CN107794311A - 一种在莲藕中检测苹果茎沟病毒的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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贺振
陈春峰
刘娴
李良俊
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Abstract

本发明公开了一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒及检测方法，其包括引物ASGVF4641和ASGVR5784、ASGVF4791和ASGVR5609，M‑MLV反转录酶、M‑MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液。本发明还公开了一种在莲藕中检测苹果茎沟病毒的方法。本发明在分子水平上为莲藕中苹果茎沟病毒的检测提供了一种快速、灵敏、简便的方法，也为莲藕生产中苹果茎沟病毒的防治及其脱毒苗的制备提供了有效方法。

Description

一种在莲藕中检测苹果茎沟病毒的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
莲藕(Nelumbo nucifera)是睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，原产中国和印度，有三千多年的栽培历史，生产上可分为藕莲、籽莲和花莲。莲藕富含淀粉、蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分，是我国南方地区的主要水生蔬菜，其栽培面积近33.3万hm2。
苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)属于乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)发样病毒属(Capillovirus)，是常见的潜隐性植物病毒之一，可通过嫁接、种子、汁液摩擦等方式传播，能够危害蔷薇科、百合科、豆科、茄科、禾本科等多种作物。本研究首次在莲藕中分离得到ASGV的基因组序列，该序列ORF1与已报道的ASGV其他分离物的相似性在78.2-90.7％，属于一种新株系。由于目前ASGV莲藕株系无特异性抗血清，无法利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒及检测方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒，其特征在于包括4条特异性引物。引物具体序列如下：
外引物ASGVF4641：TTAGGTGAGAGGCTTTACAC；
外引物ASGVR5784：TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC；
内引物ASGVF4791：CTATCGTCAACGTCAACC；
内引物ASGVR5609：TTCAATTCTAGCCGAGAG。
优选所述外引物ASGVF4641和ASGVR5784的浓度均为10pmol/μl，所述内引物ASGVF4791和ASGVR5609的浓度均为20pmol/μl。
进一步地，本发明的试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
在另一个方面中，本发明还提供了一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测方法，其利用巢式PCR技术，包括以下步骤：
(1)采用多糖多酚植物组织的裂解法提取待测样品总RNA
(2)设计并合成引物，包括4条特异性引物：
ASGVF4641：5’-TTAGGTGAGAGGCTTTACAC-3’；
ASGVR5784：5’-TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC-3’；
ASGVF4791：5’-CTATCGTCAACGTCAACC-3’；
ASGVR5609：5’-TTCAATTCTAGCCGAGAG-3’；
(3)巢式RT-PCR
①反转录合成cDNA
以莲藕叶片总RNA为模板，以ASGVR5784引物，通过反转录酶为MLV，合成cDNA，反转录体系为：
反应过程为：轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用进行PCR扩增；
②PCR扩增
PCR反应体系如下：
PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共进行20个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
③巢式PCR
将PCR反应产物10倍稀释作为模板，以ASGVF4791和ASGVR5609为引物进行巢式PCR扩增，反应体系如下：
PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
(4)电泳检测
吸取2.5μL巢式PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核酸染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染苹果茎沟病毒的莲藕样品中有836bp的核酸条带。
优选的植物总RNA的提取方法为多糖多酚植物组织的裂解法。
本发明显著优点：
本发明提供了一种在莲藕中苹果茎沟病毒的检测试剂盒及检测方法，利用巢式RT-PCR方法检测莲藕中苹果茎沟病毒，克服了莲藕中病毒含量低，难于检测的问题；且直接提取莲藕总RNA，克服了分离莲藕病毒核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵敏性和可重复性，为莲藕中苹果茎沟病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。
附图说明
图1是RT-PCR检测电泳图。
具体实施方式
下述实施例是为说明本发明而进行的进一步详细描述，不构成对本发明的任何限制：
(1)引物设计与合成
根据已获得苹果茎沟病毒莲藕分离物序列，设计并合成在莲藕中检测苹果茎沟病毒的特异性引物：ASGVF4641(TTAGGTGAGAGGCTTTACAC)和ASGVR5784(TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC)、ASGVF4791(CTATCGTCAACGTCAACC)和ASGVR5609(TTCAATTCTAGCCGAGAG)；
采用PAGE的纯化方式，送上海生工生物工程股份公司进行合成。
(2)总RNA提取
多糖多酚植物组织裂解法
(3)巢式RT-PCR
①反转录合成cDNA
以莲藕叶片总RNA为模板，以ASGVR5784引物，通过反转录酶为MLV，合成cDNA，反转录体系为：
轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用；
②PCR扩增
PCR反应体系如下：
PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共进行20个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
③巢式PCR
将PCR反应产物10倍稀释作为模板，以ASGVF4791和ASGVR5609为引物进行巢式PCR扩增，反应体系如下：
PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
(4)电泳检测
吸取2.5μL巢式PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核酸染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染苹果茎沟病毒的莲藕样品中有836bp的核酸条带。如图1所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，本领域技术人员对之可作一些修改或改进。但是，在不偏离本发明内涵的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种在莲藕中检测苹果茎沟病毒的试剂盒及检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttaggtgaga ggctttacac 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tgcaaagaag aaggtaaagc tc 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ctatcgtcaa cgtcaacc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ttcaattcta gccgagag 18

Claims (4)

1.一种莲藕中检测苹果茎沟病毒的试剂盒，其特征在于，包括4条特异性引物：
ASGVF4641：5’-TTAGGTGAGAGGCTTTACAC-3’；
ASGVR5784：5’-TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC-3’；
ASGVF4791：5’-CTATCGTCAACGTCAACC-3’；
ASGVR5609：5’-TTCAATTCTAGCCGAGAG-3’。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
4. 一种莲藕中苹果茎沟病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用多糖多酚植物组织的裂解法提取待测样品总RNA
（2）设计并合成引物，包括4条特异性引物：
ASGVF4641：5’-TTAGGTGAGAGGCTTTACAC-3’；
ASGVR5784：5’-TGCAAAGAAGAAGGTAAAGCTC-3’；
ASGVF4791：5’-CTATCGTCAACGTCAACC-3’；
ASGVR5609：5’-TTCAATTCTAGCCGAGAG-3’；
（3）巢式RT-PCR
① 反转录合成cDNA
以莲藕叶片总RNA为模板，以ASGVR5784引物，通过反转录酶为MLV，合成cDNA，反转录体系为：模板RNA 600ng，ASGVR5784 0.5 μL，RTase M-MLV 0.5 μL，5×M-MLV Buffer 2μL，dNTP Mixture 2μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，ddH2O至10μL；
反应过程为：混匀，离心后，42℃保温60 min，然后置冰上待用，进行PCR扩增；
②PCR扩增
PCR反应体系如下：cDNA 2μL，2×Taq Mix 10 μL，ASGVF4641 2μL，ASGVR5784 2μL，ddH2O 至10μL；
PCR程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共进行20个循环，72℃延伸7 min，4℃保存；
③巢式PCR
将PCR反应产物10倍稀释作为模板，以ASGVF4791和ASGVR5609为引物进行巢式PCR扩增，反应体系如下：PCR产物稀释液 2μL，2×Taq Mix 10 μL，
ASGVF4791 2μL，ASGVR5609 2μL，加ddH2O至10μL；
PCR程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共进行35个循环，72℃延伸7 min，4℃保存；
（4）电泳检测
吸取2.5 µL巢式PCR产物进行0.8-1.5%的琼脂糖凝胶电泳，经核酸染色，通过凝胶成像仪观察，在感染苹果茎沟病毒的莲藕样品中有836 bp的核酸条带。
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