸杞细胞外囊泡溶血率为0.97％，判定为对皮肤无刺激。
3、实施例1制得的枸杞细胞外囊泡调节炎症因子表达效果验证：
RAW264.7细胞培养24h后，弃去各孔旧培养基，按照表2加入配制好的含细胞外囊泡的DMEM高糖基础培养基、阴性对照组、模型对照组的培养基，继续培养24h，收集上清液，用TransZol Up裂解细胞，吹打混匀后收集进行基因表达量检测。RNA抽提依照全式金TransZol Up进行；反转录依照全式金
Figure BDA0004029961210000092
One-Step gDNA Removaland cDNASynthesis SuperMix进行；qPCR扩增上机依照全式金PerfectStartTM Green qPCRSuperMix进行。
实验组参照下表2，实验结果如图3～5：
分组 样品名称 样品使用浓度(体积分数)
1 阴性对照组 / /
2 100ng/ml LPS(模型组) / /
3 100ng/ml LPS+样品 枸杞细胞外囊泡 0.1％
在众多炎症细胞因子中，TNF-α、IL-1β、IL-6是起主要作用的其中三个。与炎症模型比较，加入枸杞细胞外囊泡后，三个炎症因子表达均减少，仅添加0.1％枸杞细胞外囊泡就具有良好的抗炎效果。
4、实施例1制得的枸杞细胞外囊泡促细胞增殖效果验证：
按照4000个/孔的接种密度接种3T3细胞培养24h，设计阴性对照(高糖DMEM基础液)、阳性对照组(1％青链霉素、10％ FBS的DMEM高糖完全培养基)及实验组(DMEM高糖基础培养基)；每孔100ul体系，在高糖DMEM基础液中添加相应比例的细胞外囊泡，再按照分组分别加入阳性对照组、阴性对照组；继续培养48h后，直接加入CCK8(10ul/孔)，37℃避光孵育2h，在酶标仪上检测(450nm)OD值，结果如图6。与阴性对照组比较，枸杞细胞外囊泡具有明显的促细胞增殖效果。
结果表明：
1、实施例1制备枸杞细胞外囊泡操作流程简单，纯度高，整体形态良好，参考蛋白检测数据现技术枸杞细胞外囊泡提提取率高，根据前面电镜图和粒径分布图得出此方法分离得到的枸杞细胞外囊泡纯度高，整体形态良好。
2、制备的枸杞细胞外囊泡多方面功效检测结果良好，以对比例1或参数分离到的细胞外囊泡没有膜结构，有效成分流失，而实施例1分离获得的细胞外囊泡纯度高，细胞增殖及抗炎效果更佳，且对人体安全无刺激。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.枸杞细胞外囊泡制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：将枸杞果实与PBS缓冲液混合后，经匀浆、超声、过滤后，8000～12000g/min离心20～40min收集上清液A；
步骤2：所述上清液A过30kDa浓缩管，2000～3000g离心浓缩后，取浓缩液经8000g～12000g离心8min～12min，收集上清液B；
步骤3：所述上清液B于45000rpm～55000rpm离心85min～95min，分离获得细胞外囊泡，PBS缓冲液复溶，过滤除菌；
其中，步骤1中所述枸杞与PBS缓冲液的质量体积比为1：(2.5～3.5)；所述匀浆的条件包括转速为8000～12000rpm，匀浆2～4次，每次50～70s；所述超声的条件包括：能量20％～30％，时间为15～25min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中：
所述枸杞与PBS缓冲液的质量体积比为1:3；
所述匀浆的条件包括转速为10000rpm，匀浆3次，每次50～70s；
所述超声的条件包括：能量25％，时间为20min；
所述过滤的滤径为200目；
所述离心的条件包括10000g/min离心30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中：
所述离心浓缩的转速为2500g；
所述浓缩液于10000g离心10min，获得上清液B。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述离心的条件包括50000rpm离心90min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离获得细胞外囊泡后，还包括以PBS缓冲液复溶后，过滤除菌的步骤。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤1～3中的温度为0～4℃。
7.权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的细胞外囊泡。
8.根据权利要求7所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡的直径分布于50nm～100nm，外囊泡中的蛋白/枸杞果实重量为24μg/g～34μg/g。
9.权利要求7或8所述的细胞外囊泡在制备舒缓、抗氧化、修护的产品中的应用。
10.舒缓、抗氧化、修护的产品，其特征在于，含有权利要求7或8所述细胞外囊泡。
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