CN105595008A - 一种提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于饲料技术领域，具体涉及一种提高健雏率的蛋种鸡产蛋期配合饲料，并涉及该饲料的制备方法。所述配合饲料，主要由以下重量份数的原料制备：谷物50-65份，豆粕15-25份，玉米蛋白粉1-5份，米糠粕1-6份，苜蓿草粉2-6份，植物油1-3份，氨基酸0.35-0.7份，复合酶0.05-0.1份，益生素0.05-0.2份，25-羟胆钙化醇0.01-0.03份，β-胡萝卜素0.01-0.3份，复合有机微量元素0.03-0.08份，复合预混料1份。本发明充分有效的能量、氨基酸和矿物质营养及益生素，能够确保蛋种鸡产蛋最大潜力的需求，产蛋率高蛋重合适，达到蛋种鸡健雏率高。

Description

一种提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料及其制备方法

技术领域

本发明属于饲料技术领域，具体涉及一种提高健雏率的蛋种鸡产蛋期配合饲料，并涉及该饲料的制备方法。

背景技术

蛋种鸡健雏率是衡量蛋鸡种用价值高低和鸡场经济效益的重要指标，其影响因素很多，包括饲养管理、种蛋管理以及孵化管理等等都影响受精率、孵化率，进而影响健雏率的高低。对提高受精率的蛋种鸡营养和提高孵化率的蛋种鸡营养有诸多报道，前人在种鸡营养方面做了大量研究，确定了代谢能、氨基酸、维生素对蛋种鸡繁殖性能的影响。蛋受精率高，健雏率就高，其原因是种鸡的营养水平较高和饲养管理较好时，种蛋受精率高，精子活力强，胚胎的生存能力较强，故孵化出的雏鸡也健壮，健雏率就高；而种鸡的营养水平较低、营养不全面和饲养管理较差受精率低时，往往精子活力也较差，弱精蛋、死胚蛋多，胚胎的生存能力较弱，故孵化出的雏鸡健雏就少。再者，种鸡营养水平高、营养全面，种蛋中贮存的养分充足，有利于雏鸡的生长发育，所以雏鸡健壮，健雏率高。因此蛋种鸡健康状态和营养，对蛋重、产蛋率、种蛋合格率、受精率、孵化率和健雏率有重大影响。

相对于鸡饲料大量的研究，对种鸡饲料的研究并不多见，经检索，发现如下几个相关度较高的专利：

申请公布号CN102599378A的中国发明《一种肉种鸡产蛋期配合饲料及其制备方法》公开了一种肉种鸡产蛋期配合饲料及其制备方法，其主要是将组成原料玉米、小麦麸、大豆粕、玉米蛋白粉、石粉、磷酸二氢钙、豆油、赖氨酸、蛋氨酸、食盐、小苏打、胆碱、甜菜碱、多维素、和美酵素HT、硒蛋氨酸、蚊蝇净、植酸酶和预混料按一定重量百分比混合得到。本发明的肉种鸡产蛋期配合饲料不含任何色素，营养成分高，抗应激能力强，蛋鸡的成长快，鸡蛋的产量高，而且本发明制备方法简单，操作方便。该专利公开的肉种鸡产蛋期饲料是为了满足肉种鸡营养需求而做出的，而肉种鸡与本发明的蛋种鸡的生理特点、采食量、营养标准和产蛋性能、蛋品质要求均有很大的不同。

申请公布号CN104982377A的中国发明《一种高密度白壳蛋鸡养殖的技术方法》公开了一种高密度白壳蛋鸡养殖的技术方法，涉及家禽养殖技术领域，包括以下步骤:繁育场地的准备、孵化的管理、生产性能管理、疾病的防治。本发明的有益效果是:本发明充分的利用了生产资源，无培育污染，培育技术标准规范，投饲科学规范，很大程度的提高了白壳蛋鸡的质量，从而提高了白壳鸡蛋的品质产量。该专利仅公开了每天喂食全价商品蛋鸡饲料4-6次，但并未公开蛋鸡饲料的组成及制备方法。

申请公布号CN102524554A的中国发明《一种含有鸡油和二十八烷醇复合物的蛋种鸡饲料添加剂》提供一种提高蛋种鸡入孵率的饲料添加剂，即利用鸡油溶解二十八烷醇后与载体混合添加到蛋种鸡饲料中以提高入孵率的方法。一种提高蛋种鸡入孵率的饲料添加剂，其特征在于它以鸡油溶解二十八烷醇为活性成分；以薯干粉为载体；所说的二十八烷醇占总重量的30％-55％，油脂占总重量的5％-10％，薯干粉占总重量的40％-65％。利用鸡油溶解二十八烷醇后与载体混合添加到蛋种鸡饲料中，显著提高蛋种鸡产入孵率，大幅提高了收益，是一种具有良好饲养效果和经济效益的饲料添加剂。该发明仅从蛋种鸡的部分需求出发，营养组成不科学不均衡，不能满足蛋种鸡产蛋期的营养需求。该专利采用的薯干粉和油脂含量高，消化快，与其他营养不同步消化，影响氨基酸等其他活性成分的消化吸收，并且营养极其不平衡，严重影响种鸡的健康状态。

目前市场上的蛋种鸡料没有达到品种的要求，价格低，营养配比不平衡不科学。还有很多蛋种鸡企业自己生产饲料，混合均匀度和粉碎粒度达不到标准，存在生产不科学的现象。每年每只母鸡提供的健雏率低。

综上所述，根据蛋种鸡产蛋期的生理特点，研制出一种提高健雏率的蛋种鸡饲料势在必行。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提高现有蛋种鸡饲养过程中的受精率、孵化率和健雏率，根据蛋种鸡产蛋高峰期阶段特殊的生理特点，以蛋种鸡高峰前期和高峰期生理需要和营养需求为主要营养指标设计依据；以高效促进蛋种鸡生殖器官(输卵管、卵巢)发育和保养为主要目标，通过科学复配显著提高蛋鸡繁殖力、抗病力和机体健康状态，进而提高蛋种鸡的受精率和健雏率。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，由以下重量份数的原料制备：

谷物50-65份，豆粕15-25份，膨化大豆3-8份，玉米蛋白粉1-5份，米糠粕1-6份，苜蓿草粉2-6份，石粉8-9份，磷酸氢钙0.6-1.2份，植物油1-3份，氨基酸0.35-0.7份，复合酶0.05-0.1份，食盐0.2-0.4份，氯化胆碱0.05-0.12份，益生素0.05-0.2份，25-羟胆钙化醇0.01-0.03份，β-胡萝卜素0.01-0.3份，5000单位植酸酶0.01-0.04份，复合有机微量元素0.03-0.08份，维生素E0.01-0.04份，复合预混料1份。

所述谷物为玉米、小麦、高粱中的至少一种。

所述氨基酸为L-苏氨酸，赖氨酸，10％L-色氨酸，DL-蛋氨酸中的至少一种；

进一步地，所述复合有机微量元素为酵母硒、蛋氨酸锌、甘氨酸铁、蛋白锌、蛋白锰中的至少一种。

进一步地，所述复合酶酶谱组成及酶活含量如下：

进一步，所述复合预混料为辽宁禾丰牧业股份有限公司生产的种鸡产蛋期复合预混料，产品批号为《辽饲预字(2013)003074》，有效成分为复合微量元素，复合维生素。

所述益生素各组分的重量份数含量如下：地衣芽孢杆菌菌粉3-8、枯草芽孢杆菌菌粉1-3、嗜酸乳杆菌菌粉1-7、啤酒酵母菌菌粉2-8、植物乳杆菌菌粉1-3。

进一步地，复合酶中的角蛋白酶由以下方法制备：

1)种子培养：将地衣芽孢杆菌接入斜面培养基在好氧条件下于30-37℃培养25-30h,然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于30-37℃恒温汽浴摇床培养32-37h；再把培养好的菌种接入种子培养基于31-38℃培养9.5-13h；

2)发酵：将培养好的一级种子接入发酵培养基于32-38℃培养31-35h；

3)提取角蛋白酶：将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入玉米淀粉和壳粉，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥即得。采用该工艺制得的角蛋白酶收率高，品质好。

进一步地，所述葡萄糖氧化酶由以下方法制备：

1)挑取1环橘青霉孢子划线接种到改良PDA斜面培养基上，210rpm,在25℃培养3天，制备新鲜孢子菌悬液，按1×10⁷个孢子/100ml作为1级种子液，将1级种子液按10％接种量接种到发酵摇瓶中，210rpm,在25℃培养3天得到2级种子液，将2级种子液按5％的接种量接种到5吨发酵罐中发酵8天后，过滤得到不含菌体的滤液，即为葡萄糖氧化酶发酵液；

2)获得粗酶液：将葡萄糖氧化酶发酵液10000rpm高速离心20min,收集上清液，即为粗酶液；

3)浓缩：取50ml粗酶液于透析袋，PEG20000、4℃浓缩，当浓缩到至10ml时取出。

4)透析：将半透膜中的浓缩液放置于50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)中，透析至浓缩液的pH8.0为止，收集透析液。

5)DEAE-纤维素(DE-32)离子交换柱层析：柱床规格为1.5×20cm。先用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)平衡至流出液恒定在pH8.0，然后上样，上样流速控制在0.2ml/min。接着用3倍柱床体积的平衡缓冲液淋洗，除去不吸附的杂蛋白，再用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)，添加浓度从0-1mol/LNacl,总量200ml进行线性梯度洗脱。采用自动部分收集器收集，流速控制在1ml/min,每管3ml,检测洗脱液的蛋白质浓度和酶活力，绘制洗脱图谱，合并酶活力峰。

6)Sephacry1s-200柱层析：柱床规格为25×80cm。先用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)平衡至流出液恒定在pH8.0，然后上样，上样流速控制在0.2ml/min。用同样的缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，流速1ml/min，每管3ml。检测洗脱液的蛋白质浓度和酶活力，绘制洗脱图谱，合并酶活力峰。

与已报道的葡萄糖氧化酶相比，橘青霉所产的葡萄糖氧化酶的酶学特性及抗菌活性方面存在较大区别。

橘青霉所产的葡萄糖氧化酶对热、酸，胃蛋白酶、胰蛋白酶等稳定，在75℃水浴3分钟保持70％以上活性；在pH2.5-6.5范围内处理3h活性损失小于15％；经Mg2+、Zn2+、Ca2+处理后酶活保留率为90％以上；在胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶处理1h后活性存留率仍大于90％，葡萄糖氧化酶对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌具有很强的抗菌作用。

优选的，所述植物乳杆菌菌粉的制备方法如下：

将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到需要的体积；将扩培得到的菌液离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；干燥制备粉状菌剂，上述方法制得植物乳杆菌菌粉中活细胞数为(0.1～9.0)*10¹⁰个/克；

所述植物乳杆菌为保藏菌种CGMCCNo.11763；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖15-25份，(NH₄)₂SO₄4-6份，半胱氨酸2-3份。

本发明同时提供该提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料的制备方法：将各种原料按照蛋种鸡料常规粉碎和加工方法进行粉碎和充分混合均匀，使粒度达到1.0-2.5毫米之间50％以上。

有益效果

充分有效的能量、氨基酸和矿物质营养，确保蛋种鸡产蛋最大潜力的需求，产蛋率高蛋重合适；各种维生素和酶制剂营养充分满足饲料最大消化率和增强免疫力的效果；添加特定组分的益生素营养，特别是其中的保藏菌种植物乳杆菌CGMCCNo.11763，经实验发现能够在pH为1.50的条件下存活，在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；与其它菌种协同作用，能够调整蛋种鸡肠道菌群平衡，保证肠道最佳健康状态。有益的纤维素营养，有利于胃肠蠕动排出体内毒素，减少内毒素对机体的损害；以上措施的实施，能够使蛋种鸡机体健康状态达到最好，消化系统、免疫系统、繁殖器官、微循环系统等等达到最佳健康水平，有利于各种营养素的吸收与利用，从而达到受精率最高和健雏率最高。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

植物乳杆菌益生特性如下：

本发明所提供的植物乳杆菌CGMCCNo.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件下存活，在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCCNo.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCCNo.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76％。CGMCCNo.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％。

CGMCCNo.11763菌株对胆固醇降解能力研究和测定：

取1mlCGMCCNo.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基(胆固醇含量0.1mg/ml,pH6.2)中，37℃的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入1mL无菌水的MRS胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各1ml,9000r/min，4℃下离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为：取各上清液0.1ml于相应的试管中,加冰醋酸0.3ml,1mg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值)。每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率,结果见表1。可知，CGMCCNo.11763对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76％。

表1对胆固醇的降解情况

降解时间(h)	0	20h	40h	60h
					胆固醇含量(mg/ml)	0.2273±0.0058	0.1356±0.0018	0.1011±0.0094	0.801±0.0231
胆固醇降解率％		40.34％	55.52％	64.76％

CGMCCNo.11763菌株的耐胆盐试验：

取CGMCCNo.11763菌液1mL接种菌种于含有不同胆盐(含量梯度为0.0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％)的10mLMRS液体培养基(PH＝6.4)，置于37℃下分别培养0、2、4h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1％处理4h后菌的生长量依然达到0.59±0.92×10⁷(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。

表2耐胆盐能力检测[(±s)×10⁷cfu/ml]

CGMCCNo.11763菌株的耐酸试验

取CGMCCNo.11763母液按1ml接种菌种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的10mLMRS液体培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说明该菌具有很强的耐酸能力。

表3耐酸能力检测[(±s)×10⁷cfu/ml]

CGMCCNo.11763菌株的黏附能力测定

培养CGMCCNo.11763(MRS液体培养基)、大肠杆菌DH5α(LB液体培养基)24h得发酵液，分别置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)。自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌泥CGMCCNo.11763制成在波长600nm处的吸光值为0.4±0.1(A0)的悬浮菌液及菌悬液,静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。；他凝集率(％)：将CGMCCNo.11763和大肠杆菌DH5α的悬菌液调节成在波长600nm处的吸光值为0.6±0.1(A0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光值A24，他凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。测定结果见表5，可知CGMCCNo.11763的自凝集率为95.71％，有很强的黏附能力。

表4黏附能力表

类别	A0平均值±s	A24平均值±s	凝聚率％
				HLX37磷酸盐混合液	0.5131±0.0045	0.0220±0.0369	95.71
HLX37+大肠杆菌磷酸盐混合液	0.5143±0.0082	0.3698±0.0355	28.09

菌株生理特性

所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。

理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+)。经过生理生化鉴定为为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH。

该菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。

本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到，采集时间2015年6月2日。

5L发酵罐试验

(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCCNo.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。

(2)将对数期的菌种接入装有3LMRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌CGMCCNo.11763的乳酸产量达到110g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。

(4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCCNo.11763对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，XH对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/h/L。

(5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，XH菌对亚硝酸钠的分解速率为10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于4.8mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。

实施例1：

一种提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，由如下重量份数组成的原料制备：

玉米61份，豆粕19份，膨化大豆3.5份，玉米蛋白粉2份，米糠粕1份，苜蓿草粉2份，石粉8.5份，磷酸氢钙1.0份，植物油2份，L-苏氨酸0.15份，赖氨酸0.29份，10％L-色氨酸0.05份，DL-蛋氨酸0.16份；复合酶0.05份，食盐0.3份，氯化胆碱0.1份，益生素0.12份，25-羟胆钙化醇0.03份，β-胡萝卜素0.1份，5000单位植酸酶0.02份，复合有机微量元素0.06份，维生素E0.02份，复合预混料1份。

营养指标如下：粗蛋白17.5％，代谢能2780千卡/千克，可消化赖氨酸0.82％，可消化蛋氨酸0.74％，可消化苏氨酸0.7％，可消化色氨酸0.19％，钙3.9％，有效磷0.37％，盐0.39％，粗纤维5.6％，粗脂肪5.2％，dEB185；理想氨基酸比例(可消化蛋氨酸+可消化胱氨酸)/可消化赖氨酸为90％，可消化苏氨酸/可消化赖氨酸为85％，可消化色氨酸/可消化赖氨酸23％。

所述复合有机微量元素为酵母硒：蛋氨酸锌：甘氨酸铁＝1：1：4；

所述复合酶酶谱组成及酶活含量如下：

所述复合预混料为辽宁禾丰牧业股份有限公司生产的种鸡产蛋期复合预混料，产品批号为《辽饲预字(2013)003074》，有效成分为复合微量元素，复合维生素。

所述益生素各组分的重量份数含量如下：地衣芽孢杆菌菌粉6枯草芽孢杆菌菌粉2、嗜酸乳杆菌菌粉4、啤酒酵母菌菌粉5、植物乳杆菌菌粉2。

所述复合酶中的角蛋白酶由以下方法制备：

1)种子培养：将地衣芽孢杆菌接入斜面培养基在好氧条件下于34℃培养27h,然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于35℃恒温汽浴摇床培养32h；再把培养好的菌种接入种子培养基于35℃培养11h；

2)发酵：将培养好的一级种子接入发酵培养基于37℃培养33h；

3)提取角蛋白酶：将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入玉米淀粉和壳粉，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥即得。采用该工艺制得的角蛋白酶收率高，品质好。

所述葡萄糖氧化酶由以下方法制备：

1)挑取1环橘青霉孢子划线接种到改良PDA斜面培养基上，210rpm,在25℃培养3天，制备新鲜孢子菌悬液，按1×10⁷个孢子/100ml作为1级种子液，将1级种子液按10％接种量接种到发酵摇瓶中，210rpm,在25℃培养3天得到2级种子液，将2级种子液按5％的接种量接种到5吨发酵罐中发酵8天后，过滤得到不含菌体的滤液，即为葡萄糖氧化酶发酵液；

2)获得粗酶液：将葡萄糖氧化酶发酵液10000rpm高速离心20min,收集上清液，即为粗酶液；

3)浓缩：取50ml粗酶液于透析袋，PEG20000、4℃浓缩，当浓缩到至10ml时取出。

4)透析：将半透膜中的浓缩液放置于50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)中，透析至浓缩液的pH8.0为止，收集透析液。

5)DEAE-纤维素(DE-32)离子交换柱层析：柱床规格为1.5×20cm。先用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)平衡至流出液恒定在pH8.0，然后上样，上样流速控制在0.2ml/min。接着用3倍柱床体积的平衡缓冲液淋洗，除去不吸附的杂蛋白，再用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)，添加浓度从0-1mol/LNacl,总量200ml进行线性梯度洗脱。采用自动部分收集器收集，流速控制在1ml/min,每管3ml,检测洗脱液的蛋白质浓度和酶活力，绘制洗脱图谱，合并酶活力峰。

6)Sephacry1s-200柱层析：柱床规格为25×80cm。先用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)平衡至流出液恒定在pH8.0，然后上样，上样流速控制在0.2ml/min。用同样的缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，流速1ml/min，每管3ml。检测洗脱液的蛋白质浓度和酶活力，绘制洗脱图谱，合并酶活力峰。

与已报道的葡萄糖氧化酶相比，橘青霉所产的葡萄糖氧化酶的酶学特性及抗菌活性方面存在较大区别。

橘青霉所产的葡萄糖氧化酶对热、酸，胃蛋白酶、胰蛋白酶等稳定，在75℃水浴3分钟保持70％以上活性；在pH2.5-6.5范围内处理3h活性损失小于15％；经Mg2+、Zn2+、Ca2+处理后酶活保留率为90％以上；在胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶处理1h后活性存留率仍大于90％，葡萄糖氧化酶对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌具有很强的抗菌作用。

所述植物乳杆菌菌粉的制备方法如下：

将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到需要的体积；将扩培得到的菌液离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；干燥制备粉状菌剂，上述方法制得植物乳杆菌菌粉中活细胞数为(0.1～9.0)*10¹⁰个/克；

所述植物乳杆菌为保藏菌种CGMCCNo.11763；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖20份，(NH₄)₂SO₄5份，半胱氨酸3份。

提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料的制备方法：将各种原料按照蛋种鸡料常规粉碎和加工方法进行粉碎和充分混合均匀，使粒度2.0mm之间达到50％以上。

实施例2：

一种提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，由如下重量份数组成的原料制备：

玉米53份，小麦5份，高粱3份，豆粕20份，膨化大豆5份，玉米蛋白粉2份，米糠粕2份，苜蓿草粉2份，石粉8.5份，磷酸氢钙1.0份，植物油1份，L-苏氨酸0.15份，赖氨酸0.27份，10％L-色氨酸0.05份，DL-蛋氨酸0.16份；复合酶0.05份，食盐0.3份，氯化胆碱0.1份，益生素0.12份，25-羟胆钙化醇0.03份，β-胡萝卜素0.1份，5000单位植酸酶0.02份，维生素E0.01，复合有机微量元素0.06份，复合预混料1份。

所述复合有机微量元素由如下重量份数的原料组成：酵母硒：蛋氨酸锌：甘氨酸铁：蛋白锌：蛋白锰中＝1：2：0.5：1：0.5；

所述复合酶酶谱组成及酶活含量同实施例1；

所述复合预混料为辽宁禾丰牧业股份有限公司生产的种鸡产蛋期复合预混料，产品批号为《辽饲预字(2013)003074》，有效成分为复合微量元素，复合维生素。

营养指标如下：粗蛋白17.5％，代谢能2780千卡/千克，可消化赖氨酸0.82％，可消化蛋氨酸0.74％，可消化苏氨酸0.71％，可消化色氨酸0.193％，钙3.9％，有效磷0.37％，盐0.39％，粗纤维5.6％，粗脂肪5.2％，dEB185；理想氨基酸比例(可消化蛋氨酸+可消化胱氨酸)/可消化赖氨酸为90％，可消化苏氨酸/可消化赖氨酸为87％，可消化色氨酸/可消化赖氨酸23.5％。

所述益生素各组分的重量份数含量如下：地衣芽孢杆菌菌粉3、枯草芽孢杆菌菌粉1、嗜酸乳杆菌菌粉7、啤酒酵母菌菌粉8、植物乳杆菌菌粉3。

复合酶中的角蛋白酶由以下方法制备：

1)种子培养：将地衣芽孢杆菌接入斜面培养基在好氧条件下于30℃培养30h,然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于37℃恒温汽浴摇床培养32h；再把培养好的菌种接入种子培养基于31℃培养13h；

2)发酵：将培养好的一级种子接入发酵培养基于32℃培养35h；

3)提取角蛋白酶：将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入玉米淀粉和壳粉，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥即得。采用该工艺制得的角蛋白酶收率高，品质好。

葡萄糖氧化酶制备同实施例1。

所述植物乳杆菌菌粉的制备方法如下：

将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到需要的体积；将扩培得到的菌液离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；干燥制备粉状菌剂，上述方法制得植物乳杆菌菌粉中活细胞数为(0.1～9.0)*10¹⁰个/克；

所述植物乳杆菌为保藏菌种CGMCCNo.11763；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖25份，(NH₄)₂SO₄4份，半胱氨酸2份。

提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料的制备方法：将各种原料按照蛋种鸡料常规粉碎和加工方法进行粉碎和充分混合均匀，，使粒度1.0mm之间达到50％以上。

实施例3

一种提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，由以下重量份数的原料制备：

小麦65份，豆粕15份，膨化大豆8份，玉米蛋白粉5份，米糠粕6份，苜蓿草粉6份，石粉8份，磷酸氢钙0.6份，植物油3份，L-苏氨酸0.15份，赖氨酸0.1份，10％L-色氨酸0.05份，DL-蛋氨酸0.05份，复合酶0.05份，食盐0.4份，氯化胆碱0.12份，益生素0.2份，25-羟胆钙化醇0.03份，β-胡萝卜素0.3份，5000单位植酸酶0.04份，复合有机微量元素0.03份，维生素E0.01份，复合预混料1份。所述复合有机微量元素为重量份数比为：1：1：1：1：1：的酵母硒、蛋氨酸锌、甘氨酸铁、蛋白锌、蛋白锰。

复合酶酶谱组成及酶活含量同实施例1：

所述复合预混料为辽宁禾丰牧业股份有限公司生产的种鸡产蛋期复合预混料，产品批号为《辽饲预字(2013)003074》，有效成分为复合微量元素，复合维生素。

所述益生素各组分的重量份数含量如下：地衣芽孢杆菌菌粉8、枯草芽孢杆菌菌粉3、嗜酸乳杆菌菌粉7、啤酒酵母菌2菌粉、植物乳杆菌菌粉2。

所述复合酶中的角蛋白酶由以下方法制备：

1)种子培养：将地衣芽孢杆菌接入斜面培养基在好氧条件下于37℃培养25h,然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于37℃恒温汽浴摇床培养37h；再把培养好的菌种接入种子培养基于31℃培养9.5h；

2)发酵：将培养好的一级种子接入发酵培养基于32℃培养35h；

3)提取角蛋白酶：将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入玉米淀粉和壳粉，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥即得。

葡萄糖氧化酶为市售产品。

所述植物乳杆菌菌粉的制备方法如下：

将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到需要的体积；将扩培得到的菌液离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；干燥制备粉状菌剂，上述方法制得植物乳杆菌菌粉中活细胞数为(0.1～9.0)*10¹⁰个/克；

所述植物乳杆菌为保藏菌种CGMCCNo.11763；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖15份，(NH₄)₂SO₄6份，半胱氨酸3份。

提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料的制备方法：将各种原料按照蛋种鸡料常规粉碎和加工方法进行粉碎和充分混合均匀，使粒度2.5mm之间达到50％以上。

实施例4

一种提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，由以下重量份数的原料制备：

玉米25份、小麦20份、高粱5份，豆粕25份，膨化大豆3份，玉米蛋白粉1份，米糠粕6份，苜蓿草粉6份，石粉9份，磷酸氢钙1.2份，植物油1份，L-苏氨酸0.15份，赖氨酸0.25份，DL-蛋氨酸0.3份，复合酶0.1份，食盐0.2份，氯化胆碱0.05份，益生素0.2份，25-羟胆钙化醇0.01份，β-胡萝卜素0.3份，5000单位植酸酶0.04份，复合有机微量元素0.08份，维生素E0.04份，复合预混料1份。

所述复合有机微量元素为重量份数比为1：1的酵母硒和蛋氨酸锌。

复合酶酶谱组成及酶活含量同实施例1；

所述复合预混料为辽宁禾丰牧业股份有限公司生产的种鸡产蛋期复合预混料，产品批号为《辽饲预字(2013)003074》，有效成分为复合微量元素，复合维生素。

所述益生素各组分的重量份数含量如下：地衣芽孢杆菌菌粉3、枯草芽孢杆菌菌粉1、嗜酸乳杆菌菌粉7、啤酒酵母菌菌粉8、植物乳杆菌菌粉1。

所述复合酶中角蛋白酶制备方法同实施例1；

所述葡萄糖氧化酶的制备方法同实施例1；

所述植物乳杆菌菌粉为市售产品。

所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料的制备方法同实施例3。

试验例

采用实施例2制备的提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，做以下验证：

本发明在产蛋高峰阶段对蛋种鸡繁殖性能和生产性能的影响

1.试验时间：试验于2015年3月6日-2015年5月16日，共计70天，其中预试期7天，试验期63天。

2.试验地点：试验在桓仁新华鸡场实验场实施。

3.试验组设计：试验组分为对照组和本发明饲料组；其中对照组为市场料蛋种鸡高峰料，为市场销量较大的2个蛋种鸡饲料品牌。试验组为饲喂本发明实施例2制备的提高健雏率的蛋种鸡高峰期饲料。试验采用单因子实验设计，分5个批次，每批选择1440只海兰褐161日龄蛋种鸡，分为3组，每组设5个重复，每个重复96只鸡。

4.喂料方法：手动上料，每天2次，自由采食；自由饮水，水为地下水，水温15-21℃。

5.鸡舍温度：采用纵向通风，鸡舍温度控制在19-23℃。按照海兰褐种鸡饲养管理严格控制。

6.试验检测指标：1)开始体重和结束体重，采食量、成活率。2)产蛋枚数、蛋重、破蛋和软皮蛋；3)受精蛋数、出雏数、健雏率；4)屠宰试验：输卵管长度与重量，卵巢重量、大黄卵泡个数、小卵泡数量。

7.试验结果：将每批次试验指标检测结果统计，计算5批次平均数，统计结果如表1、2和3：

表1：对蛋鸡32周龄繁殖器官的影响

注：同行数据字母完全不同表示差异显著(P〈0.05)，字母相同表示差异不显著(P)0.05)，以下各表同。

从上表可见，与市场组1、2相比，本发明组对产蛋鸡32周龄时卵泡、输卵管和卵巢发育有显著的促进作用，输卵管长度分别长9.31cm和7.05cm，输卵管重量分别提高14.64g和10.39g，卵巢重量分别提高8.93g和9.53g，差异显著。大黄色卵泡的数量分别多3.9个和3.6个，小卵泡数量分别多5.2个和4.6个。由此可见，本发明组对蛋种鸡产蛋高峰期卵泡发育、输卵管发育和卵巢发育具有显著的促进作用。蛋鸡生殖系统包括卵巢和输卵管，卵巢包括基部和大量卵泡，卵泡发育和产蛋性能密切相关，大卵泡数量多时，连续产蛋能力强，产蛋率高。繁殖系统发育越强健，产蛋率越高，每只蛋种鸡提供的健雏率就越多。

表2：对蛋鸡产蛋性能的影响

由上表可见，与市场组1、2相比，本发明组产蛋率分别提高5.21％和5.33％。本发明组每只蛋种鸡提供的合格种蛋数比市场组多4.1枚和4.2枚。

表3：对蛋鸡受精率和健雏率的影响

使用本发明组饲料，60天内每只蛋种母鸡提供健雏率为43.33只，分别比对照组高出6.47只和7.04只。

需要说明的是，本发明实施例1、3-4制备的蛋种鸡料同样具有上述表1-3的饲喂效果，各实施例之间指标检测结果差异不显著，具有较好的繁殖性，健雏率高，免疫力高及抗病性强。

Claims (10)

1.一种提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，由以下重量份数的原料制备：

谷物50-65份，豆粕15-25份，膨化大豆3-8份，玉米蛋白粉1-5份，米糠粕1-6份，苜蓿草粉2-6份，石粉8-9份，磷酸氢钙0.6-1.2份，植物油1-3份，氨基酸0.35-0.7份，复合酶0.05-0.1份，食盐0.2-0.4份，氯化胆碱0.05-0.12份，益生素0.05-0.2份，25-羟胆钙化醇0.01-0.03份，β-胡萝卜素0.01-0.3份，5000单位植酸酶0.01-0.04份，复合有机微量元素0.03-0.08份，维生素E0.01-0.04份，复合预混料1份；

所述谷物为玉米、小麦、高粱中的至少一种；

所述氨基酸为L-苏氨酸，赖氨酸，10％L-色氨酸，DL-蛋氨酸中的至少一种；

所述复合有机微量元素为酵母硒、蛋氨酸锌、甘氨酸铁、蛋白锌、蛋白锰中的至少一种。

2.根据权利要求1所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，其特征在于，所述复合酶酶谱组成及酶活含量如下：木聚糖酶10000、甘露聚糖酶2000、纤维素酶1000、角蛋白酶8000、淀粉酶500、葡萄糖氧化酶300；

所述酶活含量单位为：U/g。

3.根据权利要求1所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，其特征在于，所述益生素各组分的重量份数含量如下：地衣芽孢杆菌菌粉3-8、枯草芽孢杆菌菌粉1-3、嗜酸乳杆菌菌粉1-7、啤酒酵母菌菌粉2-8、植物乳杆菌菌粉1-3。

4.根据权利要求2所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，其特征在于，所述角蛋白酶由以下方法制备：

1)种子培养：将地衣芽孢杆菌接入斜面培养基在好氧条件下于30-37℃培养25-30h,然后将培养好的斜面菌种接入种子培养基中，于30-37℃恒温汽浴摇床培养32-37h；再把培养好的菌种接入种子培养基于31-38℃培养9.5-13h；

2)发酵：将培养好的一级种子接入发酵培养基于32-38℃培养31-35h；

3)提取角蛋白酶：将培养好的发酵液转入回收罐并向其中加入玉米淀粉和壳粉，搅拌均匀，经固液分离、超滤膜超滤处理及喷雾干燥即得。

5.根据权利要求2所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶由以下方法制备：

1)挑取1环橘青霉孢子划线接种到改良PDA斜面培养基上，210rpm,在25℃培养3天，制备新鲜孢子菌悬液，按1×10⁷个孢子/100ml作为1级种子液，将1级种子液按10％接种量接种到发酵摇瓶中，210rpm,在25℃培养3天得到2级种子液，将2级种子液按5％的接种量接种到5吨发酵罐中发酵8天后，过滤得到不含菌体的滤液，即为葡萄糖氧化酶发酵液；

2)获得粗酶液：将葡萄糖氧化酶发酵液10000rpm高速离心20min,收集上清液，即为粗酶液；

3)浓缩：取50ml粗酶液于透析袋，PEG20000、4℃浓缩，当浓缩到至10ml时取出；

4)透析：将半透膜中的浓缩液放置于50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)中，透析至浓缩液的pH8.0为止，收集透析液；

5)DEAE-纤维素(DE-32)离子交换柱层析：柱床规格为1.5×20cm；先用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)平衡至流出液恒定在pH8.0，然后上样，上样流速控制在0.2ml/min；接着用3倍柱床体积的平衡缓冲液淋洗，除去不吸附的杂蛋白，再用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)，添加浓度从0-1mol/LNacl,总量200ml进行线性梯度洗脱；采用自动部分收集器收集，流速控制在1ml/min,每管3ml,检测洗脱液的蛋白质浓度和酶活力，绘制洗脱图谱，合并酶活力峰；

6)Sephacry1s-200柱层析：柱床规格为25×80cm；先用50mol/LTris盐酸缓冲液(pH8.0)平衡至流出液恒定在pH8.0，然后上样，上样流速控制在0.2ml/min；用同样的缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，流速1ml/min，每管3ml；检测洗脱液的蛋白质浓度和酶活力，绘制洗脱图谱，合并酶活力峰。

6.根据权利要求3所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，其特征在于，所述植物乳杆菌菌粉的制备方法如下：

将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到需要的体积；将扩培得到的菌液离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；干燥制备粉状菌剂；

所述植物乳杆菌为保藏菌种CGMCCNo.11763。

7.根据权利要求6所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，其特征在于，所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖15-25份，(NH₄)₂SO₄4-6份，半胱氨酸2-3份。

8.根据权利要求1所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，由如下重量份数组成的原料制备：

玉米61份，豆粕19份，膨化大豆3.5份，玉米蛋白粉2份，米糠粕1份，苜蓿草粉2份，石粉8.5份，磷酸氢钙1.0份，植物油2份，L-苏氨酸0.15份，赖氨酸0.29份，10％L-色氨酸0.05份，DL-蛋氨酸0.16份；复合酶0.05份，食盐0.3份，氯化胆碱0.1份，益生素0.12份，25-羟胆钙化醇0.03份，β-胡萝卜素0.1份，5000单位植酸酶0.02份，复合有机微量元素0.06份，维生素E0.02份，复合预混料1份；

所述复合有机微量元素为酵母硒：蛋氨酸锌：甘氨酸铁＝1：1：4。

9.根据权利要求1所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料，由如下重量份数组成的原料制备：

玉米53份，小麦5份，高粱3份，豆粕20份，膨化大豆5份，玉米蛋白粉2份，米糠粕2份，苜蓿草粉2份，石粉8.5份，磷酸氢钙1.0份，植物油1份，L-苏氨酸0.15份，赖氨酸0.27份，10％L-色氨酸0.05份，DL-蛋氨酸0.16份；复合酶0.05份，食盐0.3份，氯化胆碱0.1份，益生素0.12份，25-羟胆钙化醇0.03份，β-胡萝卜素0.1份，5000单位植酸酶0.02份，维生素E0.01，复合有机微量元素0.06份，复合预混料1份；

所述复合有机微量元素由如下重量份数的原料组成：酵母硒：蛋氨酸锌：甘氨酸铁：蛋白锌：蛋白锰中＝1：2：0.5：1：0.5。

10.权利要求1-9任一所述提高蛋种鸡健雏率的产蛋期配合饲料的制备方法，将各种原料按照蛋种鸡料常规粉碎和加工方法进行粉碎和充分混合均匀，使粒度1.0-2.5mm之间达到50％以上。