PL204911B1

PL204911B1 - Sposób wytwarzania oleju mikrobiologicznego

Info

Publication number: PL204911B1
Application number: PL367563A
Authority: PL
Inventors: Mirosława Szczęsna-Antczak; Tadeusz Antczak; Stanisław Bielecki
Original assignee: Politechnika & Lstrok Odzka
Priority date: 2004-04-26
Filing date: 2004-04-26
Publication date: 2010-02-26
Also published as: PL367563A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oleju mikrobiologicznego, o wysokim stężeniu nienasyconych kwasów tłuszczowych.

W czasopismach Microbiology 144, (1998), s. 2639 i European Journal of Biochemistry 252, (1998), s. 513 opisano biosyntezę triacylogliceroli przez grzyb Mucor circinelloides hodowany na podłożu płynnym o składzie : 5,75 g/l glukozy, 7,02 g (NH)2SO4, 6,00 g KH2PO4, 1,20 g MgSO4 x 7H2O i 1,00 g/l ekstraktu droż d ż owego, w temperaturze 25°C w czasie 7-8 dni.

Z czasopisma Folia Microbiologica 37, (1992), s. 357 jest znany sposób otrzymywawania triacylogliceroli w drodze hodowli wgłębnej szczepu Mucor circinelloides CCF 127 na podłożu zawierającym w 1 l: 30 g sacharozy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 1 g KH2PO4 x 3H2O, 3 g NaNO3, 0,5 g MgSO4 x x 7H2O, 0,5 g KCl, 0,01 g FeSO4 x 7H2O w temperaturze 28°C w czasie 14 dni.

Z czasopisma World Journal of Microbiology and Biotechnology 13, (197), s. 357 jest znany sposób biosyntezy triacylogliceroli w wyniku hodowli wgłębnej szczepu Mucor circinelloides f. circinelloides CBS 108.16 na podłożach zawierających w 1 l: 40 g oleju słonecznikowego, 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,25 g MgSO4 x 7H2O, 10 g KH2PO4, 0,05 g CaCl2 x 2H2O, 1,28 g NH4Cl, Cl lub 30 g oleju słonecznikowego, 10 g octanu sodu, 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,25 g MgSO4 x 7H2O, 10 g KH2PO4, 0,05 g CaCl2x2H2O, 1,28 g NH4Cl.

W czasopiś mie Biotechnology Letters 17, (195), 93 zamieszczono informację o sposobie otrzymywania substancji tłuszczowych w wyniku hodowli wgłębnej szczepu Mucor circinelloides CBS 203.28 na podłożu zawierającym glukozę lub kwas octowy jako źródło węgla.

W czasopiś mie Biochemica et Biophysica Acta 1289, (1996), s. 203 opisano sposób otrzymywania substancji lipidowych w wyniku hodowli wgłębnej szczepów Mucor circinelloides MSI i Mucor circinelloides MS9 na podłożu zawierającym w 1 l: 3 g ekstraktu drożdżowego, 10 g baktopeptonu, 20 g glukozy, w temperaturze 24°C.

Z czasopisma Applied Biochemistry and Microbiology 38(6), (2002), s. 553-557 jest znany sposób wytwarzania oleju mikrobiologicznego w drodze hodowli grzyba Mucor na pożywce hodowlanej zawierającej olej roślinny, ekstrakt z kukurydzy oraz sole mineralne.

W kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej Politechniki Ł ódzkiej znajduje się , wyodrę bniony ze środowiska naturalnego, szczep pleśni Mucor circinelloides oznaczony symbolem T45.

Sposób wytwarzania oleju mikrobiologicznego, w drodze hodowli szczepu Mucor circinelloides, polegający na inkubacji szczep pleśni Mucor circinelloides na podłożu stałym zawierającym 20-30 części wagowych agaru i 1000 części wagowych brzeczki piwowarskiej zawierającej 8% wagowych suchej masy, w temperaturze 29-31°C, w czasie 3-5 dni, przeszczepieniu na uprzednio wysterylizowane, ciekłe podłoże hodowlane zawierające substancję tłuszczową, ewentualnie namok kukurydziany, ewentualnie sole mineralne jak KH2PO4, NaCl, MgSO4 x 7H2O, CaCl2 x 6H2O, Fe2(SO4)3, mikroelementy, prowadzeniu hodowli wstrząsanej w temperaturze 28-32°C, w czasie 3-8 dni, oddzieleniu otrzymanej w wyniku hodowli produkcyjnej biomasy od cieczy pohodowlanej, poddaniu jej 2-5-krotnemu przemyciu wodą wodociągową stosowaną w ilości 5-20 części wagowych na 1 część wagową odfiltrowanej biomasy, odsączeniu nadmiaru wody i poddaniu biomasy 2-5-krotnej ekstrakcji, korzystnie acetonem i następnie heksanem, mieszaniną metanolu i chloroformu o stosunku objętościowym składników 1:1 lub mieszaniną etanolu i heksanu o stosunku objętościowym składników 1:1, o temperaturze od -20°C do 20°C, użytymi w ilości 10-20 części wagowych na 1 część wagową odfiltrowanej biomasy i następnie oddestylowaniu roztworów użytych rozpuszczalników i przechowywaniu otrzymanych lipidów pod zamknięciem w temperaturze 4°C, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się wyodrębniony ze środowiska naturalnego szczep pleśni Mucor circinelloides T45, który hoduje się na podłożu płynnym zawierającym w częściach wagowych: jako substancję tłuszczową olej roślinny lub tłuszcz zwierzęcy w ilości co najmniej 20 części, namok kukurydziany w ilości 0-70 części, KH2PO4 w ilości 0-10 części, NaCl w ilości 0-0,3 części, MgSO4 x 7H2O w ilości 0-1 części, CaCl2 x x 6H2O w iloś ci 0-0,4 części, Fe2(SO4)3 w iloś ci 0-4 części, roztwór wodny mikroelementów iloś ci 0-0,3 części, wodę wodociągową w ilości 1000 części, a nadto 0-50 części glukozy, o wyjściowym pH = 4,7-5.

Jako olej roślinny stosuje się korzystnie olej rzepakowy, oliwkowy, słonecznikowy, lniany lub sojowy. Jako tłuszcz zwierzęcy stosuje się korzystnie łój wieprzowy, wołowy lub drobiowy. Roztwór mikroelementów zawiera korzystnie w 1 l: 500 mg H3BO3, 100 mg KI, 40 mg CuSO4, 500 mg MnSO4, 200 mg Na2MoO4, 400 mg ZnSO4.

PL 204 911 B1

Sposób według wynalazku zezwala na otrzymanie oleju mikrobiologicznego z wydajnością 5-20 g z 1 litra podłoża hodowlanego tj. wyższą od wydajności znanych sposobów otrzymywania tego oleju. Skład ilościowy i jakościowy otrzymanego oleju jest uzależniony od składu podłoża hodowlanego stosowanego do hodowli grzyba Mucor circinelloides T45. Otrzymany sposobem według wynalazku olej zawiera w swym składzie wyższe kwasy tłuszczowe w następującej proporcji: 0,8-1,1% C14:0, 9-25% C16:0, 3-12% C18:0, 27-74% C18:1, 10-51% C18:2, 1-12% C18:3 i 1-5,0% innych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.

Olej mikrobiologiczny otrzymany sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie w kosmetyce jako składnik kremów, w farmacji i medycynie jako składnik preparatów stosowanych w profilaktyce reumatoidalnego zapalenia stawów, atopowego zapalenia skóry, schizofrenii, stwardnienia rozsianego, miażdżycy, preparatów stosowanych w leczeniu nadciśnienia oraz zatruć alkoholem i lekami oraz preparatów stosowanych w zapobieganiu niedokrwiennej chorobie serca. Nadto znajduje zastosowanie jako składnik preparatów odżywczych i pasz, a także jako składnik emulgatorów żywności i jako nutraceutyk.

Sposób według wynalazku ilustrują bliżej podane niżej przykłady.

P r z y k ł a d I.

Wyodrębniony ze środowiska naturalnego szczep pleśni Mucor circinelloides T45 poddano inkubacji na podłożu stałym zawierającym 30 części wagowych agaru i 1000 części wagowych brzeczki piwowarskiej zawierającej 8% wagowych suchej masy, w temperaturze 30°C w czasie 3 dni, po czym otrzymane w wyniku inkubacji zarodki pleśni przeszczepiono na uprzednio wysterylizowane podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 27 części oleju rzepakowego, 59 części namoku kukurydzianego, 1000 części wody wodociągowej i wyjściowym pH 4,8 i prowadzono hodowlę wstrząsaną przy szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min^-1, stopniu napełnienia kolb 30%, w temperaturze 30°C w cią gu 3 dni. Biomasę Mucor circinelloides T45, otrzymaną w wyniku hodowli produkcyjnej, odfiltrowano przy użyciu przegrody celulozowej i zalewano kolejno 3 porcjami po 0,1 l wody wodociągowej, mieszano za każdym razem przez 2 minuty i sączono na przegrodzie celulozowej. Oddzieloną od wody biomasę zalewano kolejno 3 porcjami po 0,1 l acetonu o temperaturze pokojowej, mieszano za każdym razem po 5 minut i sączono na przegrodzie celulozowej, pozostałą biomasę zalewano kolejno 2 porcjami heksanu po 0,075 l i mieszano za każ dym razem po 5 minut. Aceton i heksan oddzielone po przemyciu biomasy zmieszano i poddano destylacji.

Otrzymano 15 g oleju mikrobiologicznego z 1 l podłoża. Olej ten zawierał następujące wyższe kwasy tłuszczowe w ilości: 0,8% C14:0, 8,2% C16:0, 3,4% C18:0, 74,0% C18:1, 11,9% C18:2, 1,7% C18:3.

P r z y k ł a d II.

Zarodki pleśni Mucor circinelloides T45, otrzymane jak w przykładzie I, przeszczepiono na uprzednio wysterylizowane podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 5 części glukozy, 35 części oleju oliwkowego, 8 części KH2PO4, 0,1 części NaCl, 0,5 części MgSO4 x 7H2O, 0,2 części CaCl2 x 6H2O, 0,25 części Fe2(SO4)3, 0,1 części roztworu wodnego mikroelementów (zawierającego w 1 l: 500 mg H3BO3, 100 mg KI, 40 mg CuSO4, 500 mg MnSO4, 200 mg Na2MoO4, 400 mg ZnSO4), 1000 części wody wodociągowej, o wyjściowym pH 4,8 i prowadzono hodowlę wstrząsaną przy szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min^-1, stopniu napełnienia kolb 30%, w temperaturze 30°C w ciągu 5 dni. Biomasę Mucor circinelloides T45, otrzymaną w wyniku hodowli produkcyjnej, filtrowano i przemywano jak w przykładzie I. Oddzieloną od wody biomasę zalewano kolejno 3 porcjami po 0,1 l etanolu o temperaturze pokojowej, mieszano za każdym razem po 5 minut i sączono na przegrodzie celulozowej. Pozostałą biomasę zalewano kolejno 2 porcjami heksanu po 0,075 l i mieszano za każdym razem po 5 minut. Etanol i heksan stosowany do przemycia biomasy mieszano i poddano destylacji.

Otrzymano 13,6 g oleju mikrobiologicznego z 1 l podłoża. Olej ten zawierał następujące wyższe kwasy tłuszczowe w ilości: 0,9% C14:0, 8,7% C16.0, 5,2% C18:0, 27,4% C18:1, 48,5% C18:2, 2,9% C18:3 i 5,3% innych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.

P r z y k ł a d III.

Zarodki pleśni Mucor circinelloides T45, otrzymane jak w przykładzie I, przeszczepiono na uprzednio wysterylizowane podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 25 części oleju oliwkowego, 8 części KH2PO4, 0,1 części NaCl, 0,5 części MgSO4 x 7H2O, 0,2 części CaCl2 x 6H2O, 0,25 części Fe2(SO4)3, 0,1 części roztworu wodnego mikroelementów (zawierającego w 1 l: 500 mg H3BO3, 100 mg KI, 40 mg CuSO4, 500 mg MnSO4, 200 mg Na2MoO4, 400 mg ZnSO4) i 1000 części wody wodociągowej, o wyjściowym pH 4,8 i prowadzono hodowlę wstrząsaną przy szybkości obroto4

PL 204 911 B1 wej wstrząsarki 220 min^-1, stopniu napełnienia kolb 30%, w temperaturze 30°C w ciągu 5 dni. Biomasę Mucor circinelloides T45, otrzymaną w wyniku hodowli produkcyjnej, filtrowano i przemywano jak w przykł adzie I. Nagromadzone lipidy ekstrahowano jak w przykł adzie I.

Otrzymano 6,4 g oleju mikrobiologicznego z 1 l podłoża. Olej ten zawierał następujące wyższe kwasy tłuszczowe w ilości: 1,0% C14:0, 4,2% C16:0, 4,2% C18:0, 31,6% C18:1, 57,0% C18:2, 0,5%C18:3.

P r z y k ł a d IV.

Zarodki pleśni Mucor circinelloides T45, otrzymane jak w przykładzie I, przeszczepiono na uprzednio wysterylizowane podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 50 części glukozy, 10 części namoku kukurydzianego, 25 części oleju oliwkowego, 8 części KH2PO4, 0,1 części NaCl, 0,5 części MgSO4 x 7H2O, 0,2 części CaCl2 x 6H2O, 0,25 części Fe2(SO4)3, 0,1 części roztworu mikroelementów (zawierającego w 1 l: 500 mg H3BO3, 100 mg KI, 40 mg CuSO4, 500 mg MnSO4, 200 mg Na2MoO4, 400 mg ZnSO4), 1000 części wody wodociągowej, o wyjściowym pH 4,8 i prowadzono hodowlę wstrząsaną przy szybkości obrotowej wstrząsarki 200 min^-1, stopniu napełnienia kolb 30%, w temperaturze 30°C w cią gu 5 dni. Biomasę Mucor circinelloides T45, otrzymaną w wyniku hodowli produkcyjnej filtrowano i przemywano jak w przykładzie I. Nagromadzone lipidy ekstrahowano jak w przykładzie II.

Otrzymano 17,0 g oleju mikrobiologicznego z 1 l podłoża. Olej ten zawierał następujące wyższe kwasy tłuszczowe w ilości: 0,8% C14:0, 6,3% C16:0, 4,2% C18:0, 32,4% C18:1, 51,0% C18:2, 1,9% C18:3.

P r z y k ł a d V.

Zarodki pleśni Mucor circinelloides T45, otrzymane jak w przykładzie I, przeszczepiono na uprzednio wysterylizowane podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 50 części glukozy, 35 części oleju oliwkowego, 8 części KH2PO4, 0,1 części NaCl, 0,5 części MgSO4 x 7H2O, 0,2 części CaCl2 x 6H2O, 0,25 części Fe2(SO4)3, 0,1 części roztworu wodnego mikroelementów (zawierającego w 1 l: 500 mg H3BO3, 100 mg KI, 40 mg CuSO4, 500 mg MnSO4, 200 mg Na2MoO4, 400 mg ZnSO4,) 1000 części wody wodociągowej, o wyjściowym pH 4,8 i prowadzono hodowlę wstrząsaną przy szybkości obrotowej wstrząsarki 250 min^-1, stopniu napełnienia kolb 30%, w temperaturze 30°C w ciągu 5 dni. Biomasę Mucor circinelloides T45, otrzymaną w wyniku hodowli produkcyjnej, filtrowano i przemywano jak w przykładzie I. Nagromadzone lipidy ekstrahowano jak w przykładzie I.

Uzyskano 10,1 g oleju mikrobiologicznego z 1 l podłoża. Olej ten zawierał następujące wyższe kwasy tłuszczowe w ilości: 1,1% C14:0, 5,2% C16:0, 4,1% C18:0, 31,1% C18:1, 47,5% C18:2, 1,7% C18:3 i 6,8% innych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.

P r z y k ł a d VI.

Wyodrębniony ze środowiska naturalnego szczep pleśni Mucor circinelloides T45 poddano inkubacji na podłożu stałym zawierającym 30 części wagowych agaru i 1000 części wagowych brzeczki piwowarskiej zawierającej 8% wagowych suchej masy, w temperaturze 30°C w czasie 3 dni, po czym przeszczepiono na uprzednio wysterylizowane podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 20 części łoju zwierzęcego, 59 części namoku kukurydzianego, 1000 części wody wodociągowej, o wyjściowym pH 4,8 i prowadzono hodowlę wstrząsaną przy szybkości obrotowej wstrząsarki 280 min^-1, stopniu napełnienia kolb 30%, w temperaturze 30°C w ciągu 6 dni. Biomasę Mucor circinelloides T45, otrzymaną w wyniku hodowli produkcyjnej, filtrowano i przemywano jak w przykładzie I. Nagromadzone lipidy ekstrahowano jak w przykładzie I.

Otrzymano 10 g oleju mikrobiologicznego z 1 l podłoża. Olej ten zawierał następujące wyższe kwasy tłuszczowe w ilości: 0,8% C14:0, 8,2% C16:0, 3,4% C18:0, 74,0% C18:1, 11,9% C18:2 i 1,7% C18:3.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania oleju mikrobiologicznego, w drodze hodowli szczepu Mucor circinelloides, polegający na inkubacji szczepu pleśni Mucor circinelloides na podłożu stałym zawierającym 20-30 części wagowych agaru i 1000 części wagowych brzeczki piwowarskiej zawierającej 8% wagowych suchej masy, w temperaturze 29-31°C, w czasie 3-5 dni, przeszczepieniu na uprzednio wysterylizowane, ciekłe podłoże hodowlane zawierające substancję tłuszczową, ewentualnie namok kukurydziany, ewentualnie sole mineralne jak KH2PO4, NaCl, MgSO4 x 7H2O, CaCl2 x 6H2O, Fe2(SO4)3, miPL 204 911 B1 kroelementy, prowadzeniu hodowli wstrząsanej w temperaturze 28-32°C, w czasie 3-8 dni, oddzieleniu otrzymanej w wyniku hodowli produkcyjnej biomasy od cieczy pohodowlanej, poddaniu jej 2-5-krotnemu przemyciu wodą wodociągową stosowaną w ilości 5-20 części wagowych na 1 część wagową odfiltrowanej biomasy, odsączeniu nadmiaru wody i poddaniu biomasy 2-5-krotnej ekstrakcji, korzystnie acetonem i następnie heksanem, mieszaniną metanolu i chloroformu o stosunku objętościowym składników 1:1 lub mieszaniną etanolu i heksanu o stosunku objętościowym składników 1:1, o temperaturze od -20°C do 20°C, użytymi w ilości 10-20 części wagowych na 1 część wagową odfiltrowanej biomasy i następnie oddestylowaniu roztworów użytych rozpuszczalników i przechowywaniu otrzymanych lipidów pod zamknięciem w temperaturze 4°C, znamienny tym, że stosuje się wyodrębniony ze środowiska naturalnego szczep pleśni Mucor circinelloides T45, który hoduje się na podłożu płynnym zawierającym w częściach wagowych: jako substancję tłuszczową olej roślinny lub tłuszcz zwierzęcy w ilości co najmniej 20 części, namok kukurydziany w ilości 0-70 części, KH2PO4 w ilości 0-10 części, NaCl w ilości 0-0,3 części, MgSO4 x 7H2O w ilości 0-1 części, CaCl2 x 6H2O w ilości 0-0,4 części, Fe2(SO4)3 w ilości 0-4 części, roztwór wodny mikroelementów ilości 0-0,3 części, wodę wodociągową w ilości 1000 części, a nadto 0-50 części glukozy, o wyjściowym pH = 4,7-5.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako olej roślinny stosuje się korzystnie olej rzepakowy, oliwkowy, słonecznikowy, lniany lub sojowy, zaś jako tłuszcz zwierzęcy stosuje się korzystnie łój wieprzowy, wołowy lub drobiowy.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór mikroelementów korzystnie zawierający w 1 l: 500 mg H3BO3, 100 mg KI, 40 mg CuSO4, 500 mg MnSO4, 200 mg Na2MoO4, 400 mg ZnSO4.