CN101717806B - 一种完整肽聚糖及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种完整肽聚糖，因所提取肽聚糖空间结构完整，能有效抑制肿瘤生长，可广泛应用于抗肿瘤药物。本发明还公开了一种提取完整肽聚糖的方法，通过抽提磷壁酸使细胞膜通透性增加，脱脂去除胞膜上的脂肪类物质，用酶解液去除细胞内的蛋白质类物质，最后通过离心清洗去除杂质后冻干即获得的完整肽聚糖。本发明的优点在于：因能提取完整肽聚糖，其细胞壁结构完整，具有良好的抗肿瘤作用。制备方法实用性强、操作简单、周期短、步骤简便合理，具有成本低、产率高、适宜规模化生产等优点。

Description

一种完整肽聚糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及药物制剂技术领域，尤其涉及一种应用化学方法提取来自保加利亚乳杆菌的完整肽聚糖及其方法。
背景技术：
癌症是威胁人类生命的重要疾病之一。世界卫生组织和各国政府的卫生部门都把攻克癌症作为一项重要的工作。研究开发新型、高效的抗肿瘤新药不仅具有良好的经济效益，更会带来巨大的社会效益。一般情况下，抗肿瘤药物因原料稀少或科技含量较高价格都很昂贵，因此研究生产出一种疗效显著、价格低廉的抗癌药物是社会所需。
国内外学者经过研究明确阐明保加利亚乳杆菌是生理性有益菌，它对维持人体健康起重要的作用，包括：生物学屏蔽、合成多种维生素、控制内毒素血症、抑制腐败细菌、致病菌在肠道中生长繁殖，提供营养，提高机体免疫力、预防和治疗与抗生素有关的腹泻、便秘、抗肿瘤、预防癌变、抗感染等。在以小鼠为模型的研究中表明保加利亚乳杆菌对肝癌、结肠癌、乳腺癌及艾氏腹水瘤等肿瘤具有一定的抑制作用。研究证明保加利亚乳杆菌的抑制肿瘤活性与其细胞壁中的完整肽聚糖密切相关，同时作为提取自保加利亚乳杆菌细胞壁的天然产物，其不会有任何毒副作用
目前国内外相关文献中缺乏关于保加利亚乳杆菌提取完整肽聚糖的报道。
发明内容：
本发明的一个目的在于提供一种完整肽聚糖，因所提取肽聚糖空间结构完整，与不完整肽聚糖相比，更能有效抑制肿瘤生长，可广泛应用于抗肿瘤药物。
本发明的另一个目的在于提供一种从保加利亚乳杆菌中提取完整肽聚糖的方法，利用本发明能提取高纯度及完整的肽聚糖。
本发明的第一个目的由如下技术方案实施：通过三氯乙酸抽提磷壁酸使细胞膜通透性增加，有利于外界物质更好的作用于细胞和细胞内容物排出，然后脱脂去除胞膜上的脂肪类物质，用酶解液去除细胞内的蛋白质类物质，最后通过离心清洗去除杂质后冻干即获得的完整肽聚糖，通过透射电镜观察可见其细胞壁骨架结构完整。
本发明的另一个目的由如下技术方案实施：
一种完整肽聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌体的清洗与收集步骤：
取保加利亚乳杆菌湿菌体100重量份，按1克重量份比10毫升体积份的比例加入1000体积份生理盐水，通过离心分离，800克力离心10分钟，弃去沉淀；将获得的上清液4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌体；
(2)磷壁酸的去除步骤：
取收集到的所述湿菌体，按1克重量份所述湿菌体比10毫升体积份的8％三氯乙酸溶液比例均匀混合后，于50℃水浴加热3小时，通过4000克力离心30分钟，弃去上清液，取得沉淀物；
(3)脱脂步骤：
a、将所述沉淀物，按1克重量份所述沉淀物比2毫升体积份甲醇的比例，加入100％浓度甲醇中，摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到一次沉淀物；
b、将所述一次沉淀物，按1克重量份所述一次沉淀物比2毫升体积份丙酮的比例，加入100％浓度丙酮中摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到二次沉淀物；
c、将所述二次沉淀物，按1克重量份所述二次沉淀物比2毫升体积份无菌水的比例，加入无菌水中摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到脱脂沉淀物；
(4)酶解步骤
a、按克重量份比毫升体积份，取3重量份胃蛋白酶和4重量份胰蛋白酶比4000体积份pH7.2Tris-盐酸缓冲液的比例混合均匀，配制成酶解液；
b、取所述脱脂沉淀物，按1克重量份所述脱脂沉淀物比15毫升体积份所述酶解液的比例，加入所述酶解液中摇匀，在37℃水浴加热8小时后，再8000克力离心15分钟，弃去上清液，得到一次酶解沉淀物；
c、所述一次酶解沉淀物，按1克重量份所述脱脂沉淀物比15毫升体积份无菌水的比例，加入无菌水中摇匀，8000克力离心15分钟，弃去上清液，得到二次酶解沉淀物；
(5)冻干保存步骤
a、所述二次酶解沉淀物，按1克重量份所述脱脂沉淀物比5毫升体积份无菌水的比例，加入无菌水中混合均匀，进行真空冷冻干燥至白色絮状粉末，即为保加利亚乳杆菌完整肽聚糖成品。
本发明的优点在于：由于制备方法条件温和、且整个纯化过程中不使用任何物理与化学方法破坏细胞壁的骨架结构，因此分离得到了细胞骨架完整的肽聚糖。因能提取完整肽聚糖，其细胞壁结构完整，具有良好的抗肿瘤作用。本发明的制备方法实用性强、操作简单、周期短、步骤简便合理，具有成本低、产率高、适宜规模化生产等优点。
附图说明：
图1为实施例2原菌体和完整肽聚糖的电镜透视检测对比图。
其中1为原菌体，2为完整肽聚糖。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步阐述本发明药物，这些实施例仅用于举例说明的目的，并没有限制本发明的范围。
实施例1：
通过三氯乙酸抽提保加利亚乳杆菌的磷壁酸使细胞膜通透性增加，有利于外界物质更好的作用于细胞和细胞内容物排出，然后脱脂去除胞膜上的脂肪类物质，用酶解液去除细胞内的蛋白质类物质，最后通过离心清洗去除杂质后冻干即获得的完整肽聚糖，通过透射电镜观察可见其细胞壁骨架结构完整。保加利亚乳杆菌可从内蒙古双奇药业股份有限公司公开销售中获得。
该完整肽聚糖的制备方法包括以下步骤：
(1)菌体的清洗与收集步骤：
取保加利亚乳杆菌湿菌体100克，加入1000毫升生理盐水，通过离心分离，800克力离心10分钟，弃去沉淀；将获得的上清液4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌体；
(2)磷壁酸的去除步骤：
取收集到的所述湿菌体，按1克所述湿菌体比10毫升的8％三氯乙酸溶液比例均匀混合后，于50℃水浴加热3小时，通过4000克力离心30分钟，弃去上清液，取得沉淀物；
(3)脱脂步骤：
a、将所述沉淀物，按1克所述沉淀物比2毫升甲醇的比例，加入100％浓度甲醇中，摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到一次沉淀物；
b、将所述一次沉淀物，按1克所述一次沉淀物比2毫升丙酮的比例，加入100％浓度丙酮中摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到二次沉淀物；
c、将所述二次沉淀物，按1克所述二次沉淀物比2毫升无菌水的比例，加入无菌水中摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到脱脂沉淀物；
(4)酶解步骤
a、取3克胃蛋白酶和4克胰蛋白酶比4000毫升pH7.2Tris-盐酸缓冲液混合均匀，配制成酶解液；
b、取所述脱脂沉淀物，按1克所述脱脂沉淀物比15毫升所述酶解液的比例，加入所述酶解液中摇匀，在37℃水浴加热8小时后，再8000克力离心15分钟，弃去上清液，得到一次酶解沉淀物；
c、所述一次酶解沉淀物，按1克所述脱脂沉淀物比15毫升无菌水的比例，加入无菌水中摇匀，8000克力离心15分钟，弃去上清液，得到二次酶解沉淀物；
(5)冻干保存步骤
a、所述二次酶解沉淀物，按1克所述脱脂沉淀物比5毫升无菌水的比例，加入无菌水中混合均匀，进行真空冷冻干燥至白色絮状粉末，即为保加利亚乳杆菌完整肽聚糖成品。
实施例2：本发明公开的一种保加利亚乳杆菌的完整肽聚糖的结构完整性检测
将本发明实施例1中的原菌体及所制得的完整肽聚糖通过电镜透视检测，见图1所示。结果可见，完整肽聚糖仍保留原菌体的完整外部结构。
实施例3：本发明公开的一种保加利亚乳杆菌的完整肽聚糖的抑制肿瘤效果试验
无菌操作下抽取腹腔积液H22肝癌昆明鼠的腹腔积液，台盼蓝染色检查癌细胞成活率，成活率大于95％的腹腔积液瘤细胞用无血清培养基调至1×107个/mL。取正常昆明鼠40只，雌雄各半，适应性喂养3d常规消毒后在每只鼠右腋部皮下接种注射2×106个癌细胞(0.2mL)。1周后，小鼠肝癌模型建立成功，于接种处长出直径约1cm的癌肿。造模后小鼠随机分为4组，每组10只，即对照组(灭菌PBS1mL/d)、保加利亚乳杆菌完整肽聚糖低剂量组(0.1mL/d)、中剂量组(0.5mL/d)、高剂量组(1mL/d)3个剂量给药组。于造模24hrs皮下注射，连续给药12d。在停药次日，将对照组、实验组称重并处死小鼠，解剖剥离瘤块，称瘤重，按平均瘤重计算抑瘤率，具体见下表：
保加利亚乳杆菌WPG对荷瘤小鼠的抑瘤效果(x±s，n＝10)
由上表可知，保加利亚乳杆菌WPG对H22荷瘤小鼠肿瘤生长有抑制作用，低、中、高三个剂量组的抑瘤率分别是16.92％、37.46％、40.78％；生命延长率为16.76％、62.59％、65.89％。各剂量组与对照组小鼠体重均正常增加，试验动物最终体重无明显差异。

Claims (2)

1.一种完整肽聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌体的清洗与收集步骤：
取保加利亚乳杆菌湿菌体100重量份，按1克重量份比10毫升体积份的比例加入1000体积份生理盐水，通过离心分离，800克力离心10分钟，弃去沉淀；将获得的上清液4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌体；
(2)磷壁酸的去除步骤：
取收集到的所述湿菌体，按1克重量份所述湿菌体比10毫升体积份的8％三氯乙酸溶液比例均匀混合后，于50℃水浴加热3小时，通过4000克力离心30分钟，弃去上清液，取得沉淀物；
(3)脱脂步骤：
a、将所述沉淀物，按1克重量份所述沉淀物比2毫升体积份甲醇的比例，加入100％浓度甲醇中，摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到一次沉淀物；
b、将所述一次沉淀物，按1克重量份所述一次沉淀物比2毫升体积份丙酮的比例，加入100％浓度丙酮中摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到二次沉淀物；
c、将所述二次沉淀物，按1克重量份所述二次沉淀物比2毫升体积份无菌水的比例，加入无菌水中摇匀，4000克力离心30分钟，弃去上清液，得到脱脂沉淀物；
(4)酶解步骤
a、按克重量份比毫升体积份的比例，取3重量份胃蛋白酶和4重量份胰蛋白酶比4000体积份pH7.2Tris-盐酸缓冲液的比例混合均匀，配制成酶解液；
b、取所述脱脂沉淀物，按1克重量份所述脱脂沉淀物比15毫升体积份所述酶解液的比例，加入所述酶解液中摇匀，在37℃水浴加热8小时后，再8000克力离心15分钟，弃去上清液，得到一次酶解沉淀物；
c、所述一次酶解沉淀物，按1克重量份所述一次酶解沉淀物比15毫升体积份无菌水的比例，加入无菌水中摇匀，8000克力离心15分钟，弃去上清液，得到二次酶解沉淀物；
(5)冻干保存步骤
a、所述二次酶解沉淀物，按1克重量份所述二次酶解沉淀物比5毫升体积份无菌水的比例，加入无菌水中混合均匀，进行真空冷冻干燥至白色絮状粉末，即为保加利亚乳杆菌完整肽聚糖成品。
2.根据权利要求1所述一种完整肽聚糖的制备方法制备的完整肽聚糖。
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