CN104293975A - 一种苹果病毒检测方法及其使用的检测试剂盒 - Google Patents

一种苹果病毒检测方法及其使用的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物病毒的检测领域，特别涉及一种苹果病毒的检测方法。苹果病毒检测方法以巯基标记的DNA和荧光基团标记的DNA作为探针，二者杂交形成双链DNA，双链DNA探针组装在纳米金颗粒上构建纳米金核酸探针，通过双链取代的方式检测植物病毒并对碱基突变序列进行区分。该发明融合了纳米技术与生物技术，带来领域上的突破。纳米颗粒具有较大的比表面积，可连接多个双链DNA分子，使探针具有极高的灵敏度。纳米颗粒上带有多个特异探针，与病毒核酸保守区域互补杂交，因而对病毒具有较高的特异性，且整个检测步骤简洁，过程中使用的溶液等对人体无害，操作方便，使用安全，检测效率高。

Description

一种苹果病毒检测方法及其使用的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及植物病毒的检测领域，特别涉及一种苹果病毒的检测方法及其使用的检测试剂盒。
背景技术
植物病毒病害难以用化学药剂进行有效的预防或控制，其扩展蔓延速度之快，危害之重，已超过真菌、细菌病害。从根本上讲，防治植物病毒病害发生最有效的方法是传播的预防，而检测是预防的关键。因此，发展一种高效灵敏、快速准确的植物病毒检测方法成为研究的首要问题。
目前植物病毒的检测方法很多，归纳起来主要有两类：酶联免疫吸附反应法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和分子生物学方法，但这两种方法都存在着一些不足之处。ELISA法检测植物病毒时，灵敏度较低，操作手续较为繁琐，而且因蛋白质的热变性容易造成漏检。分子生物学方法中普遍采用PCR法。PCR法是特异性扩增植物病毒中的保守核酸序列从而达到检测的目的，运用PCR技术可使样品DNA中存在的仅有一个拷贝的特定核苷酸片段得到大量扩增，用于植物病毒的鉴定与分类，该法灵敏度高、特异性强、快速简便，当样品病毒含量低，ELISA法难以检出时，此法往往能得到满意的效果。但是该方法容易产生非特异性扩增和假阳性结果，而且电泳中所使用的嗅化乙锭(ethidiumbromide，EB)对操作人员有毒害作用。因此，发展一种安全、价格低廉、方便实用的新型植物病毒检测方法是许多科学家的梦想和目标。
本发明以标记的DNA杂交形成双链，通过双链取代的方式检测植物病毒，从而建立一种价格低廉、对植物病毒具有高灵敏度和高特异性的检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术灵敏度低、操作繁琐、易漏检、易产生非特异性扩增和假阳性结果的缺陷，利用纳米金的超猝灭性、DNA杂交和双链取代的特性，提供一种高灵敏度、高特异性、方便实用、安全的苹果病毒检测方法及其使用的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
苹果病毒检测方法，特殊之处在于以巯基标记的DNA作为捕获探针，以荧光基团标记的DNA作为信号探针，二者杂交形成双链DNA，双链DNA探针组装在纳米金颗粒上构建纳米金核酸探针，通过双链取代的方式检测植物病毒并对碱基突变序列进行区分。
该方法具体包括以下步骤：
(1).以巯基标记的DNA作捕获探针、荧光基团标记的DNA作为信号探针，二者在杂交缓冲液中杂交形成双链DNA溶液；
(2).步骤(1)制得的双链DNA溶液与纳米金溶液混合，双链DNA通过Au-S共价键连接至纳米金表面，制得纳米金核酸探针溶液；
(3).步骤(2)中制得的纳米金核酸探针溶液与检测缓冲液混合，纳米金的终浓度为1-2nmol/L；
(4).将步骤(3)中所得混合液中添加人工合成苹果病毒寡核苷酸或待测苹果样本的RNA提取液，观察荧光现象，完成对苹果病毒的识别。
所述杂交缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH为7.2-7.5，并包括0.135-0.138mol/L的NaCl和2.5-2.8mmol/L的KCl；所述检测缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐溶液，其pH为7.2-7.5，并包括0.05-0.15mol/L的NaCl和0.5-1.5mmol/L的MgCl2。
所述巯基标记的DNA捕获探针和荧光基团标记的DNA信号探针按1︰1.1—1：1.3的浓度比杂交。
所述巯基标记的DNA捕获探针，其巯基标记在3’端，包括21个核苷酸与靶序列互补的识别序列和9个腺嘌呤(A)；所述荧光基团标记的DNA探针，其荧光基团标记在5’端，包括10个核苷酸，与巯基标记的DNA探针的一部分完全互补，且互补碱基的部分从巯基标记的DNA探针的邻近9个连续A的第一个核苷酸开始；所述荧光基团为FAM羧基荧光素或花青染料Cy3。
所述双链DNA溶液与纳米金溶液按照298:1—302:1的浓度比合成纳米金核酸探针溶液，每个纳米金颗粒表面组装40-50个双链DNA分子，其包括30个巯基标记的DNA捕获探针和10个荧光基团标记的DNA信号探针。
所述纳米金核酸探针溶液与检测缓冲液按照1:2的体积比混合。
所述纳米金的粒度为13-15nm，浓度为3nmol/L。
该检测方法所使用的检测试剂盒，其特殊之处在于包括上述方法制备的纳米金核酸探针溶液，盒内还设有检测缓冲液、人工合成苹果病毒寡核苷酸粉末。
所述纳米金苹果病毒核酸探针溶液包括纳米金苹果茎沟病毒核酸探针溶液和纳米金苹果花叶病毒核酸探针溶液。
该发明融合了纳米技术与生物技术，带来领域上的突破。纳米颗粒具有较大的比表面积，可连接多个双链DNA分子，使探针具有极高的灵敏度。纳米颗粒上带有多个特异探针，与病毒核酸保守区域互补杂交，因而对病毒具有较高的特异性，且整个检测步骤简洁，过程中使用的溶液等对人体无害，操作方便，使用安全，检测效率高。具体效果主要体现在以下5个方面。
1、该发明集中了生物学和化学的优势力量，将纳米技术与生物技术相融合，首次将该技术应用在苹果病毒检测上，为植物病害防治开辟新的方向、带来新的突破。
2、纳米颗粒的分散性使其具有较大的比表面积，一个纳米金上可以连接多个双链DNA分子。因此，该探针具有极高的灵敏度，可以检测纳摩尔级的标靶。
3、每个纳米颗粒上都带有多个特异探针，通过探针与病毒核酸高度保守区域互补杂交，使探针具有很高的特异性，甚至对单碱基的差异都能够精确辨别，有效避免以往检测过程中的假阳性问题。
4、本发明苹果病毒检测方法直接将探针与病毒核酸提取液杂交进行检测，整个检测过程时间不超过20分钟，操作简单、检测速度快。
5、由于DNA探针的设计灵活、合成简便，同时纳米金易于修饰，在此平台上可以进一步进行系列产品的开发，且该纳米探针可以扩展到其他植物病毒的检测，并且通过设计多色纳米荧光探针实现多种病毒的同时检测。
附图说明
图1：检测人工合成苹果茎沟病毒寡核苷酸时的荧光光谱图，其中a为不加待检DNA的对照组，b为人工合成完全互补的待检苹果茎沟病毒寡核苷酸序列T1，其检测时浓度为200nmol/L；
图2：检测人工合成苹果花叶病毒寡核苷酸时的荧光光谱图，a为不加待检DNA的对照组，b为人工合成与靶向苹果花叶病毒寡核苷酸发生单碱基错配的序列T3，c为人工合成完全互补的待检苹果花叶病毒寡核苷酸序列T2，T2检测时浓度为200nmol/L；
图3:检测人工合成苹果茎沟病毒寡核苷酸时的线性关系图；
图4：检测人工合成苹果花叶病毒寡核苷酸时的线性关系图；
图5：实际花叶病毒RNA检测图，a为不带病毒阴性植株，b为带病毒阳性植株，其检测浓度为0.00176μg/μL。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的具体实施方式，用来对本发明进行进一步说明。
该发明所使用的实验仪器:
荧光分光光度计(LS-55，美国Perkins Elmer仪器有限公司)，仪器测定条件为：脉冲式氙灯激发，Cy3激发波长为540nm，FAM激发波长为480nm，Cy3荧光光谱的扫描范围为550-700nm，FAM荧光光谱的扫描范围为490-700nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，用宽度为10mm的石英比色皿进行测量。样品体积为300μL；室温。
本发明所采用的13-15nm的纳米金，根据参考文献(K.C.Grabar,R.G.Freeman,M.B.Hommer,M.J.Natan,Anal.Chem.1995,67,735-743.)人工合成，其粒径为13-15nm,浓度为3nmol/L。
杂交缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH为7.2-7.5，并包括0.135-0.138mol/L的NaCl和2.5-2.8mmol/L的KCl。
检测缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐溶液，其pH为7.2-7.5，并包括0.05-0.15mol/L的NaCl和0.5-1.5mmol/L的MgCl2。
本发明实施例中试验用DNA序列如下，由Takara公司合成并经HPLC纯化。所有溶液均用超纯水配制(电阻为18.2MΩ.cm)。
①捕获探针DNA1
5′-CCG TCA GAA GTT CCT TTG CCG(A)9-SH-3′
②信号探针DNA2
5′-FAM-CGG CAA AGG A-3′
③人工合成靶向苹果茎沟病毒寡核苷酸T1
5′-CGG CAA AGG AAC TTC TGA CGG-3′
④捕获探针DNA3
5′-GAAGCCCTTTCGGTCCATCGG(A)9-SH
⑤信号探针DNA4
5'-Cy3-CCGATGGACC-3′
⑥人工合成靶向苹果花叶病毒寡核苷酸T2
5'-CCGATGGACCGAAAGGGCTTC-3'
⑦人工合成与靶向苹果花叶病毒寡核苷酸发生单碱基错配的序列T3
5'-CCGATGGACCCAAAGGGCTTC-3'
上述人工合成序列T1和T2分别为苹果茎沟病毒和花叶病毒保守区序列中的一段，T3是T2的单碱基突变寡核苷酸。
实施例1
一、合成纳米金苹果茎沟病毒核酸探针：
将巯基标记的捕获探针DNA1和荧光基团标记的信号探针DNA2按1︰1.1的浓度比在杂交缓冲液中进行杂交，再将杂交好的双链DNA溶液按照与纳米金溶液298:1的浓度比混合，双链DNA通过Au-S键连接到粒度为14nm、浓度为3nmol/L的纳米金表面，合成纳米金苹果茎沟病毒核酸探针溶液。
二、对待测苹果病毒进行检测
取100μL纳米金茎沟病毒核酸探针溶液并加入200μL已制备的检测缓冲液混合，纳米金的终浓度为1nmol/L，添加人工合成的待检茎沟苹果病毒寡核苷酸T1序列粉末，对其进行检测。由于其含有茎沟苹果病毒，病毒序列长度较长且与巯基标记的DNA1捕获探针完全互补，荧光基团标记的信号探针被取代下来，远离纳米金产生荧光。
检测结果如图1和3所示。由图1可知，T1与DNA1完全互补且长度长于信号探针DNA2，T1的加入能够将信号探针DNA2取代下来，荧光强度增强。由图3可知该发明能够定量检测人工合成的靶向一段苹果茎沟病毒寡核苷酸。
实施例2
一、合成纳米金苹果花叶病毒核酸探针：
将巯基标记的捕获探针DNA3和荧光基团标记的信号探针DNA4按1︰1.2的浓度比在杂交缓冲液中进行杂交，再将杂交好的双链DNA溶液按照与纳米金溶液300:1的浓度比混合，双链DNA通过Au-S键连接到粒度为13nm、浓度为3nmol/L的纳米金表面，合成纳米金苹果花叶病毒核酸探针溶液。
二、对待测苹果病毒进行检测
取100μL纳米金花叶病毒核酸探针溶液并加入200μL已制备的检测缓冲液混合，纳米金终浓度为1nmol/L，添加人工合成的待检花叶苹果病毒寡核苷酸T2序列粉末，并对其进行检测。由于其含有花叶苹果病毒，病毒序列长度较长且与巯基标记的DNA3捕获探针完全互补，荧光基团标记的信号探针被取代下来，远离纳米金产生荧光。
检测结果如图2和4所示。由图2可知，T2与DNA3完全互补且长度长于信号探针DNA4，T2的加入能够将信号探针DNA4取代下来，荧光强度增强。由图4也可进一步说明该发明能够定量检测不同序列的人工合成的靶向寡核苷酸。
实施例3
本实施例的苹果病毒检测方法实施步骤与实施例2基本一致，其区别在于纳米金粒径为15nm，巯基标记的捕获探针DNA3和荧光基团标记的信号探针DNA4按1︰1.3的浓度比在杂交缓冲液中进行杂交，在对待测苹果病毒进行检测时，检测人工合成的待检与靶向苹果花叶病毒寡核苷酸发生单碱基错配的T3序列。待检序列与花叶苹果病毒核苷酸发生单碱基错配、序列长度较长，但其与巯基标记的DNA3捕获探针只能部分互补，荧光基团标记的信号探针只能一小部分被取代下来，绝大部分信号探针靠近纳米金，荧光较小，荧光强度与不加待检DNA对照组的荧光强度接近。
结果如图2所示。由图可知，单碱基突变DNA序列T3只能产生较低的荧光增强，说明该发明探针具有很好的特异性。
实施例4
本实施例的苹果病毒检测方法实施步骤与实施例2基本一致，其区别在于杂交好的双链DNA溶液按照与纳米金溶液302:1的浓度比混合，在对待测苹果病毒进行检测时，检测由PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen,USA)试剂盒提取的花叶病毒阴性植株样本RNA。由于其实际不含花叶苹果病毒，其与巯基标记的DNA3捕获探针无法互补，荧光基团标记的信号探针不能完全被取代下来，信号探针靠近纳米金，荧光被猝灭。
结果如图5a所示。由图可知，对于实际的不带毒阴性植株，荧光强度与不加待检DNA的对照组相当。
实施例5
本实施例的苹果病毒检测方法实施步骤与实施例4基本一致，其区别在于对待测苹果病毒进行检测时，检测由PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen,USA)试剂盒提取的花叶病毒阳性植株样本RNA。由于其含有花叶苹果病毒，且其与巯基标记的DNA3捕获探针能够完全互补，荧光基团标记的信号探针完全被取代下来，远离纳米金产生较强的荧光。
结果如图5b所示。由图可知，对于实际的带毒阳性植株，荧光强度增强。
实施例6
本实施例的苹果病毒检测方法实施步骤与实施例1基本一致，其区别在于纳米金粒径为14nm，巯基标记的捕获探针DNA3和荧光基团标记的信号探针DNA4按1︰1.2的浓度比在杂交缓冲液中进行杂交，在对待测苹果病毒进行检测时，纳米金茎沟病毒核酸探针溶液与检测缓冲液混合后，纳米金的终浓度为2nmol/L，检测人工合成的待检茎沟苹果病毒寡核苷酸T1序列。
由于其含有茎沟苹果病毒，病毒序列长度较长且与巯基标记的DNA1捕获探针完全互补，荧光基团标记的信号探针被取代下来，远离纳米金产生荧光。
实施例7
本实施例的苹果病毒检测方法实施步骤与实施例2基本一致，其区别在于纳米金粒径为15nm，双链DNA溶液按照与纳米金溶液302:1的浓度比混合，在对待测苹果病毒进行检测时，纳米金的终浓度为1.5nmol/L，检测人工合成的待检与靶向苹果花叶病毒寡核苷酸发生单碱基错配的T3序列。
待检序列与花叶苹果病毒核苷酸发生单碱基错配、序列长度较长，但其与巯基标记的DNA3捕获探针只能部分互补，荧光基团标记的信号探针只能一小部分被取代下来，绝大部分信号探针靠近纳米金，荧光较小，荧光强度与不加待检DNA对照组的荧光强度接近。
以上实施例不是穷举，其保护范围不限于所给出的实施例，如纳米探针可以扩展到其他植物病毒的检测，并且通过设计多色纳米荧光探针实现多种病毒的同时检测等，凡是根据本发明的思路所能实现的所有的技术方案，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.苹果病毒检测方法，其特征在于以巯基标记的DNA作为捕获探针，以荧光基团标记的DNA作为信号探针，二者杂交形成双链DNA，双链DNA探针组装在纳米金颗粒上构建纳米金核酸探针，通过双链取代的方式检测植物病毒并对碱基突变序列进行区分。
2.如权利要求1所述的苹果病毒检测方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤：
(1).以巯基标记的DNA作捕获探针、荧光基团标记的DNA作为信号探针，二者在杂交缓冲液中杂交形成双链DNA溶液；
(2).步骤(1)制得的双链DNA溶液与纳米金溶液混合，双链DNA通过Au-S共价键连接至纳米金表面，制得纳米金核酸探针溶液；
(3).步骤(2)中制得的纳米金核酸探针溶液与检测缓冲液混合，纳米金的终浓度为1-2nmol/L；
(4).将步骤(3)中所得混合液中添加人工合成苹果病毒寡核苷酸或待测苹果样本的RNA提取液，观察荧光现象。
3.如权利要求2所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述杂交缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH为7.2-7.5，并包括0.135-0.138mol/L的NaCl和2.5-2.8mmol/L的KCl；所述检测缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐溶液，其pH为7.2-7.5，并包括0.05-0.15mol/L的NaCl和0.5-1.5mmol/L的MgCl2。
4.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述巯基标记的DNA捕获探针和荧光基团标记的DNA信号探针按1︰1.1—1：1.3的浓度比杂交。
5.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述巯基标记的DNA捕获探针，其巯基标记在3’端，包括21个核苷酸与靶序列互补的识别序列和9个腺嘌呤(A)；所述荧光基团标记的DNA探针，其荧光基团标记在5’端，包括10个核苷酸，与巯基标记的DNA探针的一部分完全互补，且互补碱基的部分从巯基标记的DNA探针的邻近9个连续A的第一个核苷酸开始；所述荧光基团为FAM羧基荧光素或花青染料Cy3。
6.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述双链DNA溶液与纳米金溶液按照298:1—302:1的浓度比合成纳米金核酸探针溶液，每个纳米金颗粒表面组装40-50个双链DNA分子，其包括30个巯基标记的DNA捕获探针和10个荧光基团标记的DNA信号探针。
7.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述纳米金核酸探针溶液与检测缓冲液按照1:2的体积比混合。
8.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述纳米金的粒度为13-15nm，浓度为3nmol/L。
9.一种苹果病毒检测方法所使用的检测试剂盒，其特征在于包括上述方法制备的纳米金核酸探针溶液，盒内还设有检测缓冲液、人工合成苹果病毒寡核苷酸粉末。
10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于所述纳米金苹果病毒核酸探针溶液包括纳米金苹果茎沟病毒核酸探针溶液和纳米金苹果花叶病毒核酸探针溶液。
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