CN114432341A - 一种用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的制备方法，包括提取间充质干细胞可溶性因子与胞外囊泡混合物，分离可溶性因子与胞外囊泡；浓缩可溶性因子；制备包载可溶性因子的脂质体；将包载间可溶性因子的脂质体与天然胞外囊泡进行膜融合，得到杂化胞外囊泡。本发明研究发现杂化囊泡保留了天然囊泡表面的特征抗原，并且同体积培养基中得到的蛋白和核酸量为天然囊泡的100倍左右，显著提高了对间充质干细胞分泌的活性组分的利用效率，部分解决了天然囊泡产率低、成产成本高的问题。同时，杂化囊泡具有与天然囊泡相似的高原肺水肿干预效果，可用于预防和治疗其发生发展，具有良好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于高原肺水肿治疗技术领域，具体涉及一种用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的制备方法。
背景技术
高原极端低温、缺氧环境导致的高原肺水肿(High altitude pulmonary edema,HAPE)是一种非心源性肺水肿，主要表现为体力丧失、呼吸困难、肺部湿啰音、发绀、咳嗽、粉红泡沫痰等，为我国戍边部队与武警官兵带来极大生理挑战，是制约我国高原作战的重要因素之一。海拔3600米以上，HAPE的发病率为0.5％-2％，而训练和战时高强度运动会大大提高HAPE发生率和严重程度，甚至可造成发病人员快速死亡。因此，有效预防HAPE，减少由此导致的无谓牺牲，是提升我国边防训练和应急作战能力迫切需要解决的问题。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是具有自我更新和分化成多种细胞类型能力的多系细胞，通过旁分泌机制分泌可溶性因子及胞外囊泡(MSC ExtracellularVesicles，MSC-EVs)发挥抗炎、组织修复和维持组织稳态作用，可有效干预HAPE发生发展。但是MSC-EVs生产成本高、产量极低，严重制约了其临床大规模应用。因此，如何在保留MSC-EVs对HAPE干预能力的同时，提高其产量是其临床应用的关键问题。
MSC通过旁分泌可溶性因子与MSC-EVs发挥生理作用。其中可溶性因子具有与MSC-EVs相似的蛋白、核酸和脂质组成。因此，本发明提出一种间充质干细胞杂化胞外囊泡(MSCHybrid Extracellular Vesicles，MSC-HEs)的制备方法，以充分利用MSC分泌的可溶性因子与MSC-EVs，实现对HAPE的有效干预。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的制备方法，其包括，
培养间充质干细胞，以条件培养基提取MSC分泌的可溶性因子与MSC-EVs的混合物，将可溶性因子与MSC-EVs分离；
浓缩间充质干细胞分泌的可溶性因子；
制备包载间充质干细胞分泌的可溶性因子的脂质体；
将包载可溶性因子的脂质体与MSC-EVs进行膜融合，即得MSC-HEs。
作为本发明所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法的一种优选方案，所述间充质干细胞来源于人脐带、骨髓、脂肪、脐带血、羊膜、胎盘、牙髓、外周血等。
作为本发明所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法的一种优选方案，所述条件培养基中血清含量为0％-2％，优选0％。
作为本发明所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法的一种优选方案，所述可溶性因子与MSC-EVs的混合物提取方法为采用超滤离心管、超滤膜包、中空纤维膜/柱等超滤方法，截留分子量为1kDa-15kDa，优选截留分子量8kDa-12kDa，超滤后截留部分为可溶性因子与MSC-EVs的混合物，可通过超滤后向剩余物中补充纯化水反复超滤的方法提高培养基中小分子盐的去除效率。
作为本发明所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法的一种优选方案，所述可溶性因子与MSC-EVs的分离方法包括离心法、超滤法，超滤法可采用超滤离心管、超滤膜包、中空纤维膜/柱等，超滤材质截留分子量为50kDa-500kDa，优选截留分子量100kDa-200kDa，超滤后截留部分为MSC-EVs，超滤液为可溶性因子，可通过超滤后向剩余物中补充纯化水反复超滤的方法提高可溶性因子与MSC-EVs的分离程度，。
作为本发明所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法的一种优选方案，所述可溶性因子的浓缩可以采用超滤离心管、超滤膜包、中空纤维膜/柱等超滤方法，截留分子量为1kDa-15kDa，优选截留分子量8kDa-12kDa。
作为本发明所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法的一种优选方案，所述包载间充质干细胞分泌的可溶性因子的脂质体的制备方法为薄膜分散法、乙醇注入法、复乳法等，优选复乳法。
作为本发明所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法的一种优选方案，所述包载间充质干细胞分泌的可溶性因子的脂质体与MSC-EVs的膜融合方法可以选择超声、高压均质、膜挤出等方法，优选膜挤出法，膜孔径100-300nm，反复挤出2-10次。
作为本发明所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法的一种优选方案，取10mL人脂肪来源的间充质干细胞条件培养基(不含血清)，以截留分子量8kDa的超滤离心管离心分离，后以纯水补充超滤滤出液体量，反复超滤3次，以提高小分子盐的去除效率，截留物为MSC-EVs与可溶性因子混合物；将此混合物以截留分子量为100kDa的超滤离心管离心分离，后以纯水补充超滤损伤液体量，反复超滤3次以提高可溶性因子与MSC-EVs的分离效率，超滤后截留部分为MSC-EVs，超滤液为可溶性因子；以截留分子量8kDa的超滤离心管离心浓缩可溶性因子；以复乳法制备载可溶性因子的脂质体；将得到的脂质体与MSC-EVs混合，过200nm聚碳酸酯膜反复挤出10次，即得间MSC-HEs。
本发明的有益效果：本发明制备得到的MSC-HEs，保留了MSC-EVs的表面特性抗原，其蛋白和核酸产率为MSC-EVs的近100倍，同时可有效干预HAPE发生发展，即在大幅度提高产率的同时有效保留了对HAPE的干预作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为载MSC分泌的可溶性因子的脂质体粒径分布。
图2为MSC-HEs的粒径分布。
图3为MSC-HEs的透射电镜图。
图4为MSC-HEs的表面CD9和CD63的流式细胞检测。
图5为HAPE造模和预防、治疗措施的示意图。
图6为MSC-HEs干预后模型大鼠肺脏湿干比和肺脏指数。
图7为MSC-HEs干预后模型大鼠肺灌洗液中炎症因子水平。
图8为MSC-HEs干预后模型大鼠肺脏HE染色病理照片。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
人脂肪来源的MSC细胞培养：细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于含5％CO2的37℃恒温无菌孵育箱内进行培养。
MSC-EVs与MSC可溶性因子混合物的提取：取10mL人脂肪来源的间充质干细胞条件培养基(不含血清)，以截留分子量8kDa的超滤离心管离心分离，后以纯水补充超滤滤除液体量，反复超滤3次，截留物为MSC-EVs与可溶性因子混合物。
MSC-EVs与MSC可溶性因子混合物的分离：将此混合物以截留分子量为100kDa的超滤离心管离心分离，后以纯水补充超滤滤除液体量，反复超滤3次，超滤后截留部分为MSC-EVs，超滤液为可溶性因子；
可溶性因子的浓缩：以截留分子量8kDa的超滤离心管离心浓缩可溶性因子，浓缩至蛋白浓度至10mg/mL(BCA法测定)。
载可溶性因子的脂质体的制备：将3mL天然卵磷脂(20mg/mL)和胆固醇(10mg/mL)溶解于二氯甲烷中，加入1mL可溶性因子水溶液中，25000rpm高速剪切5分钟，形成W/O型初乳，加入10mL生理盐水，5000rpm剪切1分钟，形成复乳，高压均质(500bar)，通入氮气挥发二氯甲烷即得载可溶性因子的脂质体，粒径分布如图1所示，平均粒径为223nm。
MSC-HEs的制备：将得到的载可溶性因子脂质体与MSC-EVs混合，过200nm聚碳酸酯膜反复挤出10次，即得MSC-HEs。
MSC-HEs的表征：MSC-HEs粒径分布如图2所示，平均粒径为213nm。Zeta电位平均值为-11mV。图3为MSC-HEs的透射电镜照片，可见其形态圆整。如表1所示，以10mL的MSC条件培养基分别提取MSC-HEs和MSC-EVs，并将其浓缩到0.5mL，BCA试剂盒检测蛋白浓度，结果显示MSC-HEs中蛋白浓度为6300μg/mL，MSC-EVs中蛋白浓度为50μg/mL，表明MSC-HEs收得MSC分泌的蛋白成分产率为MSC-EVs的126倍；Hoechst荧光法和StrandBrite荧光法测定MSC-HEs中核酸浓度为2514μg/mL，而MSC-EVs为23μg/mL，表明MSC-HEs收得MSC分泌的核酸成分产率为MSC-EVs的110倍。采用聚乙烯亚胺和纳米金增加MSC-HEs粒径，流式细胞仪检测器表面CD9、CD63，如图4所示，虽然由于外源性脂质的稀释作用，MSC-HEs表面CD9和CD63的表达量低于MSC-EVs，但该结果证明MSC-HEs的杂化制备过程较完整地保留了MSC-EVs的表面特征抗原。
表1MSC-HEs的蛋白和核酸提取效率与MSC-EVs的对比
| 蛋白浓度(μg/mL) | 核酸浓度(μg/mL) | |
| MSC-EVs | 50 | 23 |
| MSC-HEs | 6300 | 2514 |
实验动物：雄性SD大鼠30只，体重约140-160g，由徐州医科大学动物实验中心提供，清洁级，标准饲养。该实验方案通过徐州医科大学动物伦理委员会批准。
HAPE造模和给药干预：如图6所示，SD大鼠置于低温低压试验箱内，海拔设置为6000m，每日8:00-20:00温度为10℃，20:00-8:00温度为4℃，自由进食和饮水，在试验箱内连续饲养7天，于第8天进行跑台力竭(约30分钟)。MSC-HEs给药：预防组于大鼠置于低温低压试验箱第1天开始，每天雾化吸入MSC-HEs，雾化条件为5mL培养基(蛋白浓度约1mg/mL)5min内雾化于8L雾化室，大鼠于雾化室吸入20min，连续吸7天，第8天跑台力竭30min后检测大鼠HAPE指标；治疗组为第8天跑台力竭30min后，立即雾化吸入MSC-HEs，雾化条件同预防组，并于其后每天雾化吸入一次，跑台力竭24h和48h后检测HAPE指标。
经过不同的干预后，解剖大鼠，按照公式1和公式2测定大鼠肺脏湿干比和肺脏指数，结果(图6)显示模型组大鼠肺脏湿干比由4.03(空白组)升高至8.12，表明HAPE大鼠肺部出现了显著水肿现象。MSC-HEs和MSC-EVs的预防组和治疗组均显著降低了大鼠肺脏湿干比。肺脏指数的数据(图6)也表明MSC-HEs和MSC-EVs降低了HAPE引起的大鼠肺脏指数的升高。图7为Elisa法测定的大鼠肺脏灌洗液中炎症因子含量。结果显示HAPE模型组TNF-α和IL-6分泌水平显著高于正常组，而MSC-HEs和MSC-EVs的干预显著降低了TNF-α和IL-6的分泌水平，同时提高了抗炎因子IL-10和Arg-1的分泌水平。图8为肺脏HE染色病理检查结果，结果表明HAPE组出现了非常明显的肺部充血和水肿现象(箭头所示)，而MSC-HEs和MSC-EVs各干预组均有效减少了出血和水肿现象。上述结果表明MSC-HEs和MSC-EVs均可显著干预HAPE的发生发展，并且MSC-HEs的作用效果同MSC-EVs无显著差别，具有与MSC-EVs相似的作用效果。
本发明利用脂质体包载MSC分泌的可溶性因子，与MSC-EVs进行膜融合制备MSC-HEs，研究发现MSC-HEs保留了MSC-EVs膜表面的特征抗原，并且同体积培养基中得到的MSC-HEs的蛋白和核酸量为MSC-EVs的100倍左右，显著提高了对MSC分泌的活性组分的利用效率，部分解决了MSC-EVs产率低、成产成本高的问题。同时，MSC-HEs具有与MSC-EVs相似的HAPE干预效果，可用于预防和治疗HAPE的发生发展，具有良好的临床应用价值。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：包括，
培养间充质干细胞，以条件培养基提取可溶性因子与胞外囊泡的混合物，将可溶性因子与胞外囊泡分离；
浓缩间充质干细胞分泌的可溶性因子；
制备包载间充质干细胞分泌的可溶性因子的脂质体；
将包载间充质干细胞分泌的可溶性因子的脂质体与胞外囊泡进行膜融合，即得间充质干细胞杂化胞外囊泡。
2.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：所述间充质干细胞来源于人脐带、骨髓、脂肪、脐带血、羊膜、胎盘、牙髓、外周血等。
3.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：所述条件培养基中血清含量为0％-2％，优选0％。
4.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：所述可溶性因子与胞外囊泡的混合物提取方法为采用超滤离心管、超滤膜包、中空纤维膜/柱等超滤方法，截留分子量为1kDa-15kDa，优选截留分子量8kDa-12kDa，超滤后截留部分为可溶性因子与胞外囊泡的混合物，可通过超滤后向剩余物中补充纯化水反复超滤的方法提高培养基中小分子盐的去除效率。
5.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：所述可溶性因子与胞外囊泡的分离方法包括离心法、超滤法，超滤法可采用超滤离心管、超滤膜包、中空纤维膜/柱等，超滤材质截留分子量为50kDa-500kDa，优选截留分子量100kDa-200kDa，超滤后截留部分为胞外囊泡，超滤液为可溶性因子，可通过超滤后向截留物中补充纯化水反复超滤的方法提高可溶性因子与胞外囊泡的分离程度。
6.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：所述可溶性因子的浓缩可以采用超滤离心管、超滤膜包、中空纤维膜/柱等超滤方法，截留分子量为1kDa-15kDa，优选截留分子量8kDa-12kDa。
7.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：所述包载间充质干细胞分泌的可溶性因子的脂质体的制备方法可为薄膜分散法、乙醇注入法、复乳法等，优选复乳法。
8.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：所述包载间充质干细胞分泌的可溶性因子的脂质体与胞外囊泡的膜融合方法可以选择超声、高压均质、膜挤出等方法，优选膜挤出法，膜孔径100-300nm，反复挤出2-10次。
9.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：取10mL人脂肪来源的间充质干细胞条件培养基(不含血清)，以截留分子量8kDa的超滤离心管离心分离，后以纯水补充超滤滤出液体量，反复超滤3次以提高小分子盐的去除效率，超滤离心管截留物为胞外囊泡与可溶性因子混合物；将此混合物以截留分子量为100kDa的超滤离心管离心分离，后以纯水补充超滤滤出液体量，反复超滤3次以提高分离效率，超滤后截留部分为胞外囊泡，超滤液为可溶性因子；以截留分子量8kDa的超滤离心管离心浓缩可溶性因子，截留部分为浓缩的可溶性因子；以复乳法制备载可溶性因子的脂质体；将得到的脂质体与胞外囊泡混合，过200nm膜反复挤出10次，即得间充质干细胞杂化胞外囊泡。
10.如权利要求1所述的制备用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的方法，其特征在于：该杂化胞外囊泡可用于高原肺水肿的预防和治疗，优选给药途径为雾化吸入给药。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109078020A (zh) * | 2018-09-26 | 2018-12-25 | 南开大学 | 一种防治肺损伤的干细胞来源的外泌体制剂 |
| WO2021113299A1 (en) * | 2019-12-04 | 2021-06-10 | United Therapeutics Corporation | Extracellular vesicles and their uses |
| CN113244173A (zh) * | 2021-04-06 | 2021-08-13 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109078020A (zh) * | 2018-09-26 | 2018-12-25 | 南开大学 | 一种防治肺损伤的干细胞来源的外泌体制剂 |
| WO2021113299A1 (en) * | 2019-12-04 | 2021-06-10 | United Therapeutics Corporation | Extracellular vesicles and their uses |
| CN113384597A (zh) * | 2020-03-13 | 2021-09-14 | 西比曼生物科技（上海）有限公司 | 含人体细胞衍生的细胞膜外囊泡的雾化吸入制剂、制法及其应用 |
| CN113244173A (zh) * | 2021-04-06 | 2021-08-13 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024019441A1 (ko) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | 주식회사 엠디뮨 | 세포 유래 베지클 및 리포좀 융합 하이브리드 나노입자 및 이의 용도 |
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