CN104381618A - 饲用葡萄糖氧化酶的生产方法 - Google Patents

饲用葡萄糖氧化酶的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104381618A
CN104381618A CN201410736837.2A CN201410736837A CN104381618A CN 104381618 A CN104381618 A CN 104381618A CN 201410736837 A CN201410736837 A CN 201410736837A CN 104381618 A CN104381618 A CN 104381618A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seed
glucose oxidase
production method
penicillium notatum
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410736837.2A
Other languages
English (en)
Inventor
周慧
易翠平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changsha University of Science and Technology
Original Assignee
Changsha University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changsha University of Science and Technology filed Critical Changsha University of Science and Technology
Priority to CN201410736837.2A priority Critical patent/CN104381618A/zh
Publication of CN104381618A publication Critical patent/CN104381618A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，以解决现有普通固态发酵技术发酵条件难以控制的问题。该饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，是将活化的特异青霉经至少一次培养得到特异青霉种子，然后采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子，发酵结束后，将流化床固态发酵罐内的固体培养基、发酵产物、发酵菌种干燥并粉碎，得饲用葡萄糖氧化酶成品。本发明易于控制，不易污染杂菌，而且不产生“三废”，对环境无污染；发酵结束后，不需要对发酵产物——葡萄糖氧化酶进行提纯，即可直接将米渣和/或米糠、特异青霉菌种以及产物葡萄糖氧化酶一起干燥，制成饲用葡萄糖氧化酶。不仅工艺简单，而且可促进米渣和/或米糠进行生物循环利用。

Description

饲用葡萄糖氧化酶的生产方法
技术领域
本发明属饲料加工领域，具体来说，涉及一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内。但是动植物体中的葡萄糖氧化酶酶量不丰富，因此从动植物体中提取葡萄糖氧化酶具有一定的局限性。霉菌在一定的条件下，产生葡萄糖氧化酶的能力强，便于大规模生产葡萄糖氧化酶。大规模生产葡萄糖氧化酶的主要霉菌来源于黑曲霉和青霉菌。酶的生产方法可分为提取法、发酵法以及化学合成法。发酵法是20世纪50年代以来酶生产的主要方法。
现有饲用葡萄糖氧化酶的工业化生产方法一般采用液态深层发酵技术，但该方法对原料的要求高，主要以优质绵白糖为原料，生产过程中产生的废水、废渣、废气对环境污染较重。普通固态发酵虽然对原料要求粗放、得率高而且基本对环境无影响，但其设备自动化程度偏低、发酵过程难以控制而且容易染菌。专利号为201110138571.8的专利虽然应用了固态发酵技术，但属于简单固态发酵，需要大量劳动力，发酵条件难以控制，容易染菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，以解决现有普通固态发酵技术发酵条件难以控制的问题。
本发明目的通过以下技术方案实现：所述饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，是将活化的特异青霉经至少一次培养，得到特异青霉种子，然后采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子，发酵培养结束后，将流化床固态发酵罐内的固体培养基、发酵产物、发酵菌种干燥并粉碎，得饲用葡萄糖氧化酶成品。
采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子的方法是：以米渣和/或米糠为固体培养基，将所述米渣和/或米糠、水投入流化床固态发酵罐，灭菌并冷却，将所述特异青霉种子转接至所述米渣和/或米糠，拌匀，通入无菌空气，培养。在所述培养过程中可以向流化床固态发酵罐中补充糖。
流化床固态发酵罐中米渣和/或米糠占45～55％，其中米渣和米糠优选比例是2～4︰1，水占45～55％，特异青霉种子的接种量为1～5％。
所述流化床固态发酵法发酵特异青霉种子的发酵条件优选：在28～32℃条件下保压0.06～0.15MPa，培养18～24h时补加0.05～0.1％绵糖，继续培养12～24h；固态发酵结束后，50～60℃干燥并粉碎，即为饲用葡萄糖氧化酶成品。
所述活化的特异青霉优选经一级种子培养、二级种子培养、种子培养，得到特异青霉种子。
一级种子培养是将活化的特异青霉转接至一级液体种子培养基培养，得到一级种子，所述一级液体种子培养基包括1～2％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。
二级种子培养是将一级种子转接至二级液体种子培养基培养，得到二级种子，所述二级液体种子培养基包括1.5～3％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。
种子培养是将二级种子转接至种子培养基培养，得到特异青霉种子，所述种子培养基包括2～4％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。
本发明的优点：与普通固态发酵技术相比，本发明采用的是流化床固态发酵法，发酵条件易于控制，不易污染杂菌，而且不产生“三废”，对环境无污染。采用可以作为饲用的米渣和/或米糠作为特异青霉种子的固体培养基，发酵结束后，不需要对发酵产物——葡萄糖氧化酶进行提纯，即可直接将米渣和/或米糠、特异青霉菌种以及产物葡萄糖氧化酶一起干燥，制成饲用葡萄糖氧化酶。不仅工艺简单，而且可促进米渣和/或米糠进行生物循环利用。与用普通固态发酵技术生产饲用葡萄糖氧化酶相比，本发明生产的葡萄糖氧化酶活力高。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明使用的特异青霉通过商业购买方式获得。
本发明的饲用葡萄糖氧化酶成品的酶活力检测方法如下：
第一步，饲用葡萄糖氧化酶成品中加入蒸馏水稀释，使葡萄糖氧化酶的酶液浓度在2.4～3.5U/mL，记录稀释倍数f然后摇匀，于4～8℃冰箱中浸提15～16小时，过滤，该滤液作为测定液；
第二步，取2％葡萄糖磷酸缓冲液25.00mL，于恒温摇床上30℃、150rpm预热3分钟，准确加入上述测定液1.00mL，立即置恒温摇床上，30℃、150rpm振荡反应60分钟，取出；
第三步，立即加入0.1mol/L氢氧化钠溶液20.00ml，振摇终止反应；加酚酞指示剂1滴，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的氢氧化钠，记录所消耗的盐酸毫升数A。
第四步，取2％葡萄糖磷酸缓冲液25.00mL，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液20.00mL，摇匀，再加入酶液1.00mL，酚酞指示剂1滴，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的氢氧化钠，记录所消耗的盐酸毫升数B。
第五步，计算：
葡萄糖氧化酶活力单位(GOD U/g)＝60(B-A)×N×f×1000
式中：
A――反应后消耗的盐酸(mL)；
B――反应前消耗的盐酸(mL)；
N――盐酸摩尔浓度(mol/L)；
f――稀释倍数；
60――为反应60分钟，按分钟计。
1个单位的葡萄糖氧化酶的活性(1U)定义为：在pH 5.6的磷酸缓冲液、30℃温度的条件下，每分钟催化氧化1μmol葡萄糖转化为葡萄糖酸的酶的量，为一个酶活力单位，以GODU表示。
实施例1
饲用葡萄糖氧化酶的生产方法如下：
第一步，菌种活化：将高产葡萄糖氧化酶的特异青霉的斜面取出，划线接种于直径为10cm的PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，下同)固体培养平皿，28℃条件下培养72h，再涂布接种于直径为20cm的PDA固体培养平皿，28℃条件下培养48h，得活化的特异青霉。
马铃薯琼脂培养基的配制：去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮汁30min，纱布过滤，滤液中添加琼脂15g，继续加热搅拌混匀至琼脂溶解，再加入20g葡萄糖，补蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min，铺平皿备用；
第二步，一级种子培养：一级液体种子培养基经115℃灭菌20min后，将活化的特异青霉转接一级种子培养基，接种量为一个20cm培养皿接种5L液体种子培养基，接种后于32℃培养72h，得到一级种子液。
所述一级液体种子培养基配制方法：2％米渣，0.2％NaCl，0.2％CaCl2，0.2％KH2PO4，0.06％MgSO4·7H2O，其余为水；
第三步，流化床固态发酵：将45％米渣和55％水投入流化床固态发酵罐，混合均匀，115℃灭菌20min，冷却后接入一级种子液并混合均匀，接种量为5％，即2000L种子培养基接种40T固态发酵培养基，通入无菌空气，28条件下保压0.06MPa，培养18h时补加0.05％绵糖，继续培养24h，50℃干燥5h至水分含量≤12％、粉碎至细度≥85％，即为饲用葡萄糖氧化酶成品。经检测，本实施例产品的酶活力为30GOD U/g。
实施例2
饲用葡萄糖氧化酶的生产方法如下：
第一步，菌种活化：将保存的高产葡萄糖氧化酶的特异青霉的斜面取出，划线接种于PDA固体培养平皿，32℃条件下培养96h后再涂布接种于直径为20cm的PDA固体培养平皿，32℃条件下培养96h。
所述马铃薯琼脂培养基配制：去皮马铃薯200g切成小块，加水煮汁30min，8层纱布过滤，滤液中添加琼脂15g，继续加热搅拌混匀至琼脂溶解，再加入20g葡萄糖，补蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min，铺平皿备用；
第二步，一级种子培养：一级液体种子培养基经115℃灭菌20min后，将活化的特异青霉转接一级种子培养基，接种量为一个20cm培养皿接种5L液体种子培养基；接种后于32℃培养72h，得到一级种子液。
所述一级液体种子培养基配制：1％米渣，0.05％NaCl，0.05％CaCl2，0.05％KH2PO4，0.01％MgSO4·7H2O，0.001％FeCl3，其余为水；
第三步，二级种子培养：二级液体种子培养基经115℃灭菌20min后，接种一级种子液，接种量为10％，即5L一级种子液接种50L二级种子培养基；接种后于32℃培养72h，得到二级种子液；
所述二级液体种子培养基配制：3％米渣，0.2％NaCl，0.2％CaCl2，0.2％KH2PO4，0.6％MgSO4·7H2O，其余为水；
第四步，种子培养：种子培养基经115℃灭菌20min后，接种二级种子液，接种量为10％，即50L一级种子液接种500L种子培养基，32℃培养72h，得到种子液。
所述种子培养基配制：4％米渣，0.2％NaCl，0.2％CaCl2，0.2％KH2PO4，0.06％MgSO4·7H2O，其余为水；
第五步，流化床固态发酵：将44％米渣、11％米糠和45％水投入流化床固态发酵罐，混合均匀，115℃灭菌20min，冷却后接入种子液并混合均匀，接种量为1％，即500L种子培养基接种50T固态发酵培养基，通入无菌空气，32℃保压0.15MPa，培养24h时补加0.1％绵糖(配成少量水溶液以喷雾形式添加)，继续培养12h；固态发酵结束后，60℃干燥2h至水分含量≤12％、粉碎至细度≥85％，即为饲用葡萄糖氧化酶成品。经检测，本实施例产品的酶活力为33GOD U/g。
实施例3
第一步，菌种活化：将保存的高产葡萄糖氧化酶的特异青霉的斜面取出，划线接种于直径为10cm的PDA固体培养平皿，30℃条件下培养72h，再涂布接种于直径为20cm的PDA固体培养平皿，30℃条件下培养72h。
所述马铃薯琼脂培养基配制：去皮马铃薯200g切成小块，加水煮汁30min，8层纱布过滤，滤液中添加琼脂15g，继续加热搅拌混匀至琼脂溶解，再加入20g葡萄糖，补蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min，铺平皿备用；
第二步，一级种子培养：一级液体种子培养基经115℃灭菌20min后，将活化的特异青霉转接一级种子培养基，接种量为一个20cm培养皿接种5L液体种子培养基；接种后于30℃培养60h；
所述一级液体种子培养基配制：1.5％米渣，0.05％NaCl，0.05％CaCl2，0.05％KH2PO4，0.03％MgSO4·7H2O，0.025％FeCl3，其余为水；
第三步，二级种子培养：二级液体种子培养基经115℃灭菌20min后，接种一级种子液，接种量为8.3％(即：5L一级种子液接种60L二级种子培养基)；接种后于30℃培养60h；
所述二级液体种子培养基配制：1.5％米渣，0.05％NaCl，0.05％CaCl2，0.05％KH2PO4，0.01％MgSO4·7H2O，0.020％FeCl3，其余为水；
第四步，种子培养：种子培养基经115℃灭菌20min后，接种二级种子液，接种量为8％(即：60L二级种子液接种750L种子培养基)，30℃培养60h；
所述种子培养基配制：2％米渣，0.05％NaCl，0.05％CaCl2，0.05％KH2PO4，0.01％MgSO4·7H2O，0.015％FeCl3，其余为水；
第五步，流化床固态发酵：将35％米渣、15％米糠和50％水投入流化床固态发酵罐，混合均匀，115℃灭菌20min，冷却后接入种子液并混合均匀，接种量为2.5％，即750L种子培养基接种30T固态发酵培养基，通入无菌空气，30℃保压0.10MPa，培养24h时补加0.07％绵糖(配成少量水溶液以喷雾形式添加)，继续培养18h；固态发酵结束后，65℃干燥3h至水分含量≤12％、粉碎至细度≥85％，即为饲用葡萄糖氧化酶成品。经检测，本实施例产品的酶活力为35GOD U/g。

Claims (9)

1.一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，将活化的特异青霉经至少一次培养，得到特异青霉种子，其特征是：采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子，发酵培养结束后，将流化床固态发酵罐内的固体培养基、发酵产物、特异青霉种子干燥并粉碎，得饲用葡萄糖氧化酶成品。
2.如权利要求1所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述采用流化床固态发酵法发酵特异青霉种子的方法是：以米渣和/或米糠为所述固体培养基，将所述米渣和/或米糠、水投入所述流化床固态发酵罐，灭菌并冷却，将所述特异青霉种子转接至所述米渣和/或米糠，拌匀，通入无菌空气，发酵培养。
3.如权利要求2所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述米渣和/或米糠占45～55％，水占45～55％，所述特异青霉种子的接种量为1～5％。
4.如权利要求2所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：在所述发酵培养过程中向流化床固态发酵罐中补充糖。
5.如权利要求4所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述发酵培养是在28～32℃条件下保压0.06～0.15MPa，培养18～24h时补加所述米渣和/或米糠总质量的0.05～0.1％的绵糖，继续培养12～24h，然后于50～60℃干燥并粉碎，即为饲用葡萄糖氧化酶成品。
6.如权利要求1～5之一所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述活化的特异青霉经一级种子培养、二级种子培养、种子培养，得到特异青霉种子。
7.如权利要求6所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述一级种子培养是将活化的特异青霉转接至一级液体种子培养基培养，得到一级种子，所述一级液体种子培养基包括1～2％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。
8.如权利要求6所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述二级种子培养是将一级种子转接至二级液体种子培养基培养，得到二级种子，所述二级液体种子培养基包括1.5～3％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。
9.如权利要求6所述的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征是：所述种子培养是将二级种子转接至种子培养基培养，得到特异青霉种子，所述种子培养基包括2～4％米渣、0.05～0.2％NaCl、0.05～0.2％CaCl2、0.05～0.2％KH2PO4、0.01～0.06％MgSO4·7H2O。
CN201410736837.2A 2014-12-05 2014-12-05 饲用葡萄糖氧化酶的生产方法 Pending CN104381618A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410736837.2A CN104381618A (zh) 2014-12-05 2014-12-05 饲用葡萄糖氧化酶的生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410736837.2A CN104381618A (zh) 2014-12-05 2014-12-05 饲用葡萄糖氧化酶的生产方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104381618A true CN104381618A (zh) 2015-03-04

Family

ID=52599668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410736837.2A Pending CN104381618A (zh) 2014-12-05 2014-12-05 饲用葡萄糖氧化酶的生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104381618A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104855725A (zh) * 2015-05-29 2015-08-26 北京好友巡天生物技术有限责任公司 用于反刍动物颗粒混合饲料的谷草发酵工艺及反刍动物颗粒混合饲料

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220295A (zh) * 2011-05-26 2011-10-19 长沙理工大学 以稻谷加工副产物为原料生产饲用葡萄糖氧化酶的方法
CN103966179A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 河北省微生物研究所 葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用
CN104164411A (zh) * 2014-09-05 2014-11-26 广西大学 一种制备葡萄糖氧化酶的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220295A (zh) * 2011-05-26 2011-10-19 长沙理工大学 以稻谷加工副产物为原料生产饲用葡萄糖氧化酶的方法
CN103966179A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 河北省微生物研究所 葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用
CN104164411A (zh) * 2014-09-05 2014-11-26 广西大学 一种制备葡萄糖氧化酶的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张元兴等: "《生物反应器工程》", 31 January 2001, 华东理工大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104855725A (zh) * 2015-05-29 2015-08-26 北京好友巡天生物技术有限责任公司 用于反刍动物颗粒混合饲料的谷草发酵工艺及反刍动物颗粒混合饲料

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103416216B (zh) 玉米秸作基料栽培杏鲍菇液体菌种的配方及其制备方法
CN106834368A (zh) 一种利用木质纤维素发酵生产l‑乳酸的方法
CN104593315A (zh) 一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法
CN103667117A (zh) 一种用于好氧发酵阶段的复合微生物菌
CN101696394A (zh) 一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法及发酵产品
CN101260392A (zh) 一种用五倍子生料固体发酵生产单宁酶的方法
CN101705217B (zh) 一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法
CN102851330A (zh) 一种发酵制备柠檬酸的方法
CN104357428A (zh) 一种木聚糖酶的液态深层发酵方法
CN106755179B (zh) 一种适于细菌纤维素发酵的培养基
CN104762360A (zh) 新特性腈水合酶诱导的高含量烟酰胺合成
CN104357335A (zh) 一株新型黑曲霉和其生产糖化酶的方法
CN104381618A (zh) 饲用葡萄糖氧化酶的生产方法
CN101649310B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶的制备方法
CN103343151B (zh) 一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法
CN102994400B (zh) 降解脐橙囊衣微生物、含有其的酶制剂及应用
CN103173422A (zh) 以硬毛粗毛盖孔菌产漆酶的固体发酵培养基及其应用
CN102533891A (zh) 一种赖氨酸的生产方法
CN105602995B (zh) 一种液体深层快速发酵制备浒苔生物肥的方法
CN102653477B (zh) 一种酒糟型生物有机肥的制备方法
CN102766656A (zh) 一种利用甘蔗渣廉价制备微生物絮凝剂的方法
CN104072241B (zh) 一种草本水果专用有机叶面肥的制备方法
CN102250857A (zh) 一种提高纤维素酶单位活性的液体发酵工艺
CN107058449A (zh) 一种餐厨垃圾解淀粉芽孢杆菌与鼠李糖乳杆菌混合发酵产乳酸的方法
CN105969811B (zh) 利用植物乳杆菌发酵没食子酸制备焦性没食子酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150304