CN104164411A - 一种制备葡萄糖氧化酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种固态发酵制备胞外葡萄糖氧化酶的方法，采用橘青霉CICC40277固体发酵得到发酵液，然后经离心、超滤，二次沉淀，过滤，冻干，即得到葡萄糖氧化酶制品。本方法得到的葡萄糖氧化酶酶活高，收率高，本方法简单易操作，生产效率高，易于控制，为固态发酵生产葡萄糖氧化酶提供参考。

Description

一种制备葡萄糖氧化酶的方法
技术领域
本发明涉及一种利用橘青霉固体发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
葡萄糖氧化酶(β-D-葡萄糖；EC1.1.2.3.4)能催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸，利用分子氧作为过氧化氢的电子受体。葡萄糖氧化酶用途较广，它在食品、医药、饲料等行业中得到了广泛的应用。国内外葡萄糖氧化酶的生产多是利用黑曲霉液态发酵生产，但从黑曲霉中提取的葡萄糖氧化酶为胞内酶，需要进行破壁处理，造成了酶活力的损失、纯化过程复杂等缺点。为了克服上述问题，本发明采用橘青霉固体发酵制备胞外葡萄糖氧化酶，工艺简单、易操作、收率高。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用橘青霉(Penicillium citrinum Thom.)固态发酵制备葡萄糖氧化酶的方法，该方法可以快速分离得到大量高活力的胞外葡萄糖氧化酶，为葡萄糖氧化酶的工业化生产提供理论基础。
本发明技术方案和实施例中所用橘青霉CICC40277由申请人自中国工业菌种微生物保藏中心购买。本发明所提供的技术方案是：
一种制备葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：
(1)以橘青霉CICC40277为出发菌株，用无菌水洗脱，稀释得到橘青霉孢子悬液；
(2)挑取步骤(1)获得的橘青霉孢子悬液接种于斜面培养基，置于恒温箱中放大培养，培养条件为：28～32℃，2～5天；
(3)将步骤(2)培养得到菌种用无菌水进行洗脱，得到孢子悬浮液；
(4)挑取步骤(2)获得孢子悬浮液接种于固体发酵培养基，接种量为10％～20％(v/v)，将固体发酵培养基置于摇床中震荡培养，得到葡萄糖氧化酶发酵液；
(5)将发酵液先进行离心、超滤浓缩除盐，得到葡萄糖氧化酶粗酶液；
(6)将步骤(5)所得粗酶液经甲醇、丙酮相结合二次沉淀，过滤，滤饼冻干，即得到葡萄糖氧化酶制品。
作为优选，步骤(2)所述斜面培养基成分为：蔗糖30g/L，硝酸钠3g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，四水合硫酸亚铁0.01g/L，磷酸氢二钾1g/L，琼脂15g/L，余量为蒸馏水，PH6.5。
作为优选，步骤(4)所述固体发酵培养基成分为：甘蔗渣5～10g/L，酵母粉2～4g/L,硫酸镁0.3～1g/L，磷酸二氢钠2～4g/L,氯化钾0.2～0.5g/L，碳酸钙25～35g/L。
作为最佳优选，步骤(4)所述固体发酵培养基成分为：甘蔗渣5g/L，酵母粉2g/L,硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钠2g/L,氯化钾0.3g/L，碳酸钙30g/L。
作为最佳优选，步骤(4)所述固体发酵培养基成分为：甘蔗渣10g/L，酵母粉2g/L,硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钠2g/L,氯化钾0.2g/L，碳酸钙30g/L。
作为优选，步骤(4)摇床工作参数为温度在28～35℃，转速在180～220rpm。
作为最佳优选，步骤(4)摇床工作参数为温度在35℃，转速在200rpm。
作为最佳优选，步骤(4)摇床工作参数为温度在28℃，转速在200rpm。
作为优选，步骤(4)摇床震荡时间为2～5天。
作为最佳优选，步骤(4)摇床震荡时间为2天。
作为最佳优选，步骤(4)摇床震荡时间为3天。
作为最佳优选，步骤(5)离心的工作参数为8000rpm，20min。
本发明与现有技术相比，其进步和创新之处在于：
(1)本发明研究了固态发酵产胞外葡萄糖氧化酶的性质，为胞外葡萄糖氧化酶的生产提供参考。
(2)在提取葡萄糖氧化酶过程中对酶的提取、纯化工艺进行了改进，既提高了酶的比活力，又降低了提取过程中酶活的损失。
(3)本发明采用甘蔗渣作为发酵培养基的成分，既充分利用资源，变废为宝，又节省成本，符合农业可持续发展的要求。
具体实施方式
结合具体实施例，对本发明做进一步的阐述。下列两个实施例中所用橘青霉CICC40277由申请人自中国工业菌种微生物保藏中心购买。
实施例1
将橘青霉CICC40277菌株用无菌水洗脱，稀释成106个/mL的孢子悬液，挑取0.1mL的橘青霉孢子悬液接种于斜面培养基，将斜面培养基培养(28℃培养3天)得到的菌体经无菌水洗脱106个/mL孢子悬浮液接种于灭菌的固体发酵培养基(121℃灭菌,20mim)，接种量为10％(v/v)。将固体发酵培养基置于振荡摇床(工作参数：培养温度为35℃，转速为200rpm)中培养3天，即得到葡萄糖氧化酶发酵液。
葡萄糖氧化酶发酵液经离心(8000rpm，20min)、超滤管(超滤管的膜直径为30ku)超滤、浓缩除盐和除去小分子杂蛋白。超滤浓缩后得到酶活力83U/mL的葡萄糖氧化酶粗酶液。所得粗酶液用66％甲醇水溶液(m/m)沉淀葡萄糖氧化酶，然后用50％丙酮水溶液(m/m)二次沉淀，经压滤机过滤废液，滤饼冻干，得到葡萄糖氧化酶制品。
所述再生培养基成分为：添加有1.5g/L的2-脱氧-D-葡萄糖的麦芽汁琼脂。
所述斜面培养基成分为：蔗糖30g/L，硝酸钠3g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，四水合硫酸亚铁0.01g/L,磷酸氢二钾1g/L,琼脂15g/L,余量为蒸馏水,PH6.5。
所述固体发酵培养基成分为:甘蔗渣5g/L,酵母粉2g/L,硫酸镁0.5g/L,磷酸二氢钠2g/L,氯化钾0.3g/L,碳酸钙30g/L。
实施例2
将橘青霉CICC40277菌株用无菌水洗脱，稀释成106个/mL的孢子悬液，然后吸取0.1mL的橘青霉孢子悬浮落接种于斜面培养基，将斜面培养基培养(28℃培养3天)得到的菌体经无菌水洗脱106个/mL孢子悬浮液接种于灭菌的固体发酵培养基(121℃灭菌,20mim)，接种量为15％(v/v)。将固体发酵培养基置于摇床(工作参数：培养温度为35℃，转速为200rpm)中震荡培养2天，即得到葡萄糖氧化酶发酵液。
葡萄糖氧化酶发酵液经离心(8000rpm，20min)、超滤管超滤(超滤管的膜直径为30ku)、浓缩除盐，得到酶活力120U/mL的葡萄糖氧化酶粗酶液。所得粗酶液用66％甲醇水溶液(m/m)沉淀、50％丙酮水溶液(m/m)二次沉淀，经压滤机过滤废液，滤饼冻干，得到葡萄糖氧化酶制品。
所述固体发酵培养基成分为：甘蔗渣10g/L,酵母粉2g/L,硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钠2g/L,氯化钾0.2g/L,碳酸钙30g/L。
所述再生培养基和斜面培养基同实例1。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以橘青霉(Penicillium citrinum Thom.)为出发菌株，用无菌水进行洗脱，稀释得到橘青霉孢子悬液；
(2)挑取步骤(1)获得的橘青霉孢子悬液接种于斜面培养基，置于恒温箱中放大培养，培养条件为：28～32℃，2～5天；
(3)将步骤(2)培养得到菌种用无菌水进行洗脱，得到孢子悬浮液；
(4)挑取步骤(3)获得孢子悬浮液接种于固体发酵培养基，接种量为10％～20％(v/v)，将固体发酵培养基置于摇床中震荡培养，可得到葡萄糖氧化酶发酵液。
(5)将发酵液进行离心、超滤浓缩除盐，得到葡萄糖氧化酶粗酶液；
(6)将步骤(5)所得粗酶液经甲醇、丙酮相结合二次沉淀，过滤，滤饼冻干，即得到葡萄糖氧化酶制品。
2.根据权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述斜面培养基成分为：蔗糖30g/L，硝酸钠3g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，四水合硫酸亚铁0.01g/L，磷酸氢二钾1g/L，琼脂15g/L，余量为蒸馏水，PH6.5。
3.根据权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述固体发酵培养基成分为：甘蔗渣5～10g/L，酵母粉2～4g/L,硫酸镁0.3～1g/L，磷酸二氢钠2～4g/L,氯化钾0.2～0.5g/L，碳酸钙25～35g/L。
4.根据权利要求3所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述固体发酵培养基成分为：甘蔗渣5g/L，酵母粉2g/L,硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钠2g/L,氯化钾0.3g/L，碳酸钙30g/L。
5.根据权利要求3所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述固体发酵培养基成分为：甘蔗渣10g/L，酵母粉2g/L,硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钠2g/L,氯化钾0.2g/L，碳酸钙30g/L。
6.根据权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)摇床工作参数为温度在28～35℃，转速在180～220rpm。
7.根据权利要求7所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)摇床工作参数为温度在28℃，转速在200rpm。
8.根据权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)摇床震荡时间为2～5天。
9.根据权利要求8所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)摇床震荡时间为3天。
10.根据权利要求1所述的制备葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)离心的工作参数为8000rpm，20min。
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