CN103479597B - 一种葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）葡萄原液的提取；（2）过滤；（3）上清液的提取；（4）纳米级均质处理。本发明还提供一种葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的用途，所述葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡应用于炎症性肠病的治疗。本发明采用葡萄原料制备膜性囊泡，具有原料来源丰富，成本低，可大量生产等优点，使规模化利用膜性囊泡成为现实。本发明制备的膜性囊泡能激活肠道干细胞，是胃肠道疾病的有效治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于药物研发领域，具体涉及纳米级膜性囊泡的制备及应用。
背景技术
膜性囊泡（exosomes）是一种可由多种细胞分泌的直径约为30-100nm的双层膜结构的杯状小囊泡。Exosomes能在细胞间传递蛋白、mRNA、microRNA等活性物质,参与许多重要的生理、病理过程,其独特作用受到越来越多关注。
目前exosomes主要从细胞培养上清、肿瘤组织的渗出液等材料中获取，分离方法主要有滤膜过滤法，超速离心法，蔗糖密度梯度离心法。从细胞培养上清等来源中获取exosome，材料来源有限，材料成本较高，所获得的exosomes含量很低，提纯后的exosomes成本更高，这就制约了exosomes的大规模工业化生产。因此，探索从来源丰富的原料中提取exosomes，使其能够实现生产成本降低及产量提高，对于exosomes的大规模应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种原料来源丰富、成本低、可大量生产的纳米级膜性囊泡的制备方法及其用途。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种葡萄来源活性成分－纳米级膜性囊泡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）葡萄原液的提取：将洗净的葡萄原料榨出汁液；
（2）过滤：将所述汁液过滤除去残渣，收集滤过的液体；
（3）上清液的提取：将过滤后的液体离心后收集上清液，再以离心方式收集沉淀，然后用缓冲液将沉淀重悬；
（4）纳米级均质处理：将经重悬处理后的物质均质化，进一步处理获得纳米级颗粒，即葡萄来源活性成分膜性囊泡。
优选的，所述上清液的提取步骤为：
先将过滤后的液体经过至少1次离心机离心，弃去沉淀，收集上清液；
将收集的上清液以1000～4000转/分钟的转速（RCF：90~1500×g ）离心5～40分钟，弃沉淀，收集上清；上清液2000～8000转/分钟（RCF：300~6000×g）离心10～50分钟，弃沉淀，收集上清；上清液6000～20000转/分钟（RCF：3000~240000×g）离心0.5～2小时弃沉淀，收集上清；上清液20000～50000转/分钟（RCF：150000~4000000×g）离心 0.1～3小时收集沉淀，用生理盐水或者磷酸缓冲液将沉淀重悬。
优选的，将经重悬处理后的物质用纳米级超高压均质机均质化或者振荡机振荡均质化，进一步处理获得纳米级颗粒，即葡萄来源活性成分膜性囊泡。
优选的，所述葡萄原液提取和过滤都在0~37摄氏度环境中进行。
优选的，所述过滤步骤采用10～12500目过滤材料过滤葡萄汁液。
优选的，所述过滤步骤为采用至少一种网孔直径的过滤材料，按照网孔直径由大到小依次过滤。
优选的，所述原液提取原料为葡萄。
本发明还提供一种葡萄来源活性成分—不同密度纳米粒子的制备方法，将均质处理后所得葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡，采用密度梯度离心，得到不同密度的样品条带，然后收集这些条带用生理盐水或磷酸缓冲液稀释，再以6000~200000转/分钟（RCF：3000~4000000×g）离心，收集沉淀，生理盐水或磷酸缓冲液重悬沉淀，超高压均质机均质化或者振荡机振荡均质化，就可得到不同密度的纳米粒子。
优选的，所述密度梯度离心是以蔗糖、氯化铯、氯化铷或溴化铯为密度梯度分离材料。
优选的，所述密度梯度为8%、30%、45%、60%或更多不同浓度的所述密度梯度材料溶液。
优选的，所述密度梯度的离心转速是20000~50000转/分钟（(RCF：150000~240000×g）。
优选的，离心时间为0.1～3小时。
本发明还提供葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的用途 ，其特征在于，所述葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡应用于炎症性肠病的治疗。
优选的，所述葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡应用于克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)的治疗。
本发明采用葡萄原料制备膜性囊泡，具有原料来源丰富，成本低，可大量生产等优点，使规模化利用膜性囊泡成为现实。
将本发明所述的葡萄纳米膜性囊泡用于体外激活肠道干细胞效果的评价：葡萄纳米膜性囊泡和小鼠肠道隐窝体外共培养，培养6天流式细胞术分析Lgr5+干细胞的百分比。
将本发明所述的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡用于治疗肠道损伤模型的效果评价：（1）小鼠饮水中加入3%硫酸葡聚糖钠（DSS），构建小鼠急性肠炎模型；（2）每天灌胃方式给药；（3）一部份小鼠7天处死，取出小肠，测量小肠的长度，病理切片观察肠道的损伤并测量小肠绒毛的高度，Real-time PCR分析不同基因的变化；(4)另一部分小鼠继续给药，观察小鼠的生存率。
上述利用本发明所述的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡和小鼠肠道隐窝体外共培养实验和作为口服药物治疗急性肠炎模型的实验证明该药物能有效激活肠道Lgr5+干细胞，促进肠道损伤的修复，延长小鼠的生存时间，这为临床治疗胃肠道疾病提供了新途径。
为了鉴定本发明制备的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡（纳米粒子）的结构及生物学功能，我们采用了电子显微镜观察粒子的结构，结果显示采用本发明方法制备的纳米粒子具有双层脂膜结构的纳米级囊泡；为了鉴定本发明制备的生物学功能，本发明进行了葡萄纳米膜性囊泡促进小肠隐窝体增殖的体外培养实验和葡萄纳米膜性囊泡保护DSS诱导的急性肠炎小鼠的体内实验。结果显示采用本发明方法制备的纳米粒子能在体外促进隐窝增殖并且隐窝中LGR5+干细胞的百分含量显著增加；体内实验结果显示葡萄纳米膜性囊泡能存进肠炎小鼠肠道组织中的干细胞相关基因的表达并促进肠道组织的修复，延长小鼠的生存时间。
用本发明方法制备的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡的优点是：
(1) 结构稳定。采用本发明方法生产的膜性囊泡具有和细胞分泌的exosomes相同的结构，如：双层脂膜结构。
(2) 从葡萄中制备的纳米粒子能激活肠道干细胞，可作为胃肠道疾病的有效治疗药物。
附图说明
图1 是实施例1中从葡萄中分离获得的纳米级膜性囊泡电子显微镜观测图。
图2 A是实施例5中葡萄纳米膜性囊泡促进小肠隐窝体增殖结果柱状图。
图2B是实施例5中葡萄纳米膜性囊泡体外促进隐窝中LGR5+干细胞增殖的流式细胞术分析结果图。
纵坐标:：前向角散射光强度（Forward scatter, 简写FCS）,
横坐标：LGR5-EGFP的增殖结果。
图3是实施例6中葡萄纳米膜性囊泡在肠炎模型中提高小鼠的生存率结果图。
图4A 是实施例6肠炎模型中实验鼠小肠长度比较图。
图4B是实施例6实验鼠小肠病理切片图。
图4C是实施例6实验鼠小肠绒毛高度比较图。
图4D是实施例6 实验鼠Real-time PCR分析结果图。
图5是实施例7中蔗糖密度梯度离心示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡的制备。
（1）清水洗净的红葡萄在25摄氏度环境中通过采用挤压式压榨机榨出汁液。
（2）榨出的汁液经12500目滤网过滤（在37摄氏度环境中操作），收集过滤的液体。
（3）将收集的液体以4000转/分钟离心5分钟，弃沉淀，收集上清；此上清液以2000转/分钟离心50分钟，弃沉淀，收集上清；此上清液再以50000转/分钟离心0.5小时，弃沉淀，收集上清；此上清液再以50000转/分钟离心0.1小时后收集沉淀，此收集的沉淀用磷酸缓冲液重悬。
（4）将经重悬处理后的物质用纳米级超高压均质机均质化处理获得纳米级颗粒。
（5）分装样品，纳米膜性囊泡可在-80℃低温冰箱长期保存。
为了鉴定本发明制备的膜性囊泡的结构及生物学功能，我们采用了电子显微镜观察了粒子的结构，结果显示采用本方法制备的纳米粒子具有双层脂膜结构的纳米级囊泡，如图1所示。
实施例2
葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡的制备。
（1）清水洗净的红葡萄在20摄氏度环境中通过采用挤压式压榨机榨出汁液。
（2）榨出的汁液经7500目滤网过滤（在30摄氏度环境中操作），收集过滤的液体。
（3）将收集的液体以2000转/分钟离心30分钟，弃沉淀，收集上清；此上清液以3000转/分钟离心40分钟，弃沉淀，收集上清；此上清液以10000转/分钟离心1.5小时，弃沉淀，收集上清，此上清液再以30000转/分钟离心 2.5小时后收集沉淀，所述沉淀用生理盐水重悬。
（4）将经重悬处理后的物质用纳米级超高压均质机均质化处理获得纳米级颗粒。
（5）分装样品，纳米膜性囊泡可在-80℃低温冰箱长期保存。
实施例3
葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡的制备。
（1）清水洗净的红葡萄在8摄氏度环境中通过采用挤压式压榨机榨出汁液。
（2）榨出的汁液经5000目滤网过滤（在20摄氏度环境中操作），收集过滤的液体。
（3）将收集的液体以3000转/分钟离心20分钟，弃沉淀，收集上清；上清液5000转/分钟离心30分钟，弃沉淀，收集上清；上清液30000转/分钟离心1小时弃沉淀，收集上清。上清液20000转/分钟3小时收集沉淀，用磷酸缓冲液重悬沉淀。
（4）将经重悬处理后的物质用纳米级超高压均质机均质化处理获得纳米级颗粒。
（5）分装样品，纳米膜性囊泡可在-80℃低温冰箱长期保存。
实施例4
葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡的制备。
（1）清水洗净的红葡萄在4摄氏度环境中通过采用挤压式压榨机榨出汁液。
（2）榨出的汁液经10目、100目、500目滤网从大到小依次过滤（在10摄氏度环境中操作），收集过滤的液体。
（3）将收集的液体以1000转/分钟离心40分钟，弃沉淀，收集上清；上清液8000转/分钟离心10分钟，弃沉淀，收集上清；上清液6000转/分钟离心2小时弃沉淀，收集上清。上清液40000转/分钟离心 1小时收集沉淀，磷酸缓冲液重悬沉淀。
（4）将经重悬处理后的物质用振荡机振荡均质化处理获得纳米级颗粒。
（5）分装样品，纳米膜性囊泡可在-80℃低温冰箱长期保存。
实施例5
隐窝体外培养实验。
分离获得的Lgr5-EGFP-ires-creERT转基因小鼠肠道隐窝和Matrigel（基底膜基质）混合加入24孔培养板，每孔按500个隐窝和50μl Matrigel混合加入。实验组Matrigel中拌入不同浓度的葡萄纳米膜性囊泡，对照组加入PBS（磷酸缓冲液）。培养基采用DMEM/F12，并在其中添加10ng/ml EGF, 500 ng/ml R-spondin 1 和100 ng/ ml Noggin。培养6天后，隐窝采用TrypLE express和DNase （2,000U/ml）37°C消化30分钟制备单细胞悬液，采用流式细胞术分析肠道干细胞的百分率。
另一部分采用3H掺入法检测隐窝的增殖，结果如图2A所示，葡萄纳米膜性囊泡能促进小肠隐窝体增殖的体外增殖。
流式分析结果如图2B所示。通过分析LGR5-EGFP阳性细胞浓度，可知LGR5-EGFP阳性细胞百分比显著增加并有剂量依赖效应，葡萄纳米膜性囊泡浓度在40 μg/ml时效果最明显，这说明葡萄纳米膜性囊泡能促进隐窝中LGR5阳性干细胞的增殖。
实施例6
葡萄纳米膜性囊泡激活肠道干细胞，治疗有关肠道损伤疾病（炎症性肠病，肠溃疡等）的应用。
其具体实施包括下述步骤：
（1）6周龄C57BL/6J小鼠饮水中加入3%硫酸葡聚糖钠（DSS），构建小鼠急性肠炎模型。
（2）葡萄纳米膜性囊泡按0.05g/kg体重，以灌胃方式给药，每天一次。对照组小鼠给予同等体积的PBS。
（3）一部分小鼠7天后处死，取出肠子，测量小肠及大肠的长度；Real-time PCR分析不同基因的变化，病理切片观察肠道的损伤。
（4）另一部分小鼠继续给药，观察小鼠的生存率。
结果如图3所示，给药的小鼠生存率明显提高。通过测量小肠的长度（图4A)病理切片观察 (图4B)并测量小肠绒毛的高度(图4C)发现，给药后小鼠的肠道损伤显著减轻，葡萄纳米膜性囊泡对肠道的保护作用非常明显。Real-time PCR分析结果（图4D）显示，给药后小鼠肠道干细胞相关基因明显激活。
实施例7
用按照本发明方法所制备的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡提纯不同密度的纳米囊泡（即纳米粒子），在离心管中依次加入不同浓度的蔗糖溶液，采用密度梯度为8%、30%、45%、60%的蔗糖溶液，样品置于蔗糖密度梯度溶液表面，然后以20000转/分钟超速密度梯度离心3小时，离心后在不同浓度蔗糖溶液之间有不同密度的样品条带，收集这些条带，用生理盐水稀释后100000转/分钟离心，收集沉淀，用生理盐水重悬，再经超高压均质机均质化，即得到不同密度的纳米囊泡（纳米粒子），如图5所示。
实施例8
用按照本发明方法所制备的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡提纯不同密度的纳米囊泡（即纳米粒子），在离心管中依次加入不同浓度的蔗糖溶液，采用密度梯度为8%、30%、45%、60%的蔗糖溶液，样品置于蔗糖密度梯度溶液表面，然后以30000转/分钟超速密度梯度离心2小时，离心后在不同浓度蔗糖溶液之间有不同密度的样品条带，收集这些条带，用磷酸缓冲液稀释后6000转/分钟离心，收集沉淀，磷酸缓冲液重悬沉淀，经振荡机振荡均质化，即得到不同密度的纳米囊泡（纳米粒子）。
实施例9
用按照本发明方法所制备的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡提纯不同密度的纳米囊泡（即纳米粒子），在离心管中依次加入不同浓度的氯化铯溶液，采用密度梯度为10%、20%、30%、40%的氯化铯溶液，样品置于氯化铯密度梯度溶液表面，然后以40000转/分钟超速密度梯度离心1小时，离心后在不同浓度氯化铯溶液之间有不同密度的样品条带，收集这些条带，生理盐水或磷酸缓冲液稀释后40000转/分钟离心，收集沉淀，生理盐水重悬，超高压均质机均质化，即得到不同密度的纳米囊泡（纳米粒子）。
实施例10
用按照本发明方法所制备的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡提纯不同密度的纳米囊泡（即纳米粒子），在离心管中依次加入不同浓度的氯化铷溶液，采用密度梯度为10%、20%、40%、60%的氯化铷溶液，样品置于氯化铷密度梯度溶液表面，然后以50000转/分钟超速密度梯度离心0.1小时，离心后在不同浓度氯化铷溶液之间有不同密度的样品条带，收集这些条带，磷酸缓冲液稀释后50000转/分钟离心，收集沉淀，磷酸缓冲液重悬，振荡机振荡均质化，即得到不同密度的纳米囊泡（纳米粒子）。
实施例7~10中的密度梯度可以是蔗糖、氯化铯、氯化铷或溴化铯为梯度材料。
离心转速不限于实施例中的所提到的具体数值，可以在权利要求和发明内容中所指出的相应转速范围内任意变化。
本发明采用葡萄原料制备膜性囊泡，具有原料来源丰富，成本低，可大量生产等优点，使规模化利用膜性囊泡成为现实。本发明制备的膜性囊泡具有和细胞分泌的exosomes相同的结构，具有结构稳定的优点；从葡萄中制备的纳米粒子具有特殊的功能，能激活肠道干细胞，是胃肠道疾病的有效治疗药物。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)葡萄原液的提取：将洗净的葡萄原料榨出汁液；
(2)过滤：将所述汁液过滤除去残渣，收集滤过的液体；
(3)上清液的提取：将过滤后的液体离心后收集上清液，再以离心方式收集沉淀，然后用缓冲液将沉淀重悬；
(4)纳米级均质处理：将经重悬处理后的物质均质化，进一步处理获得纳米级颗粒，即葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡。
2.如权利要求1所述的葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的制备方法，其特征在于，所述上清液的提取步骤为：
先将过滤后的液体经过至少1次离心机离心，弃去沉淀，收集上清液；
将收集的上清液以1000～4000转/分钟的转速离心5～40分钟，弃沉淀，收集上清；上清液2000～8000转/分钟离心10～50分钟，弃沉淀，收集上清；上清液6000～20000转/分钟离心0.5～2小时弃沉淀，收集上清；上清液20000～200000转/分钟离心0.1～3小时收集沉淀，用生理盐水或者磷酸缓冲液将沉淀重悬。
3.如权利要求1所述的葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的制备方法，其特征在于，将经重悬处理后的物质用纳米级超高压均质机均质化或者振荡机振荡均质化，进一步处理获得纳米级颗粒，即葡萄来源活性成分膜性囊泡。
4.如权利要求1所述的葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的制备方法，其特征在于，所述葡萄原液提取和过滤都在0～37摄氏度环境中进行。
5.如权利要求1所述的葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的制备方法，其特征在于，所述过滤步骤采用10～12500目过滤材料过滤葡萄汁液。
6.一种葡萄来源活性成分—不同密度纳米粒子的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡，采用密度梯度离心分离得到不同密度的纳米粒子。
7.如权利要求7所述的葡萄来源活性成分—不同密度纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述密度梯度离心是以蔗糖、氯化铯、氯化铷或溴化铯为密度梯度分离材料，所述密度梯度为8％、30％、45％、60％或更多不同浓度的所述梯度材料溶液。
8.如权利要求7所述的葡萄来源活性成分—不同密度纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述密度梯度的离心转速是20000～50000转/分钟，离心时间为0.1～3小时。
9.一种葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的应用，其特征在于，所述葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的葡萄来源活性成分—纳米级膜性囊泡的应用，其特征在于，所述葡萄来源活性成分纳米级膜性囊泡在制备治疗克罗恩病和溃疡性结肠炎的药物中的应用。
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