CN111139183B - 一种制备分离的珊瑚组织和共生虫黄藻预处理样品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备分离的珊瑚组织和共生虫黄藻预处理样品的方法。本方法提供了一种专门针对珊瑚组织及其共生虫黄藻的稳定同位素预处理样品的制备方法，通过边制备边检测的形式在一定程度上保证了所需样品与其他杂质分离完全，从而获得纯度较高的样品以便提高后续检测的质量和精确性；具有操作简便、阶段性操作时间短、分离样品纯度高的优点，为后续的珊瑚组织和共生虫黄藻稳定同位素的精准检测打下基础；对珊瑚的研究和保护具有重要意义。

Description

一种制备分离的珊瑚组织和共生虫黄藻预处理样品的方法

技术领域

本发明属于珊瑚生理生态学研究技术领域，具体涉及一种制备分离的珊瑚组织和共生虫黄藻预处理样品的方法。

背景技术

近年来，随着科技进步和实验技能的提高，碳、氮、氧、硫等轻元素的稳定同位素被广泛应用于研究化学和生物化学的各种过程和机理。由于这些稳定同位素半衰期长，不易发生变化，所以在生态系统的长期研究中具有重要意义。其中碳稳定同位素常用于比较消费者与其潜在食物的比值来判断其食物来源，同时也可以反映消费者栖息地的变化。而氮稳定同位素在食物网营养级传递过程中会发生富集，故可用于判断其在生物营养级中的位置。简而言之，碳、氮稳定同位素能够反映生物长期摄食状况，体现食物网结构特征，有助于我们了解生物间的营养关系。因此，在海洋生态系统的研究中，碳、氮稳定同位素被较多地应用于构建食物网模型。相较于传统的胃含物分析法，稳定同位素分析法虽然不能直接观测生物摄食状况，但是能够体现季节性捕食差异和生物长期的摄食情况，同时对于胃含物中消化程度较大的食物种类也能够进行准确的辨别。

而目前稳定同位素的分析分为两步，样品的前制备及检测。由于稳定同位素检测机器操作复杂且购买成本高，所以在检测时通常由实验室或单位制作好需要测定的预处理样品送往专业的检测机构进行检测。

发明内容

本发明针对现有技术中没有适合珊瑚稳定同位素测定分析的样品制备方法的不足，提供一种简便、高效的制备用于稳定同位素分析的分离珊瑚组织和共生虫黄藻预处理样品的方法。通过边制备边检测的形式在一定程度上保证了所需样品与其他杂质分离完全，从而获得纯度较高的样品以便提高后续检测的质量和精确性；具有操作简便、阶段性操作时间短、分离样品纯度高的优点，对珊瑚的研究和保护具有重要意义。

本发明提供一种制备分离的珊瑚组织和共生虫黄藻预处理样品的方法，包括以下步骤：

a.灼烧铝箔和GF/F滤膜，备用；

b.用洗牙器冲洗去除珊瑚顶端所有组织，收集冲洗液；珊瑚骨骼干燥备用；

c.将步骤b得到的冲洗液离心，去除上清液，保留沉淀B₁；

d.往沉淀B₁中加入去离子水，然后进行超声破碎，离心，分离上清液A₁和沉淀B₂；

e.往沉淀B₂中加入去离子水，离心，分离上清液A₂和沉淀B₃；

f.将上清液A₁和上清液A₂合并，离心，分离上清液A₃和沉淀B₄；

g.在显微镜下用血球计数板观察上清液A₃，确认共生虫黄藻细胞与珊瑚组织分离完全；

h.将上清液A₃用预烧过的GF/F滤膜抽滤、吸干，并用已灼烧过的铝箔包裹，置于低温冷冻干燥器过夜干燥12-24h，得到珊瑚组织预处理样品，然后储存在-80℃冰箱备用；

i.往沉淀B₄中加入去离子水，离心，保留沉淀B₅；

j.往沉淀B₅中加入盐酸振荡混匀去除碳酸盐，离心，保留沉淀B₆；

k.往沉淀B₆中加入适量去离子水，抽滤，然后包裹在已灼烧过的铝箔中，置于低温冷冻干燥器过夜干燥12-24h，得到共生虫黄藻预处理样品，然后储存在-80℃冰箱备用。

优选：

所述的步骤a中的灼烧是450℃灼烧至少2h，预先准备为正式实验前一天准备。

所述的步骤b中珊瑚骨骼干燥是在烘箱60℃烘24h，所述洗牙器型号为WP-70ECwaterpik waterflosser；

所述的步骤c中离心转速为4000r/min，离心时间为5min；

所述的步骤d中超声破碎形式设置为破碎3s、停3s，破碎总时间为10min；所述的步骤d中离心转速为400r/min，离心时间为5min；若无沉淀则需调整离心条件(适当提高离心转速，延长离心时间)；

所述的步骤e中离心转速为4000r/min，离心时间为5min；

所述的步骤f中离心转速为4000r/min，离心时间为30min；或最高转速10min，离心后需检查溶液中是否有悬浮微粒，若有则需继续离心至无悬浮微粒，操作时也须小心避免沉淀悬浮；

所述步骤h中的干燥处理为低温冷冻干燥；

所述的步骤i中离心转速为4000r/min，离心时间为5min；所述的步骤j中离心转速为4000r/min，离心时间为5min；所述的步骤i中，在步骤e中获得沉淀B₃较多的情况下，可使直接使用沉淀B₃代替沉淀B₄。

优选，所述的步骤j的盐酸为分析纯盐酸。

黄晖等人(提高珊瑚礁区大型海藻稳定同位素样品的δ15N测试精度和制备效率的方法，专利号201210540902.5)在珊瑚礁海区采集大型海藻样品使用冷冻的方式暂时保存，待测试时解冻，用自来水冲洗大型海藻样品表面以去除其表面的杂质。而本实验使用去离子水以及洗牙器对珊瑚进行冲洗，洗牙器的水流控制功能有助于选取合适的水流速度并有效地将珊瑚组织从珊瑚骨骼上冲下，也避免了自来水中的微生物对实验结果的测定造成的影响，同时对于较为脆弱的珊瑚骨骼来说能够防止水流过大将大量的珊瑚骨骼冲下而提高后续分离的难度。

余雅雯等人(长江靖江段近岸小型渔业生物碳氨稳定同位素特征分析，长江流域资源与环境，2017，26(12)：2091-2094)运用碳、氮稳定同位素技术分析中华绒螯蟹及其它小型渔业生物的稳定同位素特征。用1mol/L的稀盐酸处理以去除可能影响δ¹³C的碳酸钙等碳酸盐，酸化后的滤膜用蒸馏水冲洗去除可能残留的盐酸。而本实验中采用的盐酸为分析纯盐酸，浓度高的的盐酸在反应过程中逐步电离，保证在加入盐酸的体积较小的情况下能够有足够的H⁺与虫黄藻样品中可能含有的珊瑚骨骼(主要成分为碳酸钙)反应从而排除了珊瑚骨骼中C元素的干扰，同时由于加入的盐酸体积较小，后续步骤中残留的少量盐酸对同位素测定的精准性不会产生影响。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

目前在本技术领域中，没有提出适合珊瑚的稳定同位素测定分析的样品制备方法。

本发明首次提出了一种专门针对珊瑚及其共生藻虫黄藻的同位素分析预处理样品的制备方法，为珊瑚生理生化研究和生态保护修复提供有力支持。同时，本实验方法在原有的海洋生物稳定同位素分析样品制备方法的基础上，做出了诸多改进，选择了更优的试剂及仪器，同时采用更优的分离方法使样品与其他杂质彻底分离，得到纯度较高的样品。相较于大型海藻的同位素测定样品制备方法中用自来水冲洗海藻表面并最终研磨的方法，本方法在分离步骤中，使用去离子水和洗牙器冲洗珊瑚，使珊瑚组织及共生虫黄藻从珊瑚骨骼中分离出来。而相较于后续步骤研磨的方法，本方法根据共生虫黄藻位于珊瑚虫的消化腔内的特点采用超声破碎的方式使珊瑚组织和共生虫黄藻彻底破碎，同时破碎的共生虫黄藻能够从珊瑚虫消化腔中释放出来，接着利用珊瑚组织和共生虫黄藻的沉降系数不同通过差速离心实现珊瑚组织和共生虫黄藻的彻底分离。由于珊瑚虫会分泌黏液，采用超声破碎法还能避免因黏液干扰导致研磨不充分的情况。相较于中华螯蟹及其他渔业生物的稳定同位素前制备方法而言，本方法在酸化步骤中使用的是分析纯盐酸，使得酸化更彻底。

本方法提供了一种专门针对珊瑚组织及其共生藻虫黄藻的稳定同位素预处理样品的制备方法。为后续的珊瑚组织和共生虫黄藻稳定同位素的精准检测打下基础。而同位素的测定有助于珊瑚组织和共生虫黄藻分配变化的研究。而珊瑚组织和共生虫黄藻的分配变化对珊瑚骨骼钙化有较大的影响，从而该研究有助于了解造礁珊瑚在其生境中的生理变化，为后续的珊瑚礁保护和修复提供思路。此外，本方法也为其他海洋生物稳定同位素的前样品制备提供了新思路。

附图说明

图1是显微镜下观察未破碎离心的上清原液，其中含有珊瑚组织和共生虫黄藻。

图2是显微镜下观察破碎离心分离后的上清液，其中只含有珊瑚组织。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

实验前一天将25mm GF/F滤膜(品牌：whatman)包裹在铝箔纸中450℃灼烧2h，备用。第二天用生物钳分别钳取2.0037g和2.0056g丛生盔形珊瑚(体积约1cm³，南侧和北侧各一，后述珊瑚同)、1.9958g和2.0007g截顶蔷薇珊瑚、2.0056g和2.0048g澄黄滨珊瑚、2.0039g和1.9985g疣状杯形珊瑚。用WP-70EC waterpik waterflosser洗牙器冲洗珊瑚，去除珊瑚顶端的所有组织，收集冲洗液倒入自封袋中并记录体积，珊瑚骨骼干燥(在烘箱以60℃烘24h)备用；将上一步得到的冲洗液分装在50ml离心管中4000r/min离心5min，去除上清液，保留沉淀B₁；往沉淀B₁中加入去离子水5ml，混匀，然后进行超声破碎：以破碎3s、停3s，破碎总时间为10min。破碎后以转速400r/min离心5min，分离上清液A₁和沉淀B₂；往沉淀B₂中加入2ml去离子水，混匀，以转速4000r/min离心5min，分离上清液A₂和沉淀B₃；将上清液A₁和上清液A₂合并，以转速4000r/min离心30min，分离上清液A₃和沉淀B₄；在显微镜下用血球计数板观察上清液A₃，确认共生虫黄藻细胞与珊瑚组织分离完全；将上清液A₃用预烧过的GF/F滤膜抽滤、吸干，并用已灼烧过的的铝箔包裹，置于低温冷冻干燥器过夜干燥24h，得到珊瑚组织预处理样品。往沉淀B₄中加入2ml去离子水，以转速4000r/min离心5min，保留沉淀B₅；用滴管往沉淀B₅中加入四滴(约0.05ml)分析纯盐酸，用漩涡振荡器振荡混匀1min以去除碳酸盐，以转速4000r/min离心5min，保留沉淀B₆；往沉淀B₆中少量多次分批共加入5ml去离子水，确保离心管中的沉淀均转移至GF/F滤膜上，用预烧过的GF/F滤膜抽滤，然后包裹在已灼烧过的的铝箔中，置于低温冷冻干燥器过夜干燥24h，得到共生虫黄藻预处理样品。

图1和图2分别为显微镜下未破碎离心的上清原液(即冲洗液)及破碎离心后的上清液(即上清液A₃)，可以看到经超声破碎、离心分离后，共生虫黄藻细胞与珊瑚组织分离完全。通过上述方法保证了所需样品与其他杂质分离完全，获得高纯度的预处理样品。

把制备得到的珊瑚组织预处理样品和共生虫黄藻预处理样品用手套和镊子取出并放在铝箔包裹盘中储存在-80℃冰箱里；在送去同位素分析之前，将所有样品储存在超低温冰箱中。最后将样品送去做同位素检测。表1即为检测上述样品后的珊瑚的稳定同位素C分析数值。利用制备的分离的珊瑚组织和共生虫黄藻预处理样品，提高了样品稳定同位素检测的质量和精确性。

表1珊瑚的稳定同位素C分析

注：δ¹³C_h表示是珊瑚组织的的稳定同位素分析值；δ¹³C_z表示是共生虫黄藻的的稳定同位素分析值。δ¹³C_h-δ¹³C_z是珊瑚组织的的稳定同位素分析值与共生虫黄藻的的稳定同位素分析值的差值，差值越小，异养能力越强。

Claims (4)

1.一种制备分离的珊瑚组织和共生虫黄藻预处理样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.灼烧铝箔和GF/F滤膜，备用；

b.用洗牙器冲洗去除珊瑚顶端所有组织，收集冲洗液；珊瑚骨骼干燥备用；

c.将步骤b得到的冲洗液离心，去除上清液，保留沉淀B₁；

d.往沉淀B₁中加入去离子水，然后进行超声破碎，离心，分离上清液A₁和沉淀B₂；

e.往沉淀B₂中加入去离子水，离心，分离上清液A₂和沉淀B₃；

f.将上清液A₁和上清液A₂合并，离心，分离上清液A₃和沉淀B₄；

g.在显微镜下用血球计数板观察上清液A₃，确认共生虫黄藻细胞与珊瑚组织分离完全；

h.将上清液A₃用预烧过的GF/F滤膜抽滤、吸干，并用已灼烧过的铝箔包裹，置于低温冷冻干燥器过夜干燥12-24h，得到珊瑚组织预处理样品，然后储存在-80℃冰箱备用；

i.往沉淀B₄中加入去离子水，离心，保留沉淀B₅；

j.往沉淀B₅中加入盐酸振荡混匀去除碳酸盐，离心，保留沉淀B₆；

k.往沉淀B₆中加入适量去离子水，抽滤，然后包裹在已灼烧过的铝箔中，置于低温冷冻干燥器过夜干燥12-24h，得到共生虫黄藻预处理样品，然后储存在-80℃冰箱备用；

所述的步骤c中离心转速为4000r/min，离心时间为5min；

所述的步骤d中超声破碎形式设置为破碎3s、停3s，破碎总时间为10min；所述的步骤d中离心转速为400r/min，离心时间为5min；

所述的步骤e中离心转速为4000r/min，离心时间为5min；

所述的步骤f中离心转速为4000r/min，离心时间为30min；

所述的步骤i中离心转速为4000r/min，离心时间为5min；

所述的步骤j中离心转速为4000r/min，离心时间为5min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中的灼烧是450℃灼烧至少2h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中珊瑚骨骼干燥是在烘箱60℃烘24h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤j的盐酸为分析纯盐酸。

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