CN102782145B - 制备含有月桂酸的油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用藻类来供应月桂酸的方法。一种制备含有月桂酸的油脂的方法，通过在培养基中培养属于共生甲藻属的藻类并从培养物中回收，其中月桂酸的含量为脂肪酸组成的3重量%以上。

Description

制备含有月桂酸的油脂的方法
技术领域
本发明涉及一种制备含有月桂酸作为构成脂肪酸的油脂（以下也可以简称为“含有月桂酸的油脂”）的方法，该方法采用藻类。
背景技术
月桂酸是一种大量存在于椰子油和棕榈仁油中的常见脂肪酸，被用作多种表面活性剂的原材料、被用在食品中，并被用于其他材料。
目前，月桂酸的供应来源被限制在椰子和棕榈仁，而椰子和棕榈仁仅在世界上有限的地区生长。现在分配来产生月桂酸来源的耕地将会在激烈的竞争下分摊给柴油机用生物燃料以及食品生产领域。为了生产月桂酸来源，过度的土地开垦会造成对热带雨林的破坏。
因此，需要创建一种不依赖于椰子或棕榈仁的供应月桂酸的技术。
同时，已知横裂甲藻纲（dinophyceae）中通过异养而非光合作用生长的寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）是产月桂酸的生物并具有高含量的月桂酸（15.7%/总脂质）（Phytochemistry,(1988)27,1679-1683）。
从碳源成本和其他因素的观点出发，更加优选能通过光合作用（自养）生长并具有更高含量的月桂酸的藻类。然而，在这些光自养的藻类中，仅已知最多含有约1~2%含量的月桂酸的富油新绿藻（Neochlorisoleoabundans）（J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(2009)36:821-826），并且迄今为止还不知道有任何藻类具有更高的月桂酸含量。
发明内容
本发明涉及一种制备含有月桂酸作为构成脂肪酸的油脂的方法，该方法包括在培养基中培养属于共生甲藻属（Symbiodinium）的藻类并从培养产物中回收含有月桂酸的油脂，其中，所述油脂中月桂酸的含量为脂肪酸组成的3重量%以上。
本发明还涉及一种制备月桂酸的方法，该方法包括从油脂中分离和回收月桂酸。
具体实施方式
本发明提供一种通过采用藻类来供应月桂酸的方法。
本发明者们对产月桂酸的生物进行了研究，并且发现：作为光自养的横裂甲藻纲的共生甲藻属的藻类具有高的月桂酸含量，并且使用该藻类可以有效地制备以高含量含有月桂酸作为构成脂肪酸的油脂。
根据本发明的方法，通过采用能够稳定生长的藻类，从而可以有效地制备以高含量含有月桂酸作为构成脂肪酸的油脂，而不会对椰子和棕榈仁生长的耕地产生限制，也不与用于食品生产等的耕地进行竞争。另外，根据本发明的方法，还可以避免对热带雨林的破坏。
本发明的制备含有月桂酸的油脂的方法包括在培养基中培养属于共生甲藻属的藻类，并从培养产物中回收含有月桂酸的油脂，其中，该油脂中月桂酸的含量为脂肪酸组成的3重量%以上。
油脂具有脂肪酸组成的3重量%以上的月桂酸含量。月桂酸的含量优选为5~60重量%，更优选为10~60重量%。
本发明中所采用的藻类可以是任意属于横裂甲藻纲中共生甲藻属的藻株，只要该株能够生产出具有月桂酸含量为脂肪酸组成的3重量%以上的油脂。
本发明的藻类可以通过例如以下的筛选步骤来进行选择：
i）将灭菌培养基（作为淡水培养基的WA培养基（参见表2）或作为海水培养基的Daigo IMK培养基（参见表3））配放在培养容器中；
ii）将藻株接种到培养基中，并在光照下（照度：约3,000勒克司，光照12小时黑暗12小时）室温下（22℃~24℃）进行静态培养；
iii）回收所产生的藻类并提取油脂；使脂肪酸甲酯化；并确定脂肪酸组成，从而选出能够产生含月桂酸的油脂的藻株；并且
iv）选择具有月桂酸含量为油脂中总脂肪酸的3重量%以上的藻株。
作为优选的藻类的例子，包括双鞭毛藻（Symbiodiniummicroadriaticum）、Symbiodinium goreaui、Symbiodinium linucheae、百幕大共生藻（Symbiodinium bermudense）、米氏共生藻（Symbiodiniummeandrinae）、加利福尼共生藻（Symbiodinium californium）、川口共生藻（Symbiodinium kawagutii）、Symbiodinium corculorum、Symbiodiniumconsortia、Symbiodinium muscatinei、Symbiodinium freudenthal、美丽共生藻（Symbiodinium pulchrorum）、多毛共生藻（Symbiodinium pilosum）和共生藻（Symbiodinium sp.）。在某些情况下，双鞭毛藻被称为或描述为典型涡鞭毛虫（Zooxanthella microadriatica）或小亚得里亚裸甲藻（Gymnodinium microadriaticum）。类似地，Symbiodinium linuchae在某些情况下被称为或被描述为Gymnodinium linuchae。作为更加优选的双鞭毛藻种的例子，包括典型涡鞭毛虫株LB2281（可从德克萨斯大学奥斯汀分校（UTEX）的藻类培养保藏中心（Culture Collection ofAlgae）得到）以及具有与株LB2281实质上相同的藻类学特性的株。作为具有与株LB2281实质上相同的藻类学特性的株的例子，包括共生藻株CCMP2948、共生藻株CCMP2592、双鞭毛藻株CCMP827、双鞭毛藻株CCMP2458等。
株LB2281具有以下的藻类学特性。可以基于以下的特性来识别与株LB2281属于相同属的株、以及与株LB2281具有实质上相同的真菌学特性的株。
<株LB2281的藻类学特性>
i）与其他原生生物、软体动物、腔肠动物等共生，例如有孔虫、放射虫、贝类珊瑚和海葵；
ii）具有从细胞腹面延伸出来的鞭毛和带状物；以及
iii）细胞衣不具有板状结构（萼板）。
本发明的藻类也包括上述株LB2281或具有与株LB2281实质上相同的真菌学特性的株的突变株。
例如，被设计成与相应的野生型株相比生产具有更高月桂酸含量的油脂的突变株也包括在本发明的藻类中。
此外，从属于共生甲藻属的本发明的藻类中得到的基因可以被用于生产具有高的月桂酸含量的油脂。
属于共生甲藻属的本发明的藻类，可以在由天然或人工海水制得的适宜的培养基中，在光照下，通过通常微藻的培养中所采用的培养方法来进行培养。
可以在本发明中采用的培养基是包含作为基础的天然或人工海水、以及例如氮源、磷源、金属盐和维生素的添加剂的公知的培养基。
作为氮源的例子，包括NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NH4NO3和(NH4)2SO4。作为磷源的例子，包括K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4和甘油磷酸钠。作为金属盐的例子，包括NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、Na2SO4、K2SO4、MgSO4、Na2CO3、NaHCO3、Na2SiO3、H3BO3、MnCl2、MnSO4、FeCl3、FeSO4、CoCl2、ZnSO4、CuSO4和Na2MoO4。作为维生素的例子，包括生物素、维生素B12、硫胺素-HCl、烟酸、肌醇、叶酸和胸腺嘧啶。
上述培养基可以进一步包含适宜的添加剂，例如碳源或痕量金属，以促进含月桂酸的油脂的产生。
优选的培养基的例子包括Daigo IMK培养基、f/2培养基、ESM培养基、L1培养基和MNK培养基。
优选为，通过加入适宜的酸或碱，将由此制备的培养基的pH调节到7.0~8.0的范围内，并在使用之前在高压釜中进行灭菌。
在培养中，对于接种到培养基中的藻类的量没有特别地限制。然而，相对于培养基的量，接种量优选为1.0~10.0%（vol/vol），更优选为1.0~5.0%（vol/vol）。
对于培养温度没有特别地限制，只要不会对本发明的藻类的生长产生不利地影响。通常，优选在10~30℃下进行培养，更加优选为15~25℃。
光照可以在任何条件下进行，只要可以进行光合作用。不必说，人工光或阳光均可采用。
光照度优选为在100~50,000勒克司的范围内，更加优选为300~10,000勒克司。
培养过程中的pH通常为6.5~8.5，优选为7.0~8.0。
进行培养以使藻类以高密度生长。例如，培养周期为7~120天，优选为7~30天。可以采用通气和震荡培养（aeration and agitationculturing）、振荡培养（shake culturing）和静态培养中的任意一种。
在完成培养后，通过例如离心或过滤的常用方法来分离藻类。对于这样分离出来的藻类体本身、或者通过超声处理而得到的其破碎产物、用Dyno研磨机或其他方式而得到的其破碎产物，使用有机溶剂例如氯仿、己烷、丁醇、甲醇或乙酸乙酯进行溶剂提取，从而可以回收含月桂酸的油脂。
当使用株LB2281时，100g的干燥藻类包含约10g~约20g量的含月桂酸的油脂。即，在1L培养基中产出的含月桂酸的油脂的量达到约0.05g~约0.1g。
在该情况下，油脂具有高达脂肪酸组成的6.0~15.0重量%的月桂酸含量。因此，在1L培养基中产出的含月桂酸的油脂的量高达约0.003g~约0.015g。
通过已知的方法将油脂转化为脂肪酸混合物或脂肪酸酯，并且通过尿素附加法、冷却分离、HPLC、超临界液相色谱法等回收高含量的月桂酸，从而可以将月桂酸从含月桂酸的油脂中分离出来。
实施例
参考例1：藻类的培养和脂肪酸组成的分析
从德克萨斯大学奥斯汀分校（UTEX）的藻类培养保藏中心得到以下20种藻株。
[表1]
藻株和培养基
用以下的方法进行藻类的培养。分别采用WA培养基（组成参见表2）和市售培养基（Daigo IMK培养基，Nihon Pharmaceutical Co.,Ltd.的产品）（组成参见表3）作为淡水培养基和海水培养基。
[表2]
WA培养基的组成
  对于1L
  NaNO3   20mg
  Ca(NO3)2·4H2O   60mg
  KCl   10mg
  MgSO4·7H2O   20mg
  甘油磷酸钠   10mg
  Na2EDTA   5mg
  FeCl3·6H2O   240μg
  H3BO3   1mg
  MnCl2·4H2O   7.2mg
  ZnCl2   50μg
  CoCl2·6H2O   20μg
  氨基丁三醇   100mg
  盐酸硫胺素(Thiamin·HCl)   100μg
  生物素   10μg
  维生素B12   10μg
[表3]
IMK培养基的组成
  对于1L
  NaNO3   200mg
  Na2HPO4   1.4mg
  K2HPO4   5mg
  NH4Cl   2.68mg
  Fe-EDTA   5.2mg
  Mn-EDTA   332μg
  Na2-EDTA   37.2mg
  ZnSO4·7H2O   23μg
  CoSO4·7H2O   14μg
  Na2MoO4·2H2O   7.3μg
  CuSO4·5H2O   2.5μg
  H2SeO3   1.7μg
  MnCl2·4H2O   180μg
  盐酸硫胺素   200μg
  生物素   1.5μg
  维生素B12   1.5μg
  人工海水   35.96g
使用每个都用海绵塞（60882-167，VWR的产品）塞住的灭菌培养管（16mm×150mm）（VWR的产品），并将灭菌培养基分配到管内（10mL/管）。将每种藻株（100μL（在液体培养基的情况下）或1铂环（在固体培养基的情况下））都接种到培养基中。在日光灯（光照度：约3,000勒克司，光照12小时并黑暗12小时）下于室温（22℃~24℃）进行静态培养。
通过将藻类培养物在3,000rpm下离心30分钟，得到藻粒（algapellet）。将藻粒在80℃下干燥约3小时~约16小时，从而得到干燥的藻类，并测定干燥产物的重量。将干燥产物悬浮在1%的生理盐水（0.5mL）中，并在悬浮液中加入5mg/mL的7-十五烷酮（10μL）作为内标。随后，在悬浮液中加入氯仿（0.5mL）和甲醇（1mL），用力搅拌混合物，然后静置30分钟。其后，在混合物中加入氯仿（0.5mL）和1.5%的KCl（0.5mL）并进行搅拌，随后在3,000rpm下离心15分钟。回收形成的氯仿层（下层）。
用氮处理由此制得的脂质组分（约500μL）直至干燥，在干燥组分中加入0.5N氢氧化钾/甲醇溶液（700μL），之后在80℃下孵育30分钟。接下来，在组分中加入14%三氟化硼溶液（SIGMA的产品）（1mL），之后在80℃下孵育20分钟。之后，在以上的混合物中加入己烷（1mL）和饱和盐水（1mL），将混合物在室温下静置30分钟。回收由此得到的己烷层（上层）并用GC分析。
在以下的条件下进行GC分析：色谱仪，HP 7890A GC-FID（Agilent的产品）；柱，DB-1MS 30m×200μm×0.25μm（J&W scientific的产品)；流动相，高纯度氦；流速，1mL/min；以及升温方式，100℃（1分钟），5℃/min，和280℃（20分钟）。作为饱和脂肪酸的对照，购买并分析以下的市售产品（全部由SIGMA生产）：月桂酸甲酯（C12）、肉豆蔻酸甲酯（C14）、棕榈酸甲酯（C16）和硬脂酸甲酯（C18）。作为不饱和脂肪酸的对照，购买并分析以下的市售产品（全部由SIGMA生产）：棕榈油酸甲酯（C16:1）、油酸甲酯（C18:1）、亚油酸甲酯（C18:2）、亚麻酸甲酯（C18:3）、二十碳五烯酸甲酯（C20:5）和二十二碳六烯酸甲酯（C22:6）。基于脂肪酸被分析物与相应标准物之间的保留时间的重合来进行脂肪酸的鉴定。也通过GC-MS来鉴定月桂酸。从GC-MS的分析结果来估算C16多不饱和脂肪酸，并用C16：x（x是2或3，其中x表示脂肪酸中不饱和键的数目）来表示。在以下的条件下进行GC-MS分析：色谱仪，HP7890A GC和5975C MS（Agilent的产品)；柱，DB-1ms 30m×200μm×0.25μm（J&W scientific的产品）；流动相，高纯度氦；流速，1mL/min；升温方式，100℃（1分钟），5℃/min，和280℃（20分钟）。参照内标来计算通过GC分析检测到的脂肪酸酯的量，将脂肪酸的总量作为总脂肪酸量。将通过将总脂肪酸量除以干燥藻类的量并将该比例乘以100而得到的值用作脂肪酸含量（%）。
表4表示试验的藻类的脂肪酸组成的数据。
[表4]
脂肪酸组成分析
分析由多种藻类产生的脂质的脂肪酸组成。然而，没有发现积累月桂酸的藻类。
实施例1
在实验中采用从UTEX得到的典型涡鞭毛虫（属于横裂甲藻纲）株LB2281。
将微生物在Daigo IMK培养基中进行培养。将每个都用海绵塞（60882-167，VWR的产品）塞住的灭菌培养管（16mm×150mm）（VWR的产品）用作培养容器，将灭菌培养基（10mL/管）分配到管中。将100μL的藻类培养物接种到新的培养基中。在日光灯（光照度：约3,000勒克司，光照12小时并且黑暗12小时）下室温（22℃~24℃）下进行59天培养。
采用与参考例1相似的方式进行藻类回收、脂质提取、甲酯化和GC分析，从而分析脂肪酸组成。将结果表示于表5中。
[表5]
典型涡鞭毛虫（株LB2281）的脂肪酸组成
在典型涡鞭毛虫（株LB2281）中，观察到月桂酸的积累，其含量达到总脂肪酸量的13.2%。
实施例2：具有高月桂酸含量的藻类油脂的制备
用以下的方式来制备具有高月桂酸含量的油脂。
在含有200mL的IMK培养基的500-mL Sakaguchi烧瓶中培养典型涡鞭毛虫（株LB2281），并在光照（光照度：约3,000勒克司，光照12小时并且黑暗12小时）下于室温（22℃~24℃）进行38天的静态培养。培养液在3,000rpm下离心30分钟，从而回收细胞。
将藻类在80℃下干燥约16小时，并在干燥的藻类中加入氯仿/甲醇（C/M）（1:1）（4mL）。在超声处理下，40℃下提取油脂30分钟。以类似的方式，用C/M（1:1）（4mL）再次进行提取。将由此回收的上清液（约8mL）通过滤膜（Millipore的产品，Millex-LH,HydrophilicPTFE，0.45μm，φ25mm）进行过滤。用离心蒸发器干燥滤液，从而得到19.4mg的株LB2281的油脂组分。
通过与实施例1类似的方式，分析油脂组成。油脂组分中的脂肪酸含量为34.4%，总脂肪酸量中的月桂酸含量为7.8%。换而言之，从油脂组分（19.4mg）中回收月桂酸（0.518mg）。
实施例3：横裂甲藻纲中的月桂酸累积
在实验中采用从UTEX得到的典型涡鞭毛虫（横裂甲藻纲）株LB2282和从Provasoli-Guillard国家海洋浮游植物培养中心（Provasoli-Guillard National Center for Culture of MarinePhytoplankton，CCMP）得到的共生藻株CCMP2948。
藻类在Daigo IMK培养基中进行培养。使用每个都用海绵塞（60882-167，VWR的产品）塞住的灭菌培养管（16mm×150mm）（VWR的产品），并将灭菌培养基（10mL/管）分配到管中。将100μL每种藻类的培养物接种到培养基中。每种藻类都在日光灯下（光照度：约3,000勒克司，光照12小时并且黑暗12小时）下于室温（20℃）培养约2个月。
采用与参考例1相似的方式进行藻类的回收、脂质的提取、甲酯化和GC分析，从而分析脂肪酸组成。将结果表示于表6。
[表6]
共生甲藻属（虫黄藻）的脂肪酸组成
在共生甲藻属（虫黄藻）中，观察到月桂酸的累积为总脂肪酸量的3重量%以上。
实施例4：横裂甲藻纲中月桂酸的累积
在实验中采用从CCMP得到的共生藻CCMP2592以及双鞭毛藻CCMP827和CCMP2458。
藻类在Daigo IMK培养基中进行培养。使用每个都用海绵塞（60882-167，VWR的产品）塞住的灭菌培养管（16mm×150mm）（VWR的产品），并将灭菌培养基（10mL/管）分配到管中。将100μL每种藻类的培养物接种到培养基中。每种藻类都在日光灯下（光照度：约3,000勒克司，光照12小时并且黑暗12小时）下于室温（20℃）培养约42天。
采用与参考例1相似的方式进行藻类的回收、脂质的提取、甲酯化和GC分析，从而分析脂肪酸组成。将结果表示于表7。
[表7]
共生甲藻属的脂肪酸组成
在共生甲藻属中，观察到月桂酸的累积为总脂肪酸量的3重量%以上。

Claims (3)

1.一种制备含有月桂酸作为构成脂肪酸的油脂的方法，其中，
所述方法包括在培养基中培养属于共生甲藻属的藻类并从培养产物中回收油脂，所述油脂中月桂酸的含量为脂肪酸组成的3重量％以上，
所述属于共生甲藻属的藻类是典型涡鞭毛虫株LB2281、典型涡鞭毛虫株LB2282、共生藻株CCMP2948、共生藻株CCMP2592、双鞭毛藻株CCMP827、或者双鞭毛藻株CCMP2458，所述培养产物是通过所述培养而得到的藻类。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
培养在光照度为300～10,000勒克司的光照下进行7～120天。
3.一种制备月桂酸的方法，其中，
所述方法包括从通过权利要求1所述的方法而制得的油脂中分离并回收月桂酸。
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