CN104860756A - 一种蛹虫草发酵液体培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛹虫草发酵液体培养基，它包括葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温和水的基础培养基，它还包括腺嘌呤和甘油酯。本发明还公开了上述蛹虫草发酵液体培养基的制备方法与应用。本发明提供的培养基是将传统液体培养基，加入腺嘌呤和脂肪酸甘油酯后，在温度22-27℃、转速150-180r/min条件下培养21-28d，发酵蛹虫草，结果发现发酵液中虫草素的含量增加了50％-87.5％，本发明方法具有很高的实际应用价值。

Description

一种蛹虫草发酵液体培养基及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高蛹虫草发酵液中虫草素含量的液体培养基及其制备方法与应用。
背景技术
虫草素是虫草中主要的活性成分之一。虫草素具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗转移、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗炎等。虫草素的制备主要有化学合成和生物合成两种方式。由于目前化学合成虫草素生产成本高，合成工艺复杂，收率低，产物纯化比较难，所以虫草素主要由生物合成法制备。生物合成法制备虫草素有两种途径：一是固体发酵获得虫草子实体，再从中提取；二是通过虫草液体发酵，从发酵液中直接提取。由于液体发酵比固体发酵在发酵规模、菌体生长速率、生长密度以及可控性上的优势，虫草液体发酵提取虫草素成为主要的虫草素制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高蛹虫草发酵液中虫草素含量的液体培养基。
本发明还要解决的技术问题是提供上述液体培养基的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述液体培养基的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种蛹虫草发酵液体培养基，它包括葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温和水的基础培养基，它还包括腺嘌呤和甘油酯。
其中，腺嘌呤浓度为4.05～6.76g/L，优选5g/L，腺嘌呤浓度的计算基准为基础培养基的体积。
其中，所述的甘油酯为花生油、玉米油、大豆油、亚麻油、芝麻油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油、红花籽油、橄榄油和三油酸甘油酯中的任意一种或几种的混合物；优选甘油酯为不饱和脂肪酸含量最高的甘油酯；最优选亚麻油。
其中，甘油酯加入量为高出基础培养基液面2～3mm，优选2.2mm。
其中，所述的基础培养基配方优选为：葡萄糖40～50g/L，酵母膏3～10g/L，蛋白胨5～15g/L，磷酸二氢钾0.2～1.0g/L，磷酸氢二钾0.2～1.0g/L，硫酸镁0.2～1.0g/L，吐温800.5～5.0g/L，溶剂为水，pH5.5～6.0。
所述的基础培养基配方最优选为：葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802g/L，溶剂为水，pH5.8。
上述蛹虫草发酵液体培养基的制备方法，它包括如下步骤：
1)配制基础培养基；
2)将步骤1)中的基础培养基倒入发酵容器内，加入腺嘌呤，再加入甘油酯，经高压蒸汽灭菌，即得。
其中，腺嘌呤浓度为4.05～6.76g/L；甘油酯加入量为高出基础培养基液面2～3mm。
上述蛹虫草发酵液体培养基在发酵生产虫草素中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，在上述蛹虫草发酵液体培养基中接种蛹虫草，对于每1L培养基中接种浓度为5.0×106-8.0×106个/ml(优选7.0×106个/ml)的蛹虫草孢子悬液50ml，置于摇床中进行培养，培养温度为22～27℃(优选25℃)，摇床转速为150～180r/min(优选160r/min)，培养时间为21～28d(优选25d)。
所述的蛹虫草为具备发酵生产虫草素能力的蛹虫草，例如可以是中国工业微生物菌种保藏管理中心的蛹虫草(编号为CICC 14014)。
通过文献调研和研究发现虫草素的直接前体是腺嘌呤，而虫草素的另一个结构单元是3’-脱氧核糖。在蛹虫草发酵中，我们发现在发酵培养基中加入腺嘌呤能大大提高虫草素产量。而且，我们还发现加入植物油后蛹虫草发酵液中的虫草素含量又有进一步升高。
蛹虫草传统培养方法是应用葡萄糖、蛋白胨和酵母膏为主要成分的发酵培养基。这些成分只能满足蛹虫草基本的生长和发育需要，虫草素产量较低。而加入腺嘌呤后提供了一定的虫草素前体，使得虫草素产量有所提高。但是3’-脱氧核糖单元是通过脂肪酸代谢途径，经乙酰CoA，再经过次级代谢途径合成的，这与先前理解的3’-脱氧核糖是通过磷酸戊糖途径合成的有差别。因此，在缺乏乙酰CoA供给的条件下，虫草素含量很难再提高。而植物油等甘油酯在蛹虫草中通过脂肪酸代谢能够分解为大量的乙酰CoA，进而能够进一步提高虫草素的产量。
有益效果：本发明提供的蛹虫草液体培养基和发酵方法能够极大地提高蛹虫草发酵液中虫草素的产量，利用本发明方法培养蛹虫草发酵液中的虫草素含量比用传统法方法培养的虫草素含量增加50％-87.5％。
附图说明
图1为不同培养基对虫草素含量的影响图，其中横坐标1为实施例4，2为实施例5，3为实施例6，4为对比例1，5为对比例2，6为对比例3，纵坐标代表培养基摇瓶培养结束后测得的发酵液中虫草素含量。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：蛹虫草发酵培养基制备。
1)按照如下配方：葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵基础培养基水相。
2)将步骤1)中的发酵基础培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，加入0.25g腺嘌呤，再加入2.2mm液面高度的花生油、玉米油、大豆油、亚麻油、芝麻油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油、红花籽油、橄榄油等量混合的甘油酯，经高压蒸汽灭菌，得到高产虫草素蛹虫草培养基。
实施例2：蛹虫草发酵培养基制备。
1)按照如下配方：葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温805.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值6.0，制得发酵基础培养基水相。
2)将步骤1)中的发酵基础培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，加入0.2025g腺嘌呤，再加入3.0mm液面高度的三油酸甘油酯，经高压蒸汽灭菌，得到高产虫草素蛹虫草培养基。
实施例3：蛹虫草发酵培养基制备。
1)按照如下配方：葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温800.5g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.5，制得发酵基础培养基水相。
2)将步骤1)中的发酵基础培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，加入0.3380g腺嘌呤，再加入2.0mm液面高度的亚麻油，经高压蒸汽灭菌，得到高产虫草素蛹虫草培养基。
实施例4：蛹虫草发酵培养基在提高蛹虫草发酵液中虫草素含量上的应用。
1、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。再加入5ml 0.9％的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为7.0×106个/ml。
2、蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
将2.5ml孢子悬液接种至实施例1制得的培养基中，在温度25℃，160r/min条件下振荡培养25d。
实施例5：蛹虫草发酵培养基在提高蛹虫草发酵液中虫草素含量上的应用。
1、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。再加入5ml 0.9％的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为6.0×106个/ml。
2、蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
将2.5ml孢子悬液接种至实施例2制得的培养基中，在温度22℃，150r/min条件下振荡培养21d。
实施例6：蛹虫草发酵培养基在提高蛹虫草发酵液中虫草素含量上的应用。
1、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。再加入5ml 0.9％的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为8.0×106个/ml。
2、蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
将2.5ml孢子悬液接种至实施例3制得的培养基中，在温度27℃，180r/min条件下振荡培养28d。
对比例1：
1)按照如下配方：葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养基水相。
2)将步骤1)中的发酵培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，加入0.25g腺嘌呤，经高压蒸汽灭菌，得到蛹虫草培养基。
3)从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。再加入5ml 0.9％的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为7.0×106个/ml。
4)蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
将2.5ml孢子悬液接种至实施例1制得的培养基中，在温度25℃，160r/min条件下振荡培养25d。
对比例2：
1)按照如下配方：葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵基础培养基水相。
2)将步骤1)中的发酵基础培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，加入2.2mm液面高度的花生油、玉米油、大豆油、亚麻油、芝麻油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油、红花籽油、橄榄油等量混合的甘油酯，经高压蒸汽灭菌，得到蛹虫草培养基。
3)从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。再加入5ml 0.9％的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为7.0×106个/ml。
4)蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
将2.5ml孢子悬液接种至实施例1制得的培养基中，在温度25℃，160r/min条件下振荡培养25d。
对比例3：
1)按照如下配方：葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵基础培养基水相。
2)将步骤1)中的发酵基础培养基水相分装到250ml三角瓶内，每瓶50ml，经高压蒸汽灭菌，得到蛹虫草培养基。
3)从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。再加入5ml 0.9％的生理盐水，振荡后收集孢子悬液，稀释调整浓度为7.0×106个/ml。
4)蛹虫草菌种摇瓶发酵培养
将2.5ml孢子悬液接种至实施例1制得的培养基中，在温度25℃，160r/min条件下振荡培养25d。
发酵液虫草素含量测定
实施例4-6和对比例1-3的发酵液中虫草素的含量通过高效液相色谱法测定。发酵液离心取上清液用纯水稀释6倍，振荡混匀，检测虫草素。色谱条件：色谱柱：UltimateAQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇：磷酸盐溶液(10mmol/L KH2PO4溶液)＝15：85，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μL，检测波长为260nm。
结果：实施例4制得的培养基分别比对比例1-3的虫草素含量增加约为50.0％、66.7％和87.5％。

Claims (10)

1.一种蛹虫草发酵液体培养基，它包括葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温和水的基础培养基，其特征在于，它还包括腺嘌呤和甘油酯。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，腺嘌呤浓度为4.05～6.76g/L。
3.根据权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，所述的甘油酯为花生油、玉米油、大豆油、亚麻油、芝麻油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油、红花籽油、橄榄油和三油酸甘油酯中的任意一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1或3所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，甘油酯加入量为高出基础培养基液面2～3mm。
5.根据权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，所述的基础培养基配方为：葡萄糖40～50g/L，酵母膏3～10g/L，蛋白胨5～15g/L，磷酸二氢钾0.2～1.0g/L，磷酸氢二钾0.2～1.0g/L，硫酸镁0.2～1.0g/L，吐温800.5～5.0g/L，溶剂为水，pH5.5～6.0。
6.根据权利要求5所述的蛹虫草发酵液体培养基，其特征在于，所述的基础培养基配方为：葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802g/L，溶剂为水，pH5.8。
7.权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)配制基础培养基；
2)将步骤1)中的基础培养基倒入发酵容器内，加入腺嘌呤，再加入甘油酯，经高压蒸汽灭菌，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，腺嘌呤浓度为4.05～6.76g/L；甘油酯加入量为高出基础培养基液面2～3mm。
9.权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基在发酵生产虫草素中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在权利要求1所述的蛹虫草发酵液体培养基中接种蛹虫草，对于每1L培养基中接种浓度为5.0×106-8.0×106个/ml的蛹虫草孢子悬液50ml，置于摇床中进行培养，培养温度为22～27℃，摇床转速为150～180r/min，培养时间为21～28d。
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