CN107385108B - 莲藕中一种新马铃薯y病毒科病毒的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

莲藕中一种新马铃薯y病毒科病毒的检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒，包括两条特异性引物，所述试剂盒还包括M‑MLV反转录酶、M‑MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。本发明还提供一种莲藕中新马铃薯Y病毒科病毒的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品总RNA，(2)设计并合成引物，(3)RT‑PCR，(4)电泳检测。本发明提供了一种在莲藕中检测新马铃薯Y病毒科病毒的试剂盒与检测方法，利用RT‑PCR方法检测莲藕中该新型马铃薯Y病毒科病毒，克服了分离莲藕病毒核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵敏性和可重复性，为莲藕中该新型马铃薯Y病毒科病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。

Description

莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒与检测方法。
背景技术
莲藕(Nelumbo nucifera)是睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，原产中国和印度，有三千多年的栽培历史，生产上可分为藕莲、籽莲和花莲。莲藕富含淀粉、蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分，是我国南方地区的主要水生蔬菜，其栽培面积近33.3万hm2。
本研究室前期研究中发现僵藕中含有马铃薯Y病毒科病毒的典型风轮状内含体结构，这表明莲藕存在某种马铃薯Y病毒侵染。2016年，我们提取莲藕叶片小RNA，进行高通量测序，经BLAST比对发现，部分contig与马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirius)的甘薯潜隐病毒(Sweetpotato latent virus,SPLV)有低于77％相似性，由于其相似性较低，依据Adams等(2005)提出的马铃薯Y病毒科种类划分标准(不同蛋白编码区核苷酸相似性低于74-78％)，应属于一种新的病毒。该病毒由于缺乏完整的基因组序列，不能制备抗血清，无法利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测；不清楚寄主范围，尚无法确定鉴别寄主。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒与检测方法。
技术方案：本发明所述的莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒，包括两条特异性引物：
SPLVF2-1：5’-GAATCGTATCAATCCTTGAG-3’；
SPLVR3-1：5’-GCTTCTGCGACATCACTAAAG-3’。
进一步的，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
进一步的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供一种莲藕中新马铃薯Y病毒科病毒的检测方法，其包括以下步骤：
(1)提取待测样品总RNA；
(2)设计并合成引物；
(3)RT-PCR
①反转录合成cDNA，以莲藕总RNA为模板，以SPLVR3-1引物，通过反转录酶合成cDNA
②PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVF2-1和SPLVR3-1为引物，进行PCR反应；
(4)电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核酸染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该新型马铃薯Y病毒科病毒的莲藕样品中有895bp的核酸条带。
进一步的，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。
进一步的，所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
有益效果：本发明提供了一种在莲藕中检测新马铃薯Y病毒科病毒的试剂盒与检测方法，利用RT-PCR方法检测莲藕中该新型马铃薯Y病毒科病毒，克服了分离莲藕病毒核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵敏性和可重复性，为莲藕中该新型马铃薯Y病毒科病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。
附图说明
图1是本发明的琼脂糖凝胶电泳检测图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例
(1)引物设计与合成
根据莲藕小RNA高通量测序分析结果，设计并合成该新马铃薯Y病毒科病毒的特异性引物：SPLVF2-1(GAATCGTATCAATCCTTGAG)
和SPLVR3-1(GCTTCTGCGACATCACTAAAG)；
(2)总RNA提取
多糖多酚植物组织裂解法
(3)RT-PCR
①反转录合成cDNA
以莲藕总RNA为模板，以SPLVR3-1引物，通过反转录酶为MLV，合成cDNA，反转录体系为：
Figure BDA0001361828890000031
轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用；
②PCR扩增
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001361828890000032
PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
(4)电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核酸染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，有895bp的核酸条带，为受该新型马铃薯Y病毒科病毒侵染的莲藕样品，无条带为健康植株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.莲藕中一种新马铃薯Y病毒科病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括两条特异性引物：
SPLVF2-1：5’-GAATCGTATCAATCCTTGAG-3’；
SPLVR3-1：5’-GCTTCTGCGACATCACTAAAG-3’；
所述特异性引物SPLVF2-1和SPLVR3-1根据莲藕小RNA高通量测序获得的一种新马铃薯Y病毒科病毒序列设计并合成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
4.一种莲藕中新马铃薯Y病毒科病毒的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）提取待测样品总RNA；
（2）设计并合成引物：根据莲藕小RNA高通量测序分析结果，设计并合成该新马铃薯Y病毒科病毒的特异性引物SPLVF2-1和SPLVR3-1，所述SPLVF2-1的核苷酸序列为：5’-GAATCGTATCAATCCTTGAG-3’，所述SPLVR3-1的核苷酸序列为：5’-GCTTCTGCGACATCACTAAAG-3’；
（3）RT-PCR
①反转录合成cDNA，以莲藕总RNA为模板，以SPLVR3-1引物，通过反转录酶合成cDNA；
②PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVF2-1和SPLVR3-1为引物，进行PCR反应，PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
（4）电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核酸染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该新型马铃薯Y病毒科病毒的莲藕样品中有895bp的核酸条带。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。
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