CN102321187B - 一种从长双歧杆菌nq-1501中提取完整肽聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长双歧杆菌NQ-1501提取完整肽聚糖的方法，通过脱脂去除细胞膜上的脂肪类物质，抽提磷壁酸使细胞膜通透性增加，用酶解液去除细胞内的蛋白质类物质，最后通过离心清洗去除杂质后冻干即获得的完整肽聚糖。本发明的优点在于提取的完整肽聚糖细胞壁结构完整，具有良好的抗肿瘤作用；制备方法实用性强、操作简单、周期短、步骤简便合理，具有成本低、产率高、适宜规模化生产等优点。本发明还涉及由所述方法制备的完整肽聚糖及其进而制备的药物制剂。

Description

一种从长双歧杆菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法

技术领域

本发明涉及一种从长双歧杆菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法，尤其涉及一种应用化学方法提取来自益生菌的完整肽聚糖的方法。

背景技术

癌症是威胁人类生命的重要疾病之一。世界卫生组织和各国政府的卫生部门都把攻克癌症作为一项重要的工作。研究开发新型、高效的抗肿瘤新药不仅具有良好的经济效益，更会带来巨大的社会效益。一般情况下，抗肿瘤药物因原料稀少或科技含量较高价格都很昂贵，因此研究生产出一种疗效显著、价格低廉的抗癌药物是社会所需。

国内外学者经过研究明确阐明长双歧杆菌是生理性有益菌，它对维持人体健康起重要的作用，包括：生物学屏蔽、合成多种维生素、控制内毒素血症、抑制腐败细菌、致病菌在肠道中生长繁殖，提供营养，提高机体免疫力、预防和治疗与抗生素有关的腹泻、便秘、抗肿瘤、预防癌变、抗感染等。在以小鼠为模型的研究中表明长双歧杆菌对肝癌、结肠癌、乳腺癌及艾氏腹水瘤等肿瘤具有一定的抑制作用。接下来的研究证明长双歧杆菌的抑制肿瘤活性与其细胞壁中的完整肽聚糖密切相关，同时作为提取自长双歧杆菌细胞壁的天然产物，其不会有任何毒副作用

关于完整肽聚糖的提取方法已有文献报道，最早也是最为广泛的提取方法是1985年Sekine研究两歧双歧杆菌对荷瘤小鼠肿瘤凋亡试验，从热处理过的婴儿双歧杆菌(B.infantis Reuter)中分离得到三种化学物质，经形态鉴定它们分别是具有生物活性的细胞壁制剂。分别是：1)经超声波处理后的细胞破碎样中提取出的细胞壁成分(CWS)；2)从完整细菌细胞分离、不经过物理破碎、保持完整性的细菌细胞壁结构的物质(WPG)；3)用超声波处理过的WPG，他们分别用这三种物质给荷瘤小鼠皮下注射，研究这三种经过不同方法提取的物理形态不同的细胞壁制剂的抗肿瘤效果，结果发现这三种制剂都有不用程度的抑瘤效果，只有CWS没有肿瘤凋亡活性。肿瘤凋亡活性证明细胞壁物理形态的完整程度与抑瘤作用大小成正相关性，完整程度高，活性就高，而抑瘤作用大小也与细胞壁的完整程度有关。Sekine等人的这个试验为后人对双歧杆菌细胞壁结构的完整性与其抗肿瘤作用的相关性提供了有力的依据，物理结构上具有完整性的细胞壁制剂也可能成为一种高效的体内抗肿瘤药物。

1997年国内的乐军和胡宏首次用自己培养的双歧杆菌1101采用Sekine等人创立的提取双歧杆菌完整肽聚糖的方法成功提取出此菌的完整肽聚糖，此后国内很多关于双歧杆菌完整肽聚糖所需样品都由他们实验室提供。1998年国内孟凡伦等参照Park等人提取肽聚糖的方法从SB900乳酸链球菌中提取出其细胞壁成分肽聚糖。2005年宋晓玲等在孟凡伦试验方法的基础上加以改进，在实验室提取出双歧杆菌(Bifidobacterium thermopHilum)的肽聚糖粗产品，采用此法一天即可由细菌培养物中获取粗制肽聚糖。尽管他们用的方法比较简单，时间短，但是所提取出的肽聚糖并不是完整肽聚糖。

总结上述几种提取肽聚糖的方法，采用Sekine等人建立的复合酶法提取双歧杆菌完整肽聚糖，由于条件温和整个纯化过程中不使用任何物理和化学方法，能够得到细胞骨架完整的肽聚糖。因为双歧杆菌的很多功能都与其细胞壁的完整性有关，特别是其抑制肿瘤作用和细胞凋亡活性功能，所以用这种方法提取的双歧杆菌常用于肽聚糖结构、组分分析和生物学功能的研究。但这种方法的缺点是试验步骤繁琐、耗时长，一套流程结束至少需要2周以上的时间，在处理的过程中极容易污染，不能用于大规模的工业化生产。而采用孟凡伦和宋晓玲等的三氯化乙酸裂解法制备的肽聚糖虽然具有制备方法简单，步骤少，制备周期短，1-3天即可从细菌培养物中获取粗制肽聚糖的优点，但制备的肽聚糖空间结构被破坏，其细胞壁骨架外形不再为袋状结构而呈皱褶紧缩状，而且用此方法制得的完整肽聚糖纯度较低。因此完整肽聚糖一直因为提取方法没有突破而不能应用于大规模生产，因而也只能局限于实验室研究。

而本发明制备完整肽聚糖的方法由于条件温和，且整个纯化过程中不使用任何物理与化学方法破坏细胞壁的骨架结构，因此分离得到了细胞骨架完整的肽聚糖，通过透射电镜观察所提取到的细胞骨架呈袋状结构，这与Sekine所报道的一致，但Sekine法制备的肽聚糖虽然也完整，但因其周期长、步骤繁多，极易在提取过程中受到污染，仅停留在实验室提取完整肽聚糖阶段。孟凡伦也曾采用TCA提取肽聚糖，其制备方法和步骤简单，制备周期仅为3天，但因其TCA作用时间略长，所提取物是破坏了细胞壁完整结构的粗肽聚糖，呈皱褶紧缩状。

双歧杆菌的抗肿瘤作用与细胞壁结构的完整性有关，其细胞壁是抑制肿瘤生长的主要成分，因此，完整肽聚糖的临床试验必须要求保持细胞壁的完整结构。

现有技术中已经有了关于完整肽聚糖制备方法的记载，例如“Anew morphologically characterized cell wall preparaing(wholepeptidoglycan)from Bifidobacterium infantis with a higherefficacy on the regression of an es tablished tumor in mice”，但是所述制备方法具有工艺复杂、操作周期长、不适合工业化生产等缺点。

本发明人在此发明申请之前对于完整肽聚糖的制备方法也有很长时间的研究，并且以论文或专利申请的形式多次发表过相应成果。例如“长双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖分离鉴定的研究”，《食品与发酵工业》，相对于上面记载的国外技术已有了较大的改进，但是但在整个生产周期上还是相对冗长，特别是酶解步骤需要耗时超过48个小时，这占到了整个制备过程的大部分时间，特别不利于大规模工艺生产及产品质量控制，并且需要用甲醇脱去TCA，溶剂使用量大，成本高。

又例如，专利申请“2009102538723，一种完整肽聚糖及其制备方法”也是在上述期刊文献基础上的一个改进技术，虽然已经较大程度缩短了整个工艺周期，但是还是需要用甲醇脱去TCA，并且溶剂使用量大，并且所用的胃蛋白酶购买成本或制备成本相对于中性蛋白酶要高很多，从而造成整个工艺成本较高。

发明内容

本发明的一个目的在于能够从益生菌长双歧杆菌NQ-1501中提取完整肽聚糖，因所提取肽聚糖空间结构完整，与不完整肽聚糖相比，更能有效抑制肿瘤生长，可广泛应用于抗肿瘤药物。

并且本发明提供了一种生产周期短、溶剂使用少、生产成本低廉的完整肽聚糖制备方法。

本发明的目的由如下技术方案实施：通过脱脂去除细胞膜上的脂肪类物质，再利用三氯乙酸抽提磷壁酸使细胞膜通透性增加，有利于下一步的酶更好的作用于细胞内容物，然后用酶解液去除细胞内的蛋白质类物质，最后通过离心清洗去除杂质后冻干即获得的完整肽聚糖，通过透射电镜观察可见其细胞壁骨架结构完整。

本发明由如下技术方案实施：

(1)菌体的洗涤：

取长双歧杆菌NQ-1501菌株湿菌体100克，加入生理盐水1000毫升混合均匀后，8000克力离心10分钟，弃去上清液，得到湿菌体；

(2)脱脂步骤：

将所述长双歧杆菌NQ-1501湿菌体与氯仿2000毫升混合均匀，在30℃下搅拌24小时脱脂，8000克力离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀；

(3)磷壁酸的去除：

取收集到的所述沉淀，与1％三氯乙酸1000毫升混合均匀后，于70℃水浴加热4小时，通过8000克力离心30分钟，弃去上清液，取得沉淀物；

(4)酶解

a、配制酶解液：pH7.2Tris-盐酸缓冲液1000毫升中分别加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，调节酶浓度至250NFU/mL；

b、取所述沉淀物，加入酶解液中混合均匀，在30℃下搅拌12小时，通过8000克力离心30分钟，弃去上清，收集沉淀；

c、所述一次酶解沉淀物，加入无菌水1000毫升摇匀，8000克力离心30分钟，弃去上清液，得到清洗后的沉淀物；

(5)冻干保存步骤

所述清洗后的沉淀物，加入无菌水1000毫升摇匀，进行真空冷冻干燥至白色絮状粉末，即为长双歧杆菌NQ-1501完整肽聚糖成品。

一种从长双歧杆菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法，所述步骤(1)菌体的洗涤步骤中的所述长双歧杆菌NQ-1501菌株，该菌株可从内蒙古双奇药业股份有限公司公开销售中获得。

本发明的优点在于：

1、由于制备方法条件温和、且整个纯化过程中不使用任何物理与化学方法破坏细胞壁的骨架结构，因此分离得到了细胞骨架完整的肽聚糖。因能提取完整肽聚糖，其细胞壁结构完整，具有良好的抗肿瘤作用。

2、本发明调整了脱脂和去磷壁酸的工艺步骤的先后顺序，现有技术中均是先使用三氯乙酸除去磷壁酸，然后再用甲醇去三氯乙酸，然后再用丙酮进行脱脂，从而造成需要使用较大量的甲醇，提高了生产成本，本发明发明人惊喜的发现当先使用氯仿进行脱脂，然后再使用三氯乙酸去除磷壁酸时并不需要事后使用甲醇，并且也不会影响后面的酶解步骤，但是如果仅仅是调换了脱脂和除磷酸壁的顺续，而仍旧使用丙酮进行脱脂，则会对除磷酸壁产生影响。

3、本发明发明人还惊喜的发现，本发明的脱脂和除磷酸壁后更有利于酶解的过程，在同样使用胰蛋白酶和中性蛋白酶的情况下同样可以以较短的时间获得高品质的产品，从而大大降低了生产成本。

4、本发明的制备方法实用性强、操作简单、周期短、步骤简便合理，具有成本低、产率高、适宜规模化生产等优点。

具体实施方式

以下通过实施例进一步阐述本发明药物，这些实施例仅用于举例说明的目的，并没有限制本发明的范围。

实施例1：

通过脱脂去除细胞膜上的脂肪类物质，然后再通过三氯乙酸抽提长双歧杆菌NQ-1501菌株的磷壁酸使细胞膜通透性增加，有利于外界物质更好的作用于细胞内容物，用酶解液去除细胞内的蛋白质类物质，最后通过离心清洗去除杂质后冻干即获得的完整肽聚糖，通过透射电镜观察可见其细胞壁骨架结构完整。长双歧杆菌NQ-1501菌株可从内蒙古双奇药业股份有限公司公开销售中获得。

该完整肽聚糖的制备方法包括以下步骤：

(1)菌体的洗涤：

取长双歧杆菌NQ-1501菌株湿菌体100克，加入生理盐水1000毫升混合均匀后，8000克力离心10分钟，弃去上清液，得到湿菌体；

(2)脱脂步骤：

将所述长双歧杆菌NQ-1501湿菌体与氯仿2000毫升混合均匀，在30℃下搅拌24小时脱脂，8000克力离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀；

(3)磷壁酸的去除：

取收集到的所述沉淀，与1％三氯乙酸1000毫升混合均匀后，于70℃水浴加热4小时，通过8000克力离心30分钟，弃去上清液，取得沉淀物；

(4)酶解

a、配制酶解液：pH7.2Tris-盐酸缓冲液1000毫升中分别加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，调节酶浓度至250NFU/mL；

b、取所述沉淀物，加入酶解液中混合均匀，在30℃下搅拌12小时，通过8000克力离心30分钟，弃去上清，收集沉淀；

c、所述一次酶解沉淀物，加入无菌水1000毫升摇匀，8000克力离心30分钟，弃去上清液，得到清洗后的沉淀物；

(5)冻干保存步骤

所述清洗后的沉淀物，加入无菌水1000毫升摇匀，进行真空冷冻干燥至白色絮状粉末，即为长双歧杆菌NQ-1501完整肽聚糖成品。

实施例2：

本发明公开的一种从长双歧杆菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方的结构完整性检测

将本发明实施例1中的原菌体及所制得的完整肽聚糖通过电镜透视检测。结果见附图1、2，完整肽聚糖仍保留原菌体的完整外部结构。

实施例3：

应用压片技术，以葡萄糖、乳糖、微晶纤维素、脱脂奶粉等辅料为原料制备颗粒，再混合完整肽聚糖粉末(实施例1获得)及硬脂酸镁进行压片，最终得到长双歧杆菌NQ-1501完整肽聚糖片剂。

其生产办法包括以下步骤：

(1)配制药用辅料：按葡萄糖0.125克，微晶纤维素0.05克，羧甲淀粉钠0.033克，蔗糖0.0025克，枸橼酸0.003克，脱脂奶粉0.0625克，乳糖0.1875克。

(2)原料混合：将完整肽聚糖34.4克与上述辅料混合。然后加入硬脂酸镁0.0015克，混合后便可得到直接压片的原料。

(3)压片：将混合的原料投入压片机压片。

表1、完整肽聚糖片剂质量标准

实施例4：

应用胶囊技术，以乳糖、硬脂酸镁等辅料为原料，再混合完整肽聚糖粉末(实施例1获得)，装入明胶空心胶囊，最终得到长双歧杆菌NQ-1501完整肽聚糖胶囊。

其生产办法包括以下步骤：

(1)配制药用辅料：乳糖25克。

(2)原料混合：将完整肽聚糖0.85克与上述辅料混合。然后加入硬脂酸镁0.15克，混合后便可得到原料。

(3)包装：将混合的原料装入明胶空心胶囊中。

表2、完整肽聚糖胶囊质量标准

实施例5：

应用散剂技术，以蔗糖、碳酸氢钠等辅料为原料，再混合完整肽聚糖粉末(实施例1获得)，最终得到长双歧杆菌NQ-1501完整肽聚糖散剂。

其生产办法包括以下步骤：

(1)配制药用辅料：蔗糖86克，碳酸氢钠12克。

(2)原料混合：将完整肽聚糖2克与上述辅料混合。投入混合机中，进行混合。混合机转速为6转/分，转数为150转。

(3)包装：将混合的原料装入袋中。

表3、完整肽聚糖散剂质量标准

实施例6：

本发明公开的一种长双歧杆菌NQ-1501的完整肽聚糖的抑制肿瘤效果试验

无菌操作下抽取腹腔积液H₂₂肝癌昆明鼠的腹腔积液，台盼蓝染色检查癌细胞成活率，成活率大于95％的腹腔积液瘤细胞用无血清培养基调至1×10⁷个/mL。取正常昆明鼠40只，雌雄各半，适应性喂养3d常规消毒后在每只鼠右腋部皮下接种注射2×10⁶个癌细胞(0.2mL)。1周后，小鼠肝癌模型建立成功，于接种处长出直径约1cm的癌肿。造模后小鼠随机分为4组，每组10只，即对照组(灭菌PBS 1mL/d)、长双歧杆菌NQ-1501完整肽聚糖低剂量组(0.1mL/d)、中剂量组(0.5mL/d)、高剂量组(1mL/d)3个剂量给药组。于造模24hrs皮下注射，连续给药12d。在停药次日，将对照组、实验组称重并处死小鼠，解剖剥离瘤块，称瘤重，按平均瘤重计算抑瘤率，具体见下表：表4、长双歧杆菌NQ-1501WPG对荷瘤小鼠的抑瘤效果(

n＝10)

由表可知，长双歧杆菌NQ-1501WPG对H₂₂荷瘤小鼠肿瘤生长有抑制作用，低、中、高三个剂量组的抑瘤率分别是16.92％、37.46％、40.78％；生命延长率为16.76％、62.59％、65.89％。各剂量组与对照组小鼠体重均正常增加，试验动物最终体重无明显差异。

Claims (1)

1.一种从长双歧杆菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌体的洗涤：

取长双歧杆菌NQ-1501菌株湿菌体100克，加入生理盐水1000毫升混合均匀后，8000克力离心10分钟，弃去上清液，得到湿菌体；

(2)脱脂步骤：

将所述长双歧杆菌NQ-1501湿菌体与氯仿2000毫升混合均匀，在30℃下搅拌24小时脱脂，8000克力离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀；

(3)磷壁酸的去除：

取收集到的所述沉淀，与1％三氯乙酸1000毫升混合均匀后，于70℃水浴加热4小时，通过8000克力离心30分钟，弃去上清液，取得沉淀物；

(4)酶解

a、配制酶解液：pH7.2Tris-盐酸缓冲液1000毫升中分别加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，调节各个酶浓度至250NFU/mL；

b、取所述沉淀物，加入酶解液中混合均匀，在30℃下搅拌12小时，通过8000克力离心30分钟，弃去上清，收集获得一次酶解沉淀；

c、在所述一次酶解沉淀物中加入无菌水1000毫升摇匀，8000克力离心30分钟，弃去上清液，得到清洗后的沉淀物；

(5)冻干保存步骤

在所述清洗后的沉淀物中加入无菌水1000毫升摇匀，进行真空冷冻干燥至白色絮状粉末，即得长双歧杆菌NQ-1501完整肽聚糖成品。