CN115176866A - 一种富集纳米硒和氧化锌的微生态饲料添加剂及制备方法 - Google Patents
一种富集纳米硒和氧化锌的微生态饲料添加剂及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种富集纳米硒和氧化锌的微生态饲料添加剂及制备方法，属于微生态制剂技术领域。由罗伊氏乳杆菌LactobacillusreuteriATCC53608对底物发酵制备得到，所述底物包括硫酸锌和亚硒酸钠。本发明中，罗伊氏乳杆菌LactobacillusreuteriATCC53608能够将亚硒酸钠转化为纳米硒，将硫酸锌转化为氧化锌，并富集于菌体。本发明的饲用复合微生态制剂能够作为补硒剂和补锌剂，为动物安全补充所需的微量元素，克服了现有技术在饲料中直接添加亚硒酸钠、硫酸锌所带来的安全隐患和负面效应，满足了绿色养殖业对“替抗、减排”的迫切需求，推动了畜牧养殖业健康可持续发展。
Description
技术领域
本发明属于微生态制剂技术领域，具体涉及一种富集纳米硒和氧化锌的微生态饲料添加剂及制备方法。
背景技术
锌是动物机体内重要的微量元素。当动物缺乏锌时将会出现一系列的缺乏症。例如，家禽缺锌会造成鸡生长性能下降和腿骨变形，锌对鸡的繁殖性能也有很大的影响，此外，锌还具有一定的免疫功能。缺锌时，生长鸡生长发育缓慢，羽毛生长不良，诱发皮炎。成年鸡产蛋量减少，蛋壳变薄，种蛋孵化率降低，胚胎出现畸形。再比如，日粮中锌含量的多少与猪对锌的需要量密切相关，如果日粮中的锌含量不能满足动物的需求，那么对于仔猪股骨会变小，影响发育。
硒也是动物机体内重要的微量元素。缺硒会导致幼畜腹泻、母牛乳房炎、胎衣不下、不育、流产、大肠杆菌病、猪桑葚心以及繁殖力下降、胚胎退化、免疫功能降低、幼畜存活率降低、使畜禽生长迟缓等。
养殖户在饲养动物的过程中会在饲料中加入碳酸锌和亚硒酸钠，让动物食用，以补充锌和硒元素。然而，亚硒酸钠和硫酸锌的毒性作用较强，在使用过程中难以掌握其添加剂量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种富集纳米硒和氧化锌的微生态饲料添加剂及制备方法，能够解决目前养殖领域补硒和补锌添加剂毒性作用强的问题。
本发明提供了一种饲用复合微生态制剂，由益生菌对底物发酵制备得到，所述底物包括硫酸锌和亚硒酸钠；所述益生菌包括：罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC53608。
优选的，所述饲用复合微生态制剂中Se的含量为32.8～38.4mg/g；所述饲用复合微生态制剂中Zn的含量为7.22～10.02mg/g。
本发明还提供了上述方案所述的饲用复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述益生菌菌液和亚硒酸钠混合，进行第一发酵，得到第一发酵产物；
2)对所述第一发酵产物进行固液分离，收集固体组分，将所述固体组分和硫酸锌水溶液混合，进行第二发酵，得到含有饲用复合微生态制剂的第二发酵产物。
优选的，所述第一发酵的发酵体系中亚硒酸钠的初始浓度为1～1.5mM。
优选的，所述硫酸锌水溶液中硫酸锌的浓度为3～5mM。
优选的，所述益生菌处于对数生长期。
优选的，在所述第二发酵后，还包括将所述第二发酵的发酵产物和冻干保护剂混合，进行喷雾干燥。
优选的，所述冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：13％～17％脱脂奶粉、8％～12％海藻糖和3％～7％甘油。
本发明还提供了一种饲料，包括上述方案所述的饲用复合微生态制剂或者上述方案所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂。
优选的，所述饲料中饲用复合微生态制剂的添加量占饲料质量的1％～3％。
本发明提供了一种饲用复合微生态制剂，由益生菌对底物发酵制备得到，所述底物包括硫酸锌和亚硒酸钠；所述益生菌包括：罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC53608。本发明中，罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608能够将亚硒酸钠转化为纳米硒，将硫酸锌转化为氧化锌，并富集于菌体。本发明的饲用复合微生态制剂能够作为补硒剂和补锌剂，为动物安全补充所需的微量元素，克服了现有技术在饲料中直接添加亚硒酸钠(Na2SeO3)、硫酸锌(ZnSO4)所带来的安全隐患和负面效应，满足了绿色养殖业对“替抗、减排”的迫切需求，推动了畜牧养殖业健康可持续发展。此外，罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608具有改善宿主肠道健康、促进生长、降低腹泻及免疫调节等作用，能够发挥乳酸菌的益生性。
附图说明
图1为本发明的饲用复合微生态制剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteri ATCC53608的工艺流程；
图2为本发明的饲用复合微生态制剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteri ATCC53608的透射电镜(TEM)；
图3为本发明的饲用复合微生态制剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteri ATCC53608的X射线光电子能谱(XPS)。
具体实施方式
本发明提供了一种饲用复合微生态制剂，由益生菌对底物发酵制备得到，所述底物包括硫酸锌和亚硒酸钠；所述益生菌包括：罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC53608。
在本发明中，所述饲用复合微生态制剂中Se的含量优选为32.8～38.4mg/g，更优选为35.6mg/g；所述饲用复合微生态制剂中Zn的含量优选为7.22～10.02mg/g，更优选为8.62mg/g。
在本发明中，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心(保藏号CICC 6118，收藏时间2007.1.1，来源历史ATCC，其它保藏中心编号ATCC 53608)；所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608是一株猪源罗伊氏乳酸杆菌。本发明的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608能够将亚硒酸钠转化为纳米硒，将硫酸锌转化为氧化锌，并富集于菌体中。此外，罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608具有改善宿主肠道健康、促进生长、降低腹泻及免疫调节等作用。其次，罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608具有生长迅速、繁殖快、代谢能力强、适应性强等特点。
本发明还提供了上述方案所述的饲用复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述益生菌菌液和亚硒酸钠混合，进行第一发酵，得到第一发酵产物；
2)对所述第一发酵产物进行固液分离，收集固体组分，将所述固体组分和硫酸锌水溶液混合，进行第二发酵，得到含有饲用复合微生态制剂的第二发酵产物。
本发明首先将所述益生菌菌液和亚硒酸钠混合，进行第一发酵，得到第一发酵产物。
在本发明中，所述益生菌优选的处于对数生长期。在本发明中，所述益生菌菌液的制备方法优选的包括以下步骤：对所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608依次进行活化培养、富集培养，得到种子液；对所述种子液进行扩增培养，得到益生菌菌液。在本发明中，所述活化培养采用的培养基优选为MRS固体培养基；所述MRS固体培养基以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：质量百分含量为0.9％～1.1％的蛋白胨、质量百分含量为0.9％～1.1％的牛肉膏、质量百分含量为0.49％～0.51％的酵母膏、质量百分含量为0.19％～0.21％的柠檬酸氢二铵、质量百分含量为1.9％～2.1％的葡萄糖、质量百分含量为0.49％～0.51％的结晶乙酸钠、质量百分含量为0.19％～0.21％的磷酸氢二钾、质量百分含量为0.05％～0.07％的七水硫酸镁、质量百分含量为0.015％～0.035％的一水硫酸锰、体积百分含量为0.09％～0.11％的吐温80和质量百分含量为1.9％～2.1％的琼脂；更优选的，所述MRS固体培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：质量百分含量为1％的蛋白胨、质量百分含量为1％的牛肉膏、质量百分含量为0.5％的酵母膏、质量百分含量为0.2％的柠檬酸氢二铵、质量百分含量为2％的葡萄糖、质量百分含量为0.5％的结晶乙酸钠、质量百分含量为0.2％的磷酸氢二钾、质量百分含量为0.06％的七水硫酸镁、质量百分含量为0.025％的一水硫酸锰、体积百分含量为0.1％的吐温80和质量百分含量为2％的琼脂；所述MRS固体培养基的pH值优选为6.2～6.6，更优选为6.4；所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillusreuteri ATCC 53608接种于MRS固体培养基；所述活化培养的时间优选为48h；所述活化培养厌氧进行；所述活化培养的温度优选为37℃。
在本发明中，所述富集培养采用的培养基优选为MRS液体培养基；在所述活化培养后，本发明挑取罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608的单菌落接种于MRS液体培养基。在本发明中，所述MRS液体培养基的配方优选为在所述MRS固体培养基的基础上省略了琼脂；所述MRS液体培养基的pH值优选为6.2～6.6，更优选为6.4；所述富集培养的时间优选为48h；所述富集培养厌氧进行；所述富集培养的温度优选为37℃。
得到种子液后，本发明对所述种子液进行扩增培养；所述扩增培养采用的培养基优选为MRS液体培养基；所述种子液的接种量占MRS液体培养基的体积的1％；所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608的初始OD值优选为1；所述扩增培养的温度优选为37℃；所述扩增培养厌氧进行；所述扩增培养以罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteriATCC 53608处于对数期为准，时间优选为7h。
在本发明中，所述第一发酵的发酵体系中亚硒酸钠的初始浓度优选为1～1.5mM，更优选为1.2mM。在本发明中，所述第一发酵的温度优选为37℃；所述第一发酵的时间优选为20～30h，更优选为24h。在本发明中，经过第一发酵，罗伊氏乳杆菌Lactobacillusreuteri ATCC 53608将Na2SeO3转化为生物纳米硒SeNPs，并富集于菌体中。在本发明中，所述SeNPs的平均粒径为300±2nm。基于罗伊氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri ATCC53608生物合成的纳米硒具有功效广、急性毒性低、环境污染小、生物利用率高等优点。
得到第一发酵产物后，本发明对所述第一发酵产物进行固液分离，收集固体组分，将所述固体组分和硫酸锌水溶液混合，进行第二发酵，得到含有饲用复合微生态制剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteri ATCC 53608的第二发酵产物。
在本发明中，所述固液分离的方式优选的包括离心。在本发明中，所述离心的转速优选为5000～7000rpm，更优选为6000rpm；所述离心的温度优选为4℃；所述离心的次数优选为2次，每次离心的时间优选为8～12min，更优选为10min；在第一次离心后，收集沉淀，所述沉淀优选的经过洗涤，所述洗涤采用的试剂优选为生理盐水；所述洗涤的次数优选为3次；所述离心优选的于高速冷冻离心机中进行。
在本发明中，所述硫酸锌水溶液中硫酸锌的浓度优选为3～5mM，更优选为4mM。在本发明中，所述第二发酵的温度优选为37℃；所述第二发酵的时间优选为10～15h，更优选为12h。经过所述第二发酵，罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608将硫酸锌转化为氧化锌，并富集于菌体中。
在本发明中，在所述第二发酵后，优选的还包括将所述第二发酵的发酵产物和冻干保护剂混合，进行喷雾干燥。在本发明中，所述冻干保护剂优选的包括以下质量百分含量的组分：13％～17％脱脂奶粉、8％～12％海藻糖和3％～7％甘油，更优选的包括以下质量百分含量的组分：15％脱脂奶粉、10％海藻糖和5％甘油。
本发明利用Lactobacillus reuteri ATCC 53608将亚硒酸钠和硫酸锌分别生物转化生物合成纳米硒和氧化锌并有效富集，能够解决锌和硒的现有添加形式存在的安全性和生态环境问题。并且，本发明利用微生物转化硒和锌不受季节和气候的影响，生产周期短、无污染，是一种更为简便、经济、绿色、环保的方法。
本发明还提供了一种饲料，包括上述方案所述的饲用复合微生态制剂或者上述方案所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂。
在本发明中，所述饲料中饲用复合微生态制剂的添加量占饲料质量的1％～3％，优选为2％。
如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
参照图1，详细说明本发明：
实施例1利用罗伊氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608生物合成纳米硒和氧化锌并有效富集的方法
步骤一、罗伊氏乳酸杆菌菌株活化：
用MRS固体培养基对猪源罗伊氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri ATCC53608菌株进行活化培养，MRS固体培养基配方如下：蛋白胨1±0.1％g，牛肉膏1±0.1％g，酵母膏0.5±0.01％g，柠檬酸氢二铵0.2±0.01％g，葡萄糖2±0.1％g，结晶乙酸钠0.5±0.01％g，磷酸氢二钾0.2±0.01％g，七水硫酸镁0.06±0.01％g，一水硫酸锰0.025±0.01％g，吐温800.1±0.01％mL，琼脂2±0.1％g，pH 6.2-6.6；将Lactobacillus reuteri ATCC 53608划线接种于MRS固体培养基，于37℃厌氧培养48h。
步骤二、基于罗伊氏乳杆菌的纳米硒的生物合成及富集：
挑取步骤一中的罗伊氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri ATCC 53608的单菌落，用MRS液体培养基培养，MRS液体培养基配方如下：蛋白胨1±0.1％g，牛肉膏1±0.1％g，酵母膏0.5±0.01％g，柠檬酸氢二铵0.2±0.01％g，葡萄糖2±0.1％g，结晶乙酸钠0.5±0.01％g，磷酸氢二钾0.2±0.01％g，七水硫酸镁0.06±0.01％g，一水硫酸锰0.025±0.01％g，吐温800.1±0.01％mL，pH6.2-6.6；于37℃静置培养48h后放入冰箱作为种子液使用。以1％接种量，OD＝1，接种至新鲜MRS液体培养基，于37℃静置培养7h即增长期，随后加入1.2mM Na2SeO3，培养24h，将Na2SeO3转化为生物纳米硒。
步骤三、富集纳米硒的罗伊氏乳杆菌进一步合成并富集氧化锌
收集培养后的溶液，于高速冷冻离心机，6000±1000rpm，4℃离心10min，弃上清，收集沉淀；将沉淀用生理盐水洗涤三次，于高速冷冻离心机，6000±1000rpm，4℃离心10min，弃上清，收集沉淀；将沉淀放入4mM ZnSO4水溶液中，于37℃静置培养12h；重复上述操作，洗涤离心，加入保护剂(15±2％脱脂奶粉、10±2％海藻糖和5±2％甘油)，喷雾干燥，最终获得多功能复合微生态饲料添加剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteri ATCC 53608。
实施例2:微生态制剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteri ATCC 53608中纳米硒、Zn含量的测定
采用原子吸收光谱—火焰分光光度计法测定硒、锌含量。准确称取标准品溶液，以不含硒，不含锌的溶液为空白对照，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。准确称取一定量样品，加入混酸HClO4+HNO3(1：4)10mL，硝化过夜至样品清澈透明，转移至容量瓶中，定容至10ml。根据样品吸光度，从标准曲线中计算相应的硒、锌的含量。
实施例3：微生态制剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteri ATCC 53608的结构表征方法
透射电镜结果(TEM)：
取实施例1中的样品通透射电镜检测微生态制剂SeNPs-ZnO-Lactobacillusreuteri ATCC 53608表面的活性物质组成。
参照图2，本发明所生产的SeNPs平均粒径为300±2nm。
X射线光电子能谱结果(XPS)：
取实施例1中的样品通过X射线光电子能谱检测微生态制剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteri ATCC 53608表面的活性物质组成。
参照图3，本发明制备的微生态饲料添加剂SeNPs-ZnO-Lactobacillus reuteriATCC 53608表面包被有多糖及蛋白质等物质，硒、锌元素有两种形态为氧化态和0价态。
综合上述实施例可以看出，本发明将益生菌、锌与纳米硒三者有机结合，制备的一种富集锌和硒的多功能复合微生态饲料添加剂，其既具有乳酸菌的益生性，又可发挥锌和硒的生物学功能，并且直接以活菌制剂的形式进行饲喂，可以简化生产流程，降低生产成本，同时也降低了饲料中直接添加亚硒酸钠(Na2SeO3)、硫酸锌(ZnSO4)所带来的负面效应，本发明制备得到的饲用复合微生态制剂具有广阔的应用前景，并将产生显著的经济效益、社会效益和生态效益。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种饲用复合微生态制剂，由益生菌对底物发酵制备得到，所述底物包括硫酸锌和亚硒酸钠；所述益生菌包括：罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteriATCC 53608。
2.根据权利要求1所述的饲用复合微生态制剂，其特征在于，所述饲用复合微生态制剂中Se的含量为32.8～38.4mg/g；所述饲用复合微生态制剂中Zn的含量为7.22～10.02mg/g。
3.权利要求1或2所述的饲用复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述益生菌菌液和亚硒酸钠混合，进行第一发酵，得到第一发酵产物；
2)对所述第一发酵产物进行固液分离，收集固体组分，将所述固体组分和硫酸锌水溶液混合，进行第二发酵，得到含有饲用复合微生态制剂的第二发酵产物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一发酵的发酵体系中亚硒酸钠的初始浓度为1～1.5mM。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸锌水溶液中硫酸锌的浓度为3～5mM。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述益生菌处于对数生长期。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述第二发酵后，还包括将所述第二发酵的发酵产物和冻干保护剂混合，进行喷雾干燥。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括以下质量百分含量的组分：13％～17％脱脂奶粉、8％～12％海藻糖和3％～7％甘油。
9.一种饲料，包括权利要求1或2所述的饲用复合微生态制剂或者权利要求3～8任意一项所述制备方法制备得到的饲用复合微生态制剂。
10.根据权利要求9所述的饲料，其特征在于，所述饲料中饲用复合微生态制剂的添加量占饲料质量的1％～3％。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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