CN101088496A - 双歧杆菌信号分子微生态制剂及其制法 - Google Patents

Abstract

双歧杆菌信号分子微生态制剂，是将双歧杆菌中的一种或多种经厌氧发酵、细胞破壁、酶解、抽提和干燥而得制剂原粉。所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.ifantis)、短双歧杆菌(B.breve)和青春双歧杆菌(B.Adolescentis)。以制剂原粉为主料可以制成口服胶囊、片剂、颗粒剂、口服液等制剂。实验证实双歧杆菌信号分子微生态制剂无急性毒性，对动物的自发活动次数、血压及呼吸的无影响，对动物不会引起过敏反应；并具有激活NO及促进荷瘤小鼠产生肿瘤坏死因子和细胞因子的能力，提示其具有抗肿瘤作用。

Description

双歧杆菌信号分子微生态制剂及其制法

技术领域

本发明涉及来源于微生物材料的医药配制品的领域，特别是来源于细菌的医药制品。

背景技术

双歧杆菌的活菌及死菌制品作为第一和第二代微生态制品，在国内、国际已有悠久历史，其生产方法已经公开，许多方面已为众所周知的事实。这些双歧杆菌产品具有明显的生态效应，但其产品的质量不易控制，活菌有效期短，有效活性很难确定，耙标(target)不明确。所有第一、第二代产品的功能主体是细菌本身，生态效应主要是细菌的生态平衡，而宿主的作用只是被动的只是在肠菌群生态失调得到平衡后对宿主的生态效应。事实上正常菌群只是宿主体表特别是粘膜表面的外环境的生物环境因子。环境与宿主细胞是对应的统一体。环境对宿主的影响主要是通过环境因子即信号分子。把环境中的信息传递到宿主细胞，使其主动地适应环境，作出生理反应。生理性细菌提供健康信号。正常微生物群(Nornal microbiota)是宿主的一个环境生理系统，是一个生理器官。宿主与环境的对立的统一是必须依赖这一环境生理系统。

双歧杆菌菌体提取物作为一种分子微生态制剂，其中含有的特异性WPG、DNA、RNA，它们是一组综合的信号系统。在人体细胞与体内生理性细菌相互作用这一细胞通讯系统中占有重要位置，并将成为研究细胞通讯时代的重要突破点^[1]。美国一位资深的传染病内科学者Blaser(2005)明确指出幽门螺杆菌(HP)从来就被认为是典型的病原菌，其实不是，是一个典型的古老的人类胃内正常菌群之一。它有两个信号分子，一介是促进胃酸分泌的叫CageA，另一个是抑制胃酸分泌的叫VagA。这两个信号分子都能使胃粘细胞mRNA表达两种酶，产生两种相互制约的作用，保持胃酸的正常水平。因此把HP看作是病原菌，用抗生素加以消灭是错误的。这是一个很好的细胞通讯、信息时代的实例。

双歧杆菌分子微生态制剂的作用是多方面的，已经取得的研究成果有：

1、双歧杆菌提取物对巨噬细胞内Ca⁺⁺就调节作用^[2]，使细胞内的Ca⁺⁺浓度增加，一方面使细胞钙库向胞内释放Ca⁺⁺，另一方面可增加胞外Ca⁺⁺向胞内转移。Ca⁺⁺是有重要细胞生理学的调节作用。在细胞通讯上起关键作用，起到第二信使传递作用。Ca⁺⁺的生理功能包括抗肿瘤、抗感染、抗衰老和免疫赋活等保健作用。细胞内钙离子是重要的第二信使，直接影响细胞运动、代谢、生长及分化等重要生理功能。巨噬细胞被双歧杆菌分子微生态制剂激活后，能提高三磷肌醇(IP₃)引起钙库释放Ca⁺⁺，产生上述作用。

2、双歧杆菌分子微生态制剂的WPG及DNA对-氧化氮(NO)的激活作用^[3-6]。通过激活巨噬细胞内的NO合酶(iNOS)，从而促进NO浓度的增高。NO具有抗肿瘤作用，改善血管内皮细胞功能，舒张血管，改善肝功能作用。人体细胞有三种NOS，一种是神经细胞产生的，叫n-NOS，第二种是血管内皮细胞产生的，叫e-NOS，第三种是诱导巨噬细胞产生的，叫i-NOS。i-NOS不仅作用明显，而数量可以调节。在NO的产生机制上或功能上都是最重要的。

3、双歧杆菌分子微生态制剂对巨噬细胞的激活^[7、8]：双歧杆菌分子微生态制剂中的WPG、DNA对巨噬细胞的丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)有激活作用。MAPK是细胞外信号调节蛋白(extracellular signal regulated protein kinase，ERK)。WPG、DNA就是通过这条信号传递途径促进巨噬细胞产生有益于宿主健康的细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-12、TNF-A、VEGF、Ca⁺⁺及NO等。

4、双歧杆菌的完整肽聚糖对实验性大肠癌的治疗^[9-12]：以证明双歧杆菌体内预防大肠癌生长的途径之一是为降低其PTK的活性，抑制NF-κB

综上所述，实验证明双歧杆菌分子微生态制剂对人体的健康确有效果，然而目前尚无有效工业化提取方法及成品化的制剂产品上市。国外及国内学者^[13-15]就双歧杆菌细胞壁成分、DNA及其它菌体细胞功效成份的提取及研究作了大量的研究工作。而作为工业或生产这些双歧杆菌信号因子到目前鲜有人进行这方面的工作。

参考文献

1、康白，迎接细胞通讯的微生态新时代的到来，中国微生态学杂志2006；18(1)：1-5

2、唐铭坚等，双歧杆菌DNA对小鼠腹腔巨噬细胞游离Ca⁺⁺等离子水平的影响，中国微生态学杂志2005；17(6)：403404

3、双歧杆菌的完整体聚糖对巨噬细胞产生IL-18的影响，中国微生态学杂志，2004；16(4)195-196

4、双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞NO形成的调节作用，王立生、潘令嘉，中国微生态学杂志.1998；10(6)321-323

5、双歧杆菌对实验性大肠癌诱导型一氧化氮合酶表达的影响，王立生、潘令嘉，中国微生态学杂志2000；12(1)8-9

6、双歧杆菌的全肽聚糖对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6，IL-12及一氧化氮的影响，王立生、潘令嘉、施理、孙勇、张亚历、周殿元，中国病理生理学杂志，2000；16：157-1599

7、双歧杆菌DNA对巨噬细胞PKC的影响，唐铭坚、王立升、朱忠升等，中国微生态学杂志2006；18(1)：86-87

8、双歧杆菌的完整肽聚糖对巨噬细胞NF-kB的影响，朱忠生、王立升、杨林等，中国微生态学杂志2006；18(1)：83-85

9、双歧杆菌预防大肠癌生长的信号转导机制，戴建宜、王立生、朱惠明等，中国微生态学杂志2004；16(1)：27-28

10、双歧杆菌对完整肽聚糖对实验性大肠癌NF-κB和IκBα的影响，王立生、朱惠明、潘令嘉等，中国微生态学杂志.2002；14(6)：318-320

11、血管形成在双歧杆菌预防大肠癌生长中的作用，中国微生态学杂志2005；17(6)：401-402

12、双歧杆菌的完整肽聚糖对实验性大肠癌MAPK和AP-1的影响，王立生、马晓东，中华微生物学和免疫学杂志，2003；23(1)：57-60.

13、双歧杆菌细胞壁完整肽果糖的分离纯化，乐军、胡宏，中国微生态学杂志1995；7(9)：7-9

14、Sekine，K watanabe，Sekine E，Toida，T，et al，Adjuvent of the cell of Bifidobacterinm infanticfor the vivo immune responses in mice，immuno pharmarcol，immuno-toxicol，1994 16：289

15、Sekine K，ohta J，onish，M，etal.Analosis of antitumon prorerties of ellect an cell stiamiated witha cell wall preparation CWPG of Bifidobacterium infantis，J，Biol，pharm，Bell，199518(1)：148-153

发明内容

本项发明旨在提出一个双歧杆菌分子微生态制剂及工艺制备方法，以便使双歧杆菌分子微生态制剂的研究开发进入工业化生产阶段。

本发明提出的双歧杆菌分子微生态制剂包括：

1、双歧杆菌发酵其菌体浓缩：是将双歧杆菌包括两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.ifantis)、短双歧杆菌(B.breve)和青春双歧杆菌(B.Adolescentis)的一种或几种双歧杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量0.5～1.5％酵母浸膏、1～2.5％葡萄糖、0.5～1.5％蛋白胨、0.5～1.5％牛肉膏培养液基中经35～38℃厌氧发酵后，经离心浓缩后获得双歧杆菌菌体浓缩物。

2、细胞破壁：将该双歧杆菌菌体浓缩物加蒸馏水，以超声波法、冻融法或1～2％溶菌酶酶法破碎菌体细胞壁。

3、酶解：分别用含胰蛋白酶(1～2mg/ml)、糜蛋白酶(1～2mg/ml)和胃蛋白酶(1～2mg/ml)及0.01m盐酸水解12～24小时，离心、水洗，获得细胞壁粗提物。

4、抽提：细胞壁粗提物分别以乙醚-乙醇、氯仿-甲醇提取12～24小时。

5、于燥：溶媒提取后的细胞提取物于40～70℃减压干燥至无溶剂味为止。或加入100～200mM/L的海藻糖作为冻干保护剂将本制品进行冷冻干躁。获得的干燥固体物经粉碎、过筛，即得双歧杆菌分子微生态制剂原粉。

本双歧杆菌分子微生态制剂其产品的检测项目及指标是：1)细胞壁糖检查，称取原粉0.01g加15％正丁醇水溶液各配制成10mg/ml溶液。吸取0.5ml于试管中，滴加0.05％蒽酮硫酸试剂1.0ml，摇匀即呈蓝绿色。2)采用紫外分光光度法测定制品中双歧杆菌DNA A260nm/A280nm为1.89-2.05。3)外观应为白色粉末。4)干燥失重检查，减失重量应不高于5％。5)本制品中不应检测出甲醇、乙醇、氯仿的残留。

本发明的双歧杆菌分子微生态制剂对动物进行了关于动物急性毒性试验、对小鼠自发活动次数的影响、对大鼠血压及呼吸的影响、自动过敏实验，证实无急性毒性，对动物的自发活动次数、血压及呼吸的无影响，对动物不会引起过敏反应；另外，本发明的双歧杆菌分子微生态制剂具有激活NO及促进荷瘤小鼠产生肿瘤坏死因子和细胞因子的能力。提示其具有抗肿瘤作用。

用本发明双歧杆菌分子微生态制剂原粉(包括减压干燥和冷冻干燥而得到的固体经粉碎、过筛的产品)和相应的辅料可以制成不同的制剂，如胶囊、片剂、颗粒剂、口服液。其中：(1)胶囊：双歧杆菌分子微生态制剂原粉10～50g，加入低聚异麦芽糖500～1000g，硬脂酸镁10～50g，分装0号胶囊；(2)片剂：双歧杆菌分子微生态制剂原粉10～50g，加入乳糖200～450g，硬脂酸镁2.0～4.0g，羟丙纤维素30～50g，微晶纤维素80～120g，柠檬酸1～5g，10％聚乙烯吡烙烷酮60～100g，混合，制粒，压片；(3)颗粒剂：双歧杆菌分子微生态制剂原粉10～50g，加入乳糖250～400g，硬脂酸镁1.5～4.0g，羟丙纤维素25～55g，微晶纤维素80～140g，柠檬酸1～4g，10％聚乙烯吡烙烷酮60～100g，混合，制粒，分装2g/袋。制成双歧杆菌分子微生态制剂颗粒剂；(4)口服液：双歧杆菌分子微生态制剂原粉10～50g加入角鲨烯、甘露醇、聚山梨醇酯80和无菌水等合计5000ml，以超声波乳化成均匀的白色混悬液，经除菌过滤后供灌装，制成双歧杆菌分子微生态制剂口服液。

与现有技术相比，本发明特征在于：1)、作为第一、第二代双歧杆菌活菌及死菌体制剂产品主要机制是，通过补充或增加人体内的双歧杆菌，调整肠道菌群失调肠菌群，恢复肠道微生态平衡。本发明不用双歧杆菌活菌体或死菌体，而是用双歧杆菌菌体提取物。包含的WPG、DNA作为健康信号分子可激活人体巨噬细胞内的PKC(核因子)，促进有益的白细胞介素产生，Ca⁺⁺离子浓度升高和NO(一氧化氮)的产生，其作用是缓解心血管疾病、抗肿瘤和提高免疫力。本发明的双歧杆菌分子微生态制剂的作用主体是宿主细胞，双歧杆菌信号分子只是向宿主细胞提供健康信号，使宿主细胞产生相应的生理作用和健康表现。信号分子引起宿主细胞基因表达，在核糖体(Ribosome)合成相应的功能酶，通过功能酶发挥其生理作用。2)、双歧杆菌活菌体制剂由于双歧杆菌活菌体受温度、氧气及本身遗传规律的制约，制品只能在低温下保藏，菌体死亡率高，产品货架期非常短；而双歧杆菌死菌制剂有其功效因子不明确，难于鉴定和检测，此类制品市场上很少见。本发明的双歧杆菌分子微生态制剂其功效因子明确，易于检测，制品可进行工业化生产。产品可在常温下保藏，具有产品稳定、货架期长等特点。

具体实施方式

实施例一、双歧杆菌分子微生态制剂制备工艺如下：将长双歧杆菌(B.longum)菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量0.5-1.5％酵母浸膏、1-2.5％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1.5％牛肉膏培养液基中经35℃-38℃厌氧发酵后，经离心浓缩后获得双歧杆菌菌体浓缩物。将该双歧杆菌菌体浓缩物加蒸馏水，以超声波法破碎菌体细胞壁。分别用含胰蛋白酶(1-2mg/ml)、糜蛋白酶(1-2mg/ml)和胃蛋白酶(1-2mg/ml)及0.01m盐酸水解12-24小时，离心、水洗，获得细胞壁粗提物。细胞壁粗提物分别以乙醚-乙醇、氯仿-甲醇提取12-24小时。溶媒提取后的细胞提取物加入100-200mM的海藻糖作为冻干保护剂将本制品进行冷冻干躁。获得的干燥物于研钵中研细、过筛，即得双歧杆菌分子微生态制剂原粉。

本双歧杆菌分子微生态制剂其产品特征是：1)细胞壁糖检查，称取原粉0.01g加15％正丁醇水溶液各配制成10mg/ml溶液。吸取0.5ml于试管中，滴加0.05％蒽酮硫酸试剂1.0ml，摇匀即呈蓝绿色。2)采用紫外分光光度法测定制品中双歧杆菌DNA A260nm/A280nm为1.89-2.05。3)外观应为白色粉术。4)干燥失重检查，减失重量应不高于5％。5)本制品中不应检测出甲醇、乙醇、氯仿的残留。

实施例二、将青春双歧杆菌(B.Adolescentis)菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量0.5-1.5％酵母浸膏、1-2.5％葡萄糖、0.5-1.5％蛋白胨、0.5-1.5％牛肉膏培养液基中经35℃-38℃厌氧发酵后，经离心浓缩后获得双歧杆菌菌体浓缩物。将该双歧杆菌菌体浓缩物加蒸馏水，以1-2％溶菌酶酶法破碎菌体细胞壁。分别用含胰蛋白酶(1-2mg/ml)、糜蛋白酶(1-2mg/ml)和胃蛋白酶(1-2mg/ml)及0.01m盐酸水解12-24小时，离心、水洗，获得细胞壁粗提物。细胞壁粗提物分别以乙醚-乙醇、氯仿-甲醇提取12-24小时。溶媒提取后的细胞提取物于40℃-70℃减压于燥至无溶剂味为止。获得的干燥物于研钵中研细、过筛，即得双歧杆菌分子微生态制剂原粉。

本双歧杆菌分子微生态制剂其产品特征是：1)细胞壁糖检查，称取原粉0.01g加15％正丁醇水溶液各配制成10mg/ml溶液。吸取0.5ml于试管中，滴加0.05％蒽酮硫酸试剂1.0ml，摇匀即呈蓝绿色。2)采用紫外分光光度法测定制品中双歧杆菌DNA A260nm/A280nm为1.89-2.05。3)外观应为白色粉末。4)干燥失重检查，减失重量应不高于5％。5)本制品中不应检测出甲醇、乙醇、氯仿的残留。

1、动物急性毒性试验：采用昆明种小鼠，共20只，分为两组，试验组注射量相当5g/kg.d，给药后连续观察7d，与对照组小鼠比较，进食、活动、大便、皮毛及各种反射均无异常，两组小鼠无一死亡，体重增长组间比较亦无明显差异。提示该药无明显急性毒性作用，临床拟用量安全。

2、对小鼠自发活动次数的影响：昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄兼用，共75只，随机分成5个剂量组，每组15只。将5个实验组的小鼠分别注射生理盐水、0.25％苯甲酸钠咖啡因、0.075％氯丙嗪、10mg/ml和40mg/ml双歧杆菌份子微生态制剂，注射剂量都是0.1ml/10g。分别在0-15分钟和15-30分钟内观察记录小鼠自发活动次数。结果见表1。

表1  乳杆菌对小鼠自发活动影响(*P＜0.01，**P＜0.001)

药物	剂量	动物数	用药后小鼠自发活动数(X±SD)
					0-15min	15-30min
			生理盐水0.25％苯甲酸钠咖啡因0.075％氯丙嗪10mg/ml双歧分子制剂30mg/ml双歧分子制剂	0.1ml/10g0.1ml/10g0.1ml/10g0.1ml/10g0.1ml/10g			1515151515	43.2±15.4111.5±26.1**12.7±7.4**37.9±25.649.7±6.7	26.0±10.897.7±25.1**0.6±0.9**22.2±11.7**28.1±5.9

结果显示，与生理盐水比较，本制品对小鼠自发活动此无明显影响。

3、对大鼠血压及呼吸的影响：采用Wistar大鼠，体重范围150g-200g，雌雄兼用，共48只，随机分成4个剂量组，每组12只。将4个组的大鼠现腹腔注射20％乌拉坦1g/kg麻醉。麻醉后，固定，剪去颈部毛，正中切开颈部皮肤，在侧部颈动脉插上预先灌有肝素盐水的动脉套管，记录药前血压正常值。待血压平稳后，分别腹腔注射生理盐水、10mg/ml双歧分子制剂；生理盐水、30mg/ml双歧分子制剂，注射剂量都是0.2ml/100g。在注射后5分钟、10分钟和15分钟，分别观察记录小鼠血压情况。实验结果见表2

表2  双歧杆菌制剂对大鼠血压影响

药物	剂量	用药后大鼠血压(X±SD)
					5min	15min	30min
		生理盐水10mg/ml双歧分子制剂生理盐水30mg/ml双歧分子制剂	0.2ml/100g0.2ml/100g0.2ml/100g0.2ml/100g	96.2±1.994.7±3.597±3.494.2±10.0				96.1±3.495.2±2.496.7±0.695.3±14.1	95.2±1.093.8±3.196.8±0.086.7±8.6

结果表明：小剂量组合大剂量组对大鼠血压及呼吸均没有任何影响.提示双歧杆菌分子微生态制剂在实验剂量内静脉注射，对大鼠无明显不良反应。

4、自动过敏实验：豚鼠5只，由大连医科大学实验动物中心提供，体重350±50g，雌雄兼用。本实验室检测双歧杆菌分子微生态制剂对豚鼠经皮下注射的自动过敏性。实验前用生理盐稀释本制剂为30mg/ml。经皮下注射致敏。注射量为0.5ml/kg。10天后再经心脏注射，注射量为10ml/kg。观察动物有无过敏反应。结果显示，全部5只动物均未出现过敏症状，解剖后未发现异常。由此得出结论，双歧杆菌份子微生态制剂不会引起过敏反应。

实施例三、青春型双歧杆菌分子微生态制剂原粉制造同实施例二。对荷瘤小鼠抗肿瘤实验如下：Balb/C小鼠，雄性，18-22g，随机分组(1)肿瘤对照组：将传代s180细胞自动物腋下注入1×10⁶/0.2ml/小鼠；(2)双歧杆菌分子微生态制剂组：注入细胞瘤后隔日注入0.5mg/0.2ml/小鼠，连续7天注入；(3)双歧杆菌活菌制剂组：注入细胞瘤后隔日注入1×10⁷cfu/0.2ml/小鼠，连续7天注入。(4)正常对照组：动物不注入瘤细胞，小鼠每日注入蒸馏水0.2ml/小鼠。眼球取血，分离各组动物血清采用NO试剂盒测定NO含量；采用酶联免疫双抗体夹心法测定TNF-α及酶联免疫双抗体夹心法测定IL-6.结果如表3显示，双歧杆菌分子制剂同双歧杆菌活菌制剂一样具有激活NO及促进荷瘤小鼠产生肿瘤坏死因子和细胞因子的能力。提示其具有抗肿瘤作用。

表3  双歧杆菌分子微生态制剂的抗肿瘤作用。*P＜0.05

分组	NO(μmol/l)	TNF-α(ng/ml)	IL-6(ng/ml)
				分子制剂组活菌治疗组	135.45±27.52*128.12±34.56*	1.324±0.235*1.387±0.541*	0.142±0.013*0.131±0.014*

肿瘤对照组	75.23±15.78	0.894±0.354	0.079±0.014
				正常对照组	48.79±28.32	0.798±0.431	0.091±0.016

实施例四、加入低聚异麦芽糖940g，硬脂酸镁30g，分装0号胶囊，制成保健食品，口服使用。

实施例五、青春型双歧杆菌分子微生态制剂原粉制造同实施例二。取原冻干粉30g，加入乳糖340g，硬脂酸镁2.5g，羟丙纤维素40g，微晶纤维素120g，柠檬酸2g，10％聚乙烯吡烙烷酮80g，混合，制粒，压片，制成双歧杆菌分子微生态制剂片剂。

实施例六、长双歧杆菌分子微生态制剂原粉制造同实施例一、青春型双歧杆菌分子微生态制剂原粉制造同实施例二。取长双歧杆菌分子微生态制剂原冻干粉20g，青春型双歧杆菌分子微生态制剂原粉20g，，加入乳糖340g，硬脂酸镁2.5g，羟丙纤维素40g，微晶纤维素120g，柠檬酸2g，10％聚乙烯吡烙烷酮80g，混合，制粒，分装2g/袋。制成双歧杆菌分子微生态制剂颗粒剂。

实施例七、青春型双歧杆菌分子微生态制剂原粉制造同实施例二。合格的原粉12g加入角鲨烯、甘露醇、聚山梨醇酯80和无菌水等合计5000ml，以超声波乳化成均匀的白色混悬液，经除菌过滤后供灌装，制成双歧杆菌分子微生态制剂口服液。

Claims (7)

1.双歧杆菌信号分子微生态制剂，其特征在于是将双歧杆菌中的一种或多种经厌氧发酵、细胞破壁、酶解、抽提和干燥而得制剂原粉，其中的WPG、DNA含有多种双歧杆菌信号分子；产品特征是：1)细胞壁糖检查中将其配制成10mg/ml 15％正丁醇水溶液滴加0.05％蒽酮硫酸试剂1.0ml时即呈蓝绿色；2)采用紫外分光光度法测定制品中双歧杆菌DNA A260nm/A280nm为1.89-2.05；3)外观应为白色粉末；4)干燥失重不高于5％；5)检测无甲醇、乙醇、氯仿的残留；

所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.ifantis)、短双歧杆菌(B.breve)和青春双歧杆菌(B.Adolescentis)中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述双歧杆菌信号分子微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂为口服胶囊：双歧杆菌分子微生态制剂原粉10～50g，加入低聚异麦芽糖500～1000g，硬脂酸镁10～50g，分装0号胶囊。

3.根据权利要求1所述双歧杆菌信号分子微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂为片剂；双歧杆菌分子微生态制剂原粉10～50g，加入乳糖200～450g，硬脂酸镁2.0～4.0g，羟丙纤维素30～50g，微晶纤维素80～120g，柠檬酸1～5g，10％聚乙烯吡烙烷酮60～100g，混合，制粒，压片。

4.根据权利要求1所述双歧杆菌信号分子微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂为颗粒剂：双歧杆菌分子微生态制剂原粉10～50g，加入乳糖250～400g，硬脂酸镁1.5～4.0g，羟丙纤维素25～55g，微晶纤维素80～140g，柠檬酸1～4g，10％聚乙烯吡烙烷酮60～100g，混合，制粒，分装2g/袋。

5.根据权利要求1所述双歧杆菌信号分子微生态制剂，其特征在于所述微生态制剂为口服液：双歧杆菌分子微生态制剂原粉10～50g加入角鲨烯、甘露醇、聚山梨醇酯80和无菌水等合计5000ml，以超声波乳化成均匀的白色混悬液，经除菌过滤后供灌装。

6.双歧杆菌信号分子微生态制剂的制法，其特征在于其工艺步骤为：

(1)双歧杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的含有重量0.5~1.5％酵母浸膏、1~2.5％葡萄糖、0.5~1.5％蛋白胨、0.5~1.5％牛肉膏培养液基中经35~38℃厌氧发酵后，经离心浓缩后获得双歧杆菌菌体浓缩物；

(2)细胞破壁：将该双歧杆菌菌体浓缩物加蒸馏水，以超声波法、冻融法或1～2％溶菌酶酶法破碎菌体细胞壁；(3)酶解：分别用含胰蛋白酶(1～2mg/ml)、糜蛋白酶(1～2mg/ml)和胃蛋白酶(1～2mg/ml)及0.01m盐酸水解12～24小时，离心、水洗，获得细胞壁粗提物；

(4)抽提：细胞壁粗提物分别以乙醚-乙醇、氯仿-甲醇提取12～24小时；

(5)干燥：溶嫌提取后的细胞提取物于40～70℃减压干燥至无溶剂味为止即得双歧杆菌分子微生态制剂原粉。

7.根据权要求6所述双歧杆菌信号分子微生态制剂的制法，其特征在于其工艺步骤中的于燥步骤为：加入100～200mM/L的海藻糖进行冷冻干躁。