CN104120092B - 青春双歧杆菌及其应用以及功能食品组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis），其特征在于，所述青春双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.6270。本发明还提供了一种功能食品组合物及其制备方法，该方法包括：将本发明提供的青春双歧杆菌的菌体物质添加到食物中。本发明还提供了如上所述的青春双歧杆菌在制备具有免疫调节作用的功能食品组合物中的应用。本发明提供的青春双歧杆菌具有良好的免疫调节的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）及其应用以及一种功能食品组合物及其制备方法，具体地，涉及一种青春双歧杆菌，含有该青春双歧杆菌的功能食品组合物及其制备方法，以及该青春双歧杆菌在制备具有免疫调节作用的功能食品组合物中的应用。
背景技术
免疫是人体的一种生理功能，涉及非特异性免疫和特异性免疫，非特异性免疫不需要预先接触抗原，一旦病原体进入了机体，则会快速清除病原体。吞噬细胞和自然杀伤细胞都具有清除和杀伤作用，是非特异性免疫系统中的重要成员。特异性免疫具有特异地识别外来异物并具有免疫记忆能力的免疫细胞（T淋巴细胞和B淋巴细胞）。免疫系统之间最首要的信息传导子就是细胞因子，每种细胞因子对不同的细胞类型具有不同的刺激功能，它们通过结合细胞表面的特异性受体而诱导细胞的生长发育和功能活性。人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康，抵抗或防止微生物或寄生物的感染或其它所不希望的生物的侵入。
双歧杆菌作为人类肠道的生理菌，在维护宿主的健康上起了重要的作用，双歧杆菌能够通过菌体及其组分来发挥对机体的免疫促进功能。已有国外文献报道，双歧杆菌具有体外调节巨噬细胞功能活性的作用，并发现泡菜双歧杆菌及其细胞分离物（细胞壁成分）可显著提高单核/巨噬细胞株RAW264.7分泌细胞因子的活性。Comparison of cytokineand nitric oxide induction in murine macrophages between whole cell andenzymatically digested Bifidobacterium sp.obtained from monogastric animals（Kim DW etc.2007.J.Microbiol.45:305-310）报道了双歧杆菌BGN4及其细胞分离物（细胞壁、细胞胞质成分）可显著提高单核/巨噬细胞株RAW264.7的吞噬活性，且细胞胞质成分的刺激效果显著高于细胞壁成分。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有免疫调节功能的青春双歧杆菌。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种青春双歧杆菌（Bifidobacteriumadolescentis），其中，所述青春双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.6270。
第二方面，本发明提供了一种制备功能食品组合物的方法，其中，所述方法包括：将本发明提供的青春双歧杆菌的菌体物质添加到食物中。
第三方面，本发明提供了一种由如上所述的方法制备的功能食品组合物。
第四方面，本发明提供了如上所述的青春双歧杆菌在制备具有免疫调节作用的功能食品组合物中的应用。
本发明提供的青春双歧杆菌的活菌体、死菌体、细胞壁成分以及胞浆提取物均具有良好的免疫调节的作用。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis），于2012年6月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6270。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis），其中，该青春双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.6270。
本发明的青春双歧杆菌分离自广西巴马县长寿老人的粪便。
本发明提供的青春双歧杆菌经过培养能够产生大量青春双歧杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述青春双歧杆菌增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接种量将青春双歧杆菌的菌株接种于双歧杆菌培养基中，并且在厌氧条件下，在15-38℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。所述双歧杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合双歧杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌——生物学基础及应用》（杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版）中所述的乳酸菌培养基（MRS）。
本发明可以进一步分离上述培养液中的青春双歧杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域技术人员公知的条件，本发明在此不再赘述。
第二方面，本发明提供了一种制备功能食品组合物的方法，其中，所述方法包括：将本发明提供的青春双歧杆菌的菌体物质添加到食物中。
本发明的发明人在研究中发现，无论是青春双歧杆菌的活菌体、青春双歧杆菌的死菌体、青春双歧杆菌的细胞壁还是青春双歧杆菌的胞浆提取物均具有良好的免疫调节作用，因此提供的制备功能食品组合物的方法包括将青春双歧杆菌的活菌体、青春双歧杆菌的死菌体、青春双歧杆菌的细胞壁和青春双歧杆菌的胞浆提取物中的一种或多种添加到食品中。本发明的发明人还发现，当将青春双歧杆菌的细胞壁添加到食品中时，可以进一步增强双歧杆菌对机体的免疫调节作用，所以优选的，制备功能食品组合物的方法包括将青春双歧杆菌的细胞壁添加到食品中。
其中，所述青春双歧杆菌的死菌体的制备方法没有特别的限制，例如，可以将上述培养后的青春双歧杆菌的活菌体加热致死，也可以将其辐射致死，还可以将其暴露于氧气中致死。所述加热致死的条件可以包括：温度为65-100℃，时间为0.5-1.5h。
其中，所述青春双歧杆菌的细胞壁和青春双歧杆菌的胞浆提取物的制备方法也没有特别的限制，例如可以采用超声并离心的方法制备，具体地，将上述培养后的青春双歧杆菌的活菌体用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次后重悬于蒸馏水中，并进行超声破碎，条件可以为：温度为0-4℃，功率为40-60W，每间隔20-30s超声20-30s，时间为10-20min，超声结束后于0-4℃，800-1000g下离心20-40min，去除未破碎的青春双歧杆菌细胞，再将上清液于0-4℃，33000-37000g下离心20-40min，沉淀即为双歧杆菌的细胞壁，上清液即为双歧杆菌的胞浆提取物。
根据本发明，尽管将青春双歧杆菌的菌体物质添加到食物中，即可实现本发明的目的，即起到免疫调节的作用，但优选情况下，以功能食品组合物的总重量为基准，所述青春双歧杆菌的菌体物质的添加量为10-70重量%，优选为30-50重量%。在上述优选情况下，功能食品组合物的免疫调节作用更显著。
上述所述菌体物质在功能食品组合物中的含量均是指经上述菌体物质的干物质的含量。但需要指出的是，在实际应用的过程中，在所述功能食品组合物中添加的菌体物质可以为菌体物质的干物质，例如，冻干后的干粉，也可以添加菌体物质的湿物质。
本发明中，食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食物也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述功能食品组合物中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。
第三方面，本发明提供了一种由如上所述的方法制备的功能食品组合物。
符合上述要求的功能食品组合物可以包括青春双歧杆菌的培养液（例如经该青春双歧杆菌发酵制得的发酵乳制品）、分离的青春双歧杆菌的活菌体或死菌体、双歧杆菌的活菌体经破碎分离后得到的细胞壁或胞浆提取物，等等。
本发明中，功能食品组合物还含有食物，食物如前所述，在此不再赘述。
第四方面，本发明提供了如上所述的青春双歧杆菌在制备具有免疫调节作用的功能食品中的应用。
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
在下述制备例、实施例和对比例中：
实验菌株：青春双歧杆菌A为本发明的青春双歧杆菌（该菌株于2012年6月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6270）。
实验材料：小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7，购自中国典型培养物保藏中心；MRS培养基，购于北京陆桥公司；小鼠IL-6ELISA试剂盒和小鼠TNF-αELISA试剂盒均购自Rapidbio公司；DMEM培养基（含2重量%DMEM培养基干粉、10体积%的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素），其中DMEM培养基干粉和胎牛血清均购自Hyclone公司，青霉素和链霉素均购自北京陆桥公司；LPS（细菌脂多糖），购自sigma公司。
PBS缓冲液：137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，pH7.2-7.4。
实验仪器：UV-2102紫外分光光度计，UNICO公司；MCO-15AC型CO2培养箱，SANYO公司；高压灭菌锅，型号为ZDX35BI，购自上海申安医疗器械厂；恒温培养箱，型号为DNP9082，购自上海精宏实验设备有限公司；低温高速离心机，型号为3K30，购自德国Satorious公司。
制备例
（1）青春双歧杆菌A的细胞壁以及胞浆提取物的制备
将青春双歧杆菌A以1体积%的接种量接种至MRS液体培养基中，于充氮厌氧瓶中37℃培养12h至对数末期，得到青春双岐杆菌A的培养液。取20mL所述培养液用PBS缓冲液洗涤两次后重悬于蒸馏水中，并将菌体细胞进行超声破碎，条件为：温度为0℃，功率为50W，每间隔30s超声30s，时间为15min。超声结束后于4℃，1000g下离心30min去除未破碎的青春双歧杆菌菌体，再将上清液于4℃，35000g下离心20min，沉淀即为青春双歧杆菌的细胞壁，上清即为青春双歧杆菌的胞浆提取物，分别冻干后于-20℃保存备用。
（2）青春双歧杆菌A的死细菌的制备
取20mL上述（1）中培养液菌体经PBS缓冲液洗涤两次后，2600g离心10min，重悬于蒸馏水，经95℃热致死30min后，冻干，称重，保存于-20℃保存备用。
实施例1
用于说明本发明提供的青春双歧杆菌的细胞壁的免疫调节作用
（1）将上述制备例（1）中冻干的细胞壁溶于DMEM培养基中，含量为40重量%。
（2）将小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7以4×105个细胞/mL的接种量接种于DMEM培养基中，37℃，5体积%CO2的条件下培养48小时，然后将培养后的细胞转移至24孔板中，每孔细胞密度为5×105个细胞/mL，体积为1ml，并加入100μl步骤（1）中制备的细胞壁溶液。作用24小时后收集细胞培养上清液。
（3）利用Griess法（Green LC,Wagner DA,Glogowski J,Skipper PL,Wishnok JS,Tannenbaum SR(1982).Analysis of nitrate,nitrite,and[15N]nitrate in biologicalfluids.Anal.Biochem.126:131-138）测定步骤（2）中得到的经细胞壁作用的巨噬细胞培养上清液中的NO的含量，得到巨噬细胞NO的释放量，结果见表1。
（4）通过小鼠IL-6ELISA试剂盒以及小鼠TNF-αELISA试剂盒，并根据其说明书测定步骤（2）中得到的经细胞壁作用的巨噬细胞培养上清液中的IL-6的含量，TNF-α的含量，分别得到巨噬细胞IL-6和TNF-α的分泌量，结果见表1。
（5）采用中性红法（Yu M,Xu X,Qing Y,Luo X,Yang Z,Zheng L(2009).Isolationof an anti-tumor polysaccharide from Auricularia polytricha(jew’s ear)and itseffects on macrophage activation.Eur.Food Res.Technol.228:477-485）测定小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7的吞噬活性，结果见表1。其吞噬活性=实验组OD540/空白对照组OD540。
对比例1
本对比例用于说明自然状态下小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7的NO的释放量、IL-6的分泌量、TNF-α的分泌量以及吞噬活性
按照实施例1中的方法对小鼠单核/巨噬细胞株进行培养以及各免疫指标的测试，不同的是，步骤（2）中不加入步骤（1）中制备的细胞壁溶液，而是加入等体积的DMEM培养基。测定巨噬细胞NO的释放量、IL-6的分泌量、TNF-α的分泌量以及吞噬活性，结果见表1。
对比例2
本对比例用于说明公认的具有免疫调节作用的LPS的免疫调节作用
按照实施例1中的方法进行小鼠单核/巨噬细胞株的培养以及各免疫指标的测试，不同的是，步骤（1）中制备的为含有LPS的溶液。其中，巨噬细胞NO的释放量、IL-6的分泌量、TNF-α的分泌量以及吞噬活性结果见表1。
实施例2
用于说明本发明提供的青春双歧杆菌的细胞壁的免疫调节作用
（1）将上述制备例（1）中冻干的细胞壁溶于DMEM培养基中，含量为30重量%。
（2）将小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7以4×105个细胞/mL的接种量接种于DMEM培养基中，37℃，5体积%CO2的条件下培养48小时，然后将培养后的细胞转移至24孔板中，每孔细胞密度为5×105个细胞/mL，体积为1ml，并加入100μl步骤（1）中制备的细胞壁溶液。作用24小时后收集细胞培养上清液。
（3）利用Griess法（Green LC,Wagner DA,Glogowski J,Skipper PL,Wishnok JS,Tannenbaum SR(1982).Analysis of nitrate,nitrite,and[15N]nitrate in biologicalfluids.Anal.Biochem.126:131-138）测定步骤（2）中得到的经细胞壁作用的巨噬细胞培养上清液中的NO的含量，得到巨噬细胞NO的释放量，结果见表1。
（4）通过小鼠IL-6ELISA试剂盒以及小鼠TNF-αELISA试剂盒，并根据其说明书测定步骤（2）中得到的经细胞壁作用的巨噬细胞培养上清液中的IL-6的含量，TNF-α的含量，分别得到巨噬细胞IL-6和TNF-α的分泌量，结果见表1。
（5）采用中性红法（Yu M,Xu X,Qing Y,Luo X,Yang Z,Zheng L(2009).Isolationof an anti-tumor polysaccharide from Auricularia polytricha(jew’s ear)and itseffects on macrophage activation.Eur.Food Res.Technol.228:477-485）测定小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7的吞噬活性，结果见表1。其吞噬活性=实验组OD540/空白对照组OD540。
实施例3
用于说明本发明提供的青春双歧杆菌的细胞壁的免疫调节作用
（1）将上述制备例（1）中冻干的细胞壁溶于DMEM培养基中，含量为50重量%。
（2）将小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7以4×105个细胞/mL的接种量接种于DMEM培养基中，37℃，5体积%CO2的条件下培养48小时，然后将培养后的细胞转移至24孔板中，每孔细胞密度为5×105个细胞/mL，体积为1ml，并加入100μl步骤（1）中制备的细胞壁溶液。作用24小时后收集细胞培养上清液。
（3）利用Griess法（Green LC,Wagner DA,Glogowski J,Skipper PL,Wishnok JS,Tannenbaum SR(1982).Analysis of nitrate,nitrite,and[15N]nitrate in biologicalfluids.Anal.Biochem.126:131-138）测定步骤（2）中得到的经细胞壁作用的巨噬细胞培养上清液中的NO的释放量，得到巨噬细胞NO的释放量，结果见表1。
（4）通过小鼠IL-6ELISA试剂盒以及小鼠TNF-αELISA试剂盒，并根据其说明书测定步骤（2）中得到的经细胞壁作用的巨噬细胞培养上清液中的IL-6的含量，TNF-α的含量，分别得到巨噬细胞IL-6和TNF-α的分泌量，结果见表1。
（5）采用中性红法（Yu M,Xu X,Qing Y,Luo X,Yang Z,Zheng L(2009).Isolationof an anti-tumor polysaccharide from Auricularia polytricha(jew’s ear)and itseffects on macrophage activation.Eur.Food Res.Technol.228:477-485）测定小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7的吞噬活性，结果见表1。其吞噬活性=实验组OD540/空白对照组OD540。
实施例4
用于说明本发明提供的青春双歧杆菌的细胞壁的免疫调节作用
按照实施例1中的方法进行青春双歧杆菌的细胞壁的免疫调节作用，不同的是，步骤（1）中制备的为含量为10重量%的青春双歧杆菌的细胞壁溶液。测定巨噬细胞NO的释放量、IL-6的分泌量、TNF-α的分泌量以及吞噬活性，结果见表1。
实施例5
用于说明本发明提供的青春双歧杆菌的细胞壁的免疫调节作用
按照实施例1中的方法进行青春双歧杆菌的细胞壁的免疫调节作用，不同的是，步骤（1）中制备的为含量为70重量%的青春双歧杆菌的细胞壁溶液。测定巨噬细胞NO的释放量、IL-6的分泌量、TNF-α的分泌量以及吞噬活性，结果见表1。
实施例6
用于说明本发明提供的青春双歧杆菌的活菌体的免疫调节作用
按照实施例1中的方法进行青春双歧杆菌的活菌体的免疫调节作用，不同的是，步骤（1）中制备的为青春双歧杆菌的活菌体溶液。测定巨噬细胞NO的释放量、IL-6的分泌量、TNF-α的分泌量以及吞噬活性，结果见表1。
实施例7
用于说明本发明提供的青春双歧杆菌的死菌体的免疫调节作用
按照实施例1中的方法进行青春双歧杆菌的死菌体的免疫调节作用，不同的是，步骤（1）中制备的为青春双歧杆菌的死菌体溶液。测定巨噬细胞NO的释放量、IL-6的分泌量、TNF-α的分泌量以及吞噬活性，结果见表1。
实施例8
用于说明本发明提供的青春双歧杆菌的胞浆提取物的免疫调节作用
按照实施例1中的方法进行青春双歧杆菌的胞浆提取物的免疫调节作用，不同的是，步骤（1）中制备的为青春双歧杆菌的胞浆提取物溶液。测定巨噬细胞NO的释放量、IL-6的分泌量、TNF-α的分泌量以及吞噬活性，结果见表1。
表1
NO是一种重要的免疫调节因子，能够调节自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞等免疫细胞的活性，并影响细胞因子的释放量。IL-6及TNF-α则是由巨噬细胞分泌的一类促炎因子，能够介导嗜中性粒细胞及单核细胞对有害菌及肿瘤细胞的杀伤作用并促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖。
将实施例1-8与对比例1进行比较可以看出，本发明的青春双歧杆菌A具有促进巨噬细胞释放NO、分泌IL-6和TNF-α及其吞噬活性的作用。
将实施例1-3分别与实施例4和实施例5进行比较可以看出，以混合物的总重量为基准，青春双歧杆菌A的添加量为30-50重量%，可以更加显著促进巨噬细胞释放NO、分泌IL-6和TNF-α及其吞噬活性；将实施例1与实施例6-8进行比较可以看出，青春双歧杆菌A的细胞壁更加显著的促进巨噬细胞释放NO、分泌IL-6和TNF-α及其吞噬活性。
综上所述，本发明提供的青春双歧杆菌的活菌体、死菌体、细胞壁成分以及胞浆提取物均具有免疫调节的作用。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (8)
1.一种青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，其特征在于，所述青春双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.6270。
2.一种制备功能食品组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的青春双歧杆菌的菌体物质添加到食物中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述青春双歧杆菌的菌体物质包括青春双歧杆菌的活菌体、青春双歧杆菌的死菌体、青春双歧杆菌的细胞壁和青春双歧杆菌的胞浆提取物中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述青春双歧杆菌的菌体物质为青春双歧杆菌的细胞壁。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其中，以重量计，所述青春双歧杆菌的菌体物质的添加量为所述功能食品组合物的总重量的10-70％。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，以重量计，所述青春双歧杆菌的菌体物质的添加量为所述功能食品组合物的总重量的30-50％。
7.由权利要求2-6中任意一项所述的方法制备的功能食品组合物。
8.权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备具有免疫调节作用的功能食品组合物中的应用。
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