CN106359904A

CN106359904A - 罗伊氏乳杆菌在替代饲用抗生素中的应用

Info

Publication number: CN106359904A
Application number: CN201611062760.0A
Authority: CN
Inventors: 王丽; 王志林; 蒋宗勇; 温晓鹿; 杨雪芬; 马现永; 胡胜兰
Original assignee: Institute of Animal Science of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2017-02-01

Abstract

本发明公开一种罗伊氏乳杆菌在替代饲用抗生素中的应用，属于微生物及其应用领域。本发明提供罗伊氏乳杆菌是从健康仔猪分离得到，安全性高。在无抗饲粮中添加该菌株可较好防止仔猪断奶后腹泻，该菌株具有较好的促生长作用。该菌株可明显促进仔猪因断奶导致肠道黏膜损伤的修复，且具有免疫调节功能。综上所述，罗伊氏乳杆菌可作为抗生素替代品用于断奶仔猪抗腹泻和促生长作用。

Description

罗伊氏乳杆菌在替代饲用抗生素中的应用

技术领域

本发明属于微生物及其应用领域，特别涉及一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1在替代饲用抗生素中的应用。

背景技术

在现代养猪生产中，仔猪腹泻是导致严重经济损失最常见的原因，腹泻可导致仔猪生长减缓，免疫力下降，肠道功能紊乱等，进而减低饲料利用率，显著提高仔猪死亡率(Fairbrother et al.,2005)。致病菌引起的腹泻是断奶仔猪最常见的疾病(Fairbrotheret al.,2005)。目前控制断奶仔猪致病菌导致的腹泻的主要方法是使用饲用抗生素(Barton,2000)。抗生素发现并开始大规模使用的这几十年中，已经成为提高畜禽生产性能和预防疾病的常用添加剂(Thacker,2013)。饲料中使用抗生素在促进畜禽生长的同时，其弊端日益明显，包括：耐药菌株的产生和流行、引起机体内源感染或二重感染、导致机体免疫功能下降、药物在畜产品中残留并通过食物链影响人类健康和生态环境。随着人们对公共安全、环境保护和食品安全意识的不断提高，人们对饲用抗生素带来的巨大经济效益背后的隐藏问题开始关注起来。抗生素滥用导致的致病菌耐药性问题已经成为了危害公共卫生的重大因素(Docic et al.,2003)。瑞士于1986年首先宣布全面禁用饲用抗生素促生长剂，成为了禁用饲用抗生素的国际先行者；在2006年，欧盟宣布全面禁止饲用抗生素的使用；2011年，韩国成为第一个全面禁用饲用抗生素的亚洲国家；2014年，美国宣布3年时间过渡到全面禁用饲用抗生素。目前，中国是使用抗生素最多国家，其中饲用抗生素滥用情况尤为严重，我国年产抗生素约21万吨，其中有近半被用于了畜牧养殖业，国内饲用抗生素用量超出美国4倍以上。在全球禁用饲用抗生素的大趋势下，在可预见的将来，中国在畜禽生产中饲用抗生素势必也将会逐步被禁用。因此为了保证我国畜禽业的正常健康发展，必须寻找一种无毒害、无残留、生产效果好的饲料添加剂来替代抗生素。在此背景之下，安全、环保、高效的促生长饲料添加剂正在被不断的开发，其中的佼佼者有益生菌制剂、酸化剂、酶制剂、寡聚糖、植物提取物和中草药等，而益生菌制剂被认为是上述替代品中最有潜力的抗生素替代品(Shanahan et al.,2000)。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1在替代饲用抗生素中的应用。该罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1从健康动物肠道筛选得到，通过微生物发酵、分离以及冷冻干燥工艺制备得到益生罗伊氏乳杆菌制剂。在体外肠上皮细胞模型试验中，该罗伊氏乳杆菌表现出具有典型的益生菌特征。在采用断奶仔猪进行罗伊氏乳杆菌替代饲用抗生素的应用效果评价试验过程中，该罗伊氏乳杆菌株可提高断奶仔猪生长性能；降低仔猪的腹泻率；可促进仔猪肠道损伤的修复，加强肠道屏障功能；同时该乳杆菌具有较强免疫调节功能。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1的无抗饲料。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1在替代饲用抗生素中的应用。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1，于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11154。

并在“201510751130.3、一株具有益生特征的罗伊氏乳杆菌菌株及其应用”中被公开。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1的培养条件：培养基采用MRS肉汤培养基，pH5.5，培养温度37±1℃，50～70rpm震荡培养24～48h。

所述的MRS肉汤培养基的组成成分为：酪蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、酵母提取物5g/L、磷酸氢二钾2g/L、枸橼酸钠2g/L、七水硫酸镁0.58g/L、四水硫酸锰0.25g/L、醋酸钠5g/L、吐温-80 1mL/L；pH为5.5，121℃高压灭菌15min，放于4℃冰箱中备用；MRS固体培养基(pH5.5)只需要在灭菌前加入15g/L琼脂即可。

一种无抗饲料，包括替代饲用抗生素的上述罗伊氏乳杆菌LR1菌株。

上述罗伊氏乳杆菌LR1可以通过微生物发酵、分离以及冷冻干燥工艺制备得到益生罗伊氏乳杆菌制剂，然后添加到饲料中替代饲用抗生素；也可通过微生物发酵后直接灌服或饮用罗伊氏乳杆菌培养液。

所述的罗伊氏乳杆菌LR1每天饲喂量为1×10¹⁰～2×10¹⁰CFU/仔猪。

所述的罗伊氏乳杆菌制剂可提高断奶仔猪平均日增重，降低料肉比。

所述的罗伊氏乳杆菌制剂可降低仔猪断奶后腹泻率。

所述的罗伊氏乳杆菌制剂可促进断奶仔猪肠道黏膜损伤的修复，加强肠道屏障功能。

所述的罗伊氏乳杆菌制剂具有明显的免疫调节功能，可降低断奶仔猪肠道炎症反应，维护仔猪肌体健康。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明提供罗伊氏乳杆菌是从健康仔猪分离得到，安全性高。在无抗饲粮中添加该菌株可较好防止仔猪断奶后腹泻，该菌株具有较好的促生长作用。该菌株可明显促进因断奶仔猪导致肠道黏膜损伤的修复，且具有免疫调节功能。综上所述，罗伊氏乳杆菌可作为抗生素替代品用于断奶仔猪抗腹泻和促生长作用。

附图说明

图1是实施例2中断奶公猪的腹泻率的结果。

图2是实施例3中断奶阉公猪的生长性能的结果。

图3是实施例3中断奶阉公猪的腹泻率的结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件。

实施例1罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1冻干菌粉制剂制备

制备MRS肉汤培养基，其组分为：酪蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、葡萄糖20g、酵母提取物5g、磷酸氢二钾2g、枸橼酸钠2g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、醋酸钠5g、吐温-801mL；将上述成分混溶于1000mL的水中，用浓盐酸调节pH为2.5，121℃高压灭菌15min，放于4℃冰箱中备用；

将Lactobacillus reuteri LR1菌株接种至MRS肉汤培养基中，37℃下50rpm培养24小时，按照体积比4％的接种量接种到MRS肉汤培养基中，37℃下50rpm培养24小时，之后4℃条件下10000rpm离心10min，收集细胞，然后按质量比1：2加入冻干保护剂(15～20％脱脂奶粉(m/v)+5％海藻糖+0.1％抗坏血酸)，搅拌混匀，于预冷3h，之后置于-80℃冷冻过夜，最后将样品置于真空冻干机内冻干36h。收集冻干菌粉，研磨过筛，

实施例2罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1替代饲用抗生素在断奶仔猪上抗腹泻效果

选用21日龄杜×(长×大)三元杂交30头断奶公猪进行试验，仔猪分为3组，分别为对照组(基础饲粮)、抗生素组(基础饲粮+抗生素)、和罗伊氏乳杆菌组(基础饲粮+罗伊氏乳杆菌)，每组10头。饲喂试验分组处理见表1。基础饲粮参照NRC2012及国标为标准配置，满足各营养物质需要量(表2)，试验期为28天。试验期间仔猪自由饮水每天定点添加饲料。保持猪舍的环境卫生，做好保温措施，记录好仔猪的腹泻率等。

表1试验分组

组别	饲粮处理
		对照组	0
抗生素组	金霉素300ppm+硫酸抗敌素60ppm
		罗伊氏乳杆菌组	罗伊氏乳杆菌(1×10¹⁰CFU/头·天)

表2基础饲粮配方

原料名称	配比(％)	营养物质	含量
				玉米	57.55	猪消化能(MJ/kg)	14.81
豆粕	27.59	粗蛋白％	20.01
				乳清粉	5.00	赖氨酸％	1.70
大豆油	1.89	蛋+胱氨酸％	0.92
				鱼粉	3.00	苏氨酸％	1.05
赖氨酸	0.73	色氨酸％	0.28
				苏氨酸	0.29	钙％	0.85
蛋氨酸	0.24	总磷％	0.70
				色氨酸	0.03	可利用磷％	0.48
磷酸氢钙	1.40
				石粉	0.85
次粉	0.30
				盐	0.14
1％预混料^*	1.00
				合计	100.00

注：*预混料向每千克全价料中提供微量成分：维生素A 550IU；维生素D 500IU；维生素E 66.1IU；维生素B₁₂ 28.2μg；核黄素5.1mg；泛酸12.6mg；烟酸29.8mg；胆碱540mg；Mn100mg；Zn100mg；Fe100mg；Cu150mg；Co1mg；Se0.25mg。

腹泻频率＝∑(仔猪腹泻天数×腹泻仔猪头数)/(试验仔猪总头数×正试期天数)×100％。(注：粪便评分标准见表3，评分在2分以上为腹泻)

表3粪便评分标准

程度	粪便外观	粪中含水	评分
				正常(无腹泻)	条形或粒状	<70	0
轻度腹泻	软粪、能成形	70-75	1
				中度腹泻	稠状、不成形、粪水未分离	75-80	2
严重腹泻	液状、不成形、粪水分离	>80	3

从图1可以看出，与对照组和抗生素组相比，罗伊氏乳杆菌组仔猪腹泻率最低。罗伊氏乳杆菌组仔猪多为轻度和中度腹泻，与抗生素组类似，而空白对照组存在严重腹泻情况，表明该罗伊氏乳杆菌菌株具有较好抗腹泻效果。

实施例3罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1制剂替代饲用抗生素在断奶仔猪上应用

饲养试验采用单因子试验设计，选取21日龄、健康的长大二元杂交断奶阉公猪90头(初始重在6.11±0.05kg)，随机分为3组，分别为对照组(基础饲粮)、抗生素组(基础饲粮+抗生素)、和罗伊氏乳杆菌组(基础饲粮+罗伊氏乳杆菌)，每组5个重复，每个重复6头。饲喂试验分组处理见表4。基础饲粮参照NRC2012及国标为标准配置，满足各营养物质需要量(表1)。试验期为42天。具体从21日龄开始到63日龄结束。试验在广东省农业科学院动物科学研究所营养试验猪场开展。栏舍通风良好、干燥舒适、保温设备及饮水设备齐全。试验开始前对猪舍进行完全消毒杀菌处理。仔猪自由采食，自由饮水，每天添料4次，分别为早上8点，中午12点及下午4点，晚上8点。免疫及驱虫程序按照猪场常规流程进行，并在饲喂仔猪时记录其采食及腹泻情况，做好登记。仔猪采食后记饲粮消耗量。试验所用的饲粮均为粉料，其中罗伊氏乳杆菌组饲粮为每次饲喂前将罗伊氏乳杆菌冻干粉(添加量均为5×10¹⁰CFU/kg)均匀添加入饲粮中进行饲喂。

表4试验分组

组别	饲粮处理	动物数量
			对照组	0	30
抗生素组	金霉素300ppm+硫酸抗敌素60ppm	30
			罗伊氏乳杆菌组	罗伊氏乳杆菌(5×10¹⁰CFU/kg)	30

平均日增重：试验期内每组仔猪平均每天增加的重量；日采食量：试验期内每一头仔猪每天所采食饲料的重量；料重比：日采食量和日增重之比；

从图2中可以看出，罗伊氏乳杆菌组平均日增重显著高于对照组和抗生素组(P<0.05)，分别提高了32.28％和15.61％。同时，罗伊氏乳杆菌组饲料转化率低于对照组，略高于抗生素组但差异均不显著(P>0.05)。

从图3中可以看出，在试验的全期，抗生素组和罗伊氏乳杆菌组的腹泻率均低于对照组，分别降低25.37％和25.47％，其中，罗伊氏乳杆菌组和抗生素组仔猪腹泻率相近。

表5乳杆菌对断奶仔猪肠道通透性的影响

指标	对照组	抗生素组	罗伊氏乳杆菌组
				LPS(Eu/L)	174.10±9.44^a	154.17±10.21^ab	147.49±9.22^b
DAO(pg/mL)	2612.60±185.91^a	2570.02±183.15^a	1866.38±128.15^b

在脂多糖(LPS)指标上，罗伊氏乳杆菌组显著低于对照组(P<0.05)，而抗生素组与对照组差异不显著(P>0.05)。在二胺氧化酶(DAO)指标上，罗伊氏乳杆菌组均显著低于对照组(P<0.05)，降低了28.56％，而抗生素组与对照组差异不显著。添加罗伊氏乳杆菌能显著降低血清内毒素(LPS)含量和血清二胺氧化酶(DAO)活性，而添加抗生素不显著影响血清LPS含量和DAO酶活性。说明罗伊氏乳杆菌组仔猪肠道屏障功能优于对照组和抗生素组。

表6乳杆菌对断奶仔猪肠道黏膜形态的影响

与对照组相比，添加罗伊氏乳杆菌均能显著增加十二指肠和空肠的绒毛高度；添加罗伊氏乳杆菌能显著增加空肠绒毛高度。添加抗生素和罗伊氏乳杆菌均能显著降低空肠隐窝深度、回肠隐窝深度。添加罗伊氏乳杆菌能显著增加十二指肠绒毛高度/隐窝深度的比值；添加抗生素和罗伊氏乳杆菌均能显著增加空肠绒毛高度/隐窝深度的比值；添加抗生素和罗伊氏乳杆菌均能显著增加回肠绒毛高度/隐窝深度的比值。

表7罗伊氏乳杆菌对断奶仔猪空肠黏膜炎症反应相关蛋白含量的影响(pg/mL)

指标	对照组	抗生素组	罗伊氏乳杆菌组
				IL-6	20.46±0.82^a	15.76±0.99^b	16.53±0.73^b
TNF-α	108.94±6.01^a	102.30±3.67^a	90.27±2.67^b
				IFN-γ	314.07±12.09^a	326.31±13.12^a	246.07±5.89^b
TGF-β	22.45±1.16^b	30.95±3.64^ab	33.81±2.23^a

表8罗伊氏乳杆菌对断奶仔猪肠道黏膜sIgA含量的影响(μg/mL)

指标	对照组	抗生素组	罗伊氏乳杆菌组
				空肠	65.89±4.38^b	79.10±0.74^a	77.75±2.5^a
回肠	24.94±2.34^b	24.61±1.89^b	35.67±2.85^a

如表7所示，抗生素组、罗伊氏乳杆菌组空肠粘膜炎症因子IL-6含量显著低于对照组(P<0.05)，而抗生素组和罗伊氏乳杆菌组差异不显著。罗伊氏乳杆菌组空肠粘膜炎症因子TNF-α和IFN-γ含量显著低于对照组和抗生素组(P<0.05)。罗伊氏乳杆菌空肠粘膜抑炎因子TGF-β含量显著高于对照组(P<0.05)。表明在无抗饲料中添加罗伊氏乳杆菌可降低炎症因子表达同时提高抑炎因子表达。如表8所示，与对照组相比，添加罗伊氏乳杆菌均显著提高空肠和回肠黏膜sIgA含量。在空肠段，抗生素组和罗伊氏乳杆菌组黏膜sIgA含量差异不显著，而在回肠段，罗伊氏乳杆菌组sIgA含量显著高于抗生素组。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LR1在替代饲用抗生素中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的罗伊氏乳杆菌用于提高断奶仔猪平均日增重，降低料肉比。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的罗伊氏乳杆菌用于降低仔猪断奶后腹泻率。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的罗伊氏乳杆菌用于促进断奶仔猪肠道黏膜损伤的修复，加强肠道屏障功能。

5.一种无抗饲料，其特征在于：包括替代饲用抗生素的罗伊氏乳杆菌LR1菌株。

6.根据权利要求5所述的无抗饲料，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌LR1通过微生物发酵、分离以及冷冻干燥工艺制备得到益生罗伊氏乳杆菌制剂，然后添加到饲料中替代饲用抗生素；或者，通过微生物发酵后直接灌服或饮用罗伊氏乳杆菌培养液。

7.根据权利要求5或6所述的无抗饲料，其特征在于：