CN110241266A - 一种检测苹果茎沟病的rpa引物对、探针及试剂盒和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒的快速检测领域，特别是指一种检测苹果茎沟病的RPA引物对、探针及试剂盒和使用方法。所述RPA引物对序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。所述试剂盒的反应体系包括25μL预混液Buffer A、10μL预混液Buffer B、7.5μL引物及探针预混液Buffer C和2.5μL 10μM醋酸镁。与RT‑PCR、RPA检测方法相比本申请的RPA‑LFD的灵敏度最高为0.3fg·μL^‑1，比RT‑PCR高1000倍，比RPA（琼脂糖凝胶电泳）灵敏度高10倍，三种方法检出率一致性较高，结果可靠。

Description

一种检测苹果茎沟病的RPA引物对、探针及试剂盒和使用方法

技术领域

本发明涉及病毒的快速检测领域，特别是指一种检测苹果茎沟病的RPA引物对、探针及试剂盒和使用方法。

背景技术

苹果病毒病主要分为潜隐性病毒、非潜隐性病毒和类病毒三大类，其中ACLSV、ASPV、ASGV等潜隐性病毒在侵染树体以后，植株并没有明显的表症，不能及时被种植者发现，不仅容易通过机械传播，而且会不断地降低植株的长势，逐渐降低果实的产量和质量，造成显著的经济损害。APMV被认为是主要侵染我国果树的非潜隐性病毒，近两年有研究表明，造成我国花叶病症状的真正病原是APNMV，并非APMV。主要侵染我国苹果的类病毒包括苹果锈果类病毒，是一类没有衣壳蛋白包被的单链RNA分子，不能通过血清学进行检测。

近年来，随着分子病毒学和生物技术的进步，如今主要的检测方法有指示植物法、血清法、聚合酶链式反应、高通量测序技术和等温扩增技术等，目前使用较多的是PCR技术。等温扩增技术，如依赖解旋酶扩增（Helicase-dependent amplification，HDA）、重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）、依赖核酸序列扩增（Nucleicacid sequence-based amplification，NASBA）等，已被证明适用于实验室和资源匮乏的田间检测。其中重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种主要依赖于重组酶、链置换DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白的新型等温核酸扩增检测技术。由于RPA不需要经过热变性，在37至42°C的相对较低的温度下，20 min内即可扩增低至1-10个拷贝的起始样本，不需要严格控制温度，并且有较好的兼容性，因此在田间诊断的开发和应用中有巨大的前景。该技术已被广泛应用于不同的动物、人体、食物病毒检测、动植物基因组研究等，但植物病毒检测的应用较少，在苹果上还未见RPA-LFD相关报道。本研究结合RPA和侧向流动试纸，建立灵敏度高、特异性强、准确快速高效的可视化ASGV检测体系，为田间苹果病毒病的检测提供理论依据，为无病毒苗木生产提供技术支撑。

发明内容

本发明提出一种检测苹果茎沟病的RPA引物对、探针及试剂盒和使用方法，解决了快速、灵敏检测苹果茎沟病的技术难题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种检测苹果茎沟病的RPA引物对和探针，所述RPA引物对序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示，其中SEQ ID NO.2序列的5’端设有生物素标记，探针序列如SEQ ID NO.3所示，探针在5’端用FAM进行荧光标记，30-31bp之间设有dSpacer无碱基位点，3’端用C3Spacer进行磷酸化修饰。

所述试剂盒的反应体系包括25μL预混液Buffer A、10μL预混液Buffer B、引物、7.5μL引物及探针预混液Buffer C和2.5μL 10μM醋酸镁。

所述25μL预混液Buffer A，包括终浓度：4mM的DTT、180mM的乙酸钾、10% 的Carbowax20M、400μM的dNTPs、6mM的ATP、100mM的Tris（pH 8.1）、70 mM的磷酸肌酸，混合均匀以备用。

所述10μL预混液Buffer B，包括终浓度 175ng·μL^-1的Bsu DNA聚合酶、500 ng·μL^-1的肌酸激酶、4μg·μL^-1的gp32蛋白、900 ng·μL^-1的T4 uvsX重组酶、200 ng·μL^-1的T4uvsY重组酶和1μg·μL^-1大肠杆菌核酸内切酶Ⅳ，混合均匀以备用。

所述7.5μL引物及探针预混液Buffer C，包括2.1μL 10μM上引物、2.1μL 10μM下引物、0.6μL 10μM探针和2.7 μL水混合均匀以备用。

所述的检测苹果茎沟病的试剂盒的使用方法，步骤如下：

（1）以待测样品叶片总RNA的反转录产物或以ASGV标准质粒作为模板；

（2）将Buffer A、Buffer B、Buffer C和1μL模板加入200μL离心管中，用水补至47.5μL，混合均匀并离心；

（3）向离心管中加入2.5μL 10μM醋酸镁，先涡旋，再离心；

（4）立即将试管在适当的加热仪器进行RPA-LFD反应，使用试纸条检测并观察结果。

所述步骤（1）中ASGV标准质粒的物质的量浓度为30ng·μL^-1- 0.3fg·μL^-1，总RNA的反转录产物的物质的量浓度为1μg·μL^-1-0. 1ng·μL^-1。

所述步骤（4）中RPA-LFD反应的反应温度为37℃、反应时间为20min。

所述步骤（4）试纸条检测的步骤为：取2μL RPA反应产物与98μL含0.1％Tween的PBS混合均匀，然后均匀涂于试纸条取样点，静置于200μL含0.1％Tween的PBS缓冲液中，2-5min后，观察结果。

所述的检测苹果茎沟病的试剂盒的使用方法的最低检测灵敏度为0.3fg·μL^-1。

本发明具有以下有益效果：

（1）与RT-PCR、RPA检测方法相比本申请的RPA-LFD的灵敏度最高为0.3fg·μL^-1，比RT-PCR高1000倍，比RPA（琼脂糖凝胶电泳）灵敏度高10倍，三种方法检出率一致性较高，结果可靠；因为 PCR 等其他检测方法在检测过程中，受到引物二聚体等外界因素影响，引物很容易发生交叉反应，产生假阳性结果；而我们在反向引物在5'末端携带Biotin抗原标记，探针在5'末端用FAM进行荧光标记、3'末端用C3Spacer进行磷酸化修饰；另外，探针在5'末端下游30nt处含有dSpacer无碱基位点，这样一来，只有当检测探针完全结合ASGV序列时，核酸酶才能在dspacer位点切断并释C3Spacer阻断基团；随后聚合酶延伸底物，并且持续扩增链置换产生的双标记扩增子，生成可被试纸条检测到的产物，因此，确保了试验结果的准确性。

（2）本申请发明人对51份田间样品进行RPA-LFD和RT-PCR检测，结果表明，RPA-LFD检测出ASGV的样品数为33，RT-PCR检测出ASGV的样品数为31，两种检测体系阳性检出率的一致率在96.08% -100%之间（图4）。因此，本研究建立ASGV的RPA-LFD检测体系，结果准确，可用于检测病毒含量低的苹果脱毒苗的快速检测及鉴定。

（3）在比较RT-PCR、RPA-LFD检测ASGV结果时，为了避免假阳性的出现，不仅设置灭菌水、已确认过的无毒材料两种阴性对照，并将检测结果不一致的RPA产物送去测序；Blast比对分析得知，其与印度李分离物（登陆号：HE978837.1）序列相似度最高，为99.26%；证明这个检测结果的差异，是由于RT-PCR检测的灵敏度低于RPA-LFD所造成的；在扩增产物检测方面，最方便快捷的是RPA-LFD，在5 min内即可观测结果，并且该过程不需要其他仪器。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RPA-LFD反应温度和时间选择图；其中A:1-7：1 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min及30 min；N：阴性对照；B：1-11：15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、39℃、42℃、45℃、50℃及55℃；N：阴性对照。

图2为苹果茎沟病毒RT-PCR、RPA（琼脂糖凝胶电泳）和RPA-LFD灵敏度试验（图A-C）；A：RT-PCR；B：RPA（琼脂糖凝胶电泳）；C：RPA-LFD；1-10：30 ng·μL^-1-0.3fg·μL^-1（质粒）；N：阴性对照；M：500 Marker。

图3为苹果茎沟病毒RPA和RT-PCR特异性试验（A-B）；图A：RT-PCR；图B：RPA-LFD；M：500 DNA marker；N：阴性对照；1-11：田间样品。

图4为河南省三个苹果产区ASGV RT-PCR、RPA-LFD检测结果（A-E）；M：Marker；N：阴性对照；1-51：田间样本。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种检测苹果茎沟病的RPA-LFD试剂盒的使用方法，步骤如下：

一、试验材料：

2018年5-8月，从郑州、三门峡和洛宁采集了51份苹果叶片，其中有症状叶片33份，无明显症状叶片18份。采集样品时标好品种、株系、有无表症以及时间地点等基本信息，带回实验室，迅速用液氮冷冻，-80℃冰箱保存备用（表1）。

二、实验方法

2.1 设计ASGV的RPA引物对和探针序列，所述RPA引物对序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示，其中SEQ ID NO.2序列的5’端设有生物素标记，探针序列如SEQ ID NO.3所示，探针在5’端用FAM进行荧光标记，30-31bp之间设有dSpacer无碱基位点，3’端用C3Spacer进行磷酸化修饰；

2.2 反应步骤如下：

（1）制备预混液Buffer A（25μL），终浓度：4mM的DTT、180mM的乙酸钾、10% 的Carbowax20M、400μM的dNTPs、6mM的ATP、100mM的Tris（pH 8.1）、70 mM的磷酸肌酸，混合均匀以备用；

（2）制备酶预混液Buffer B（10μL），终浓度：175ng·μL^-1的Bsu DNA聚合酶、500 ng·μL^-1的肌酸激酶、4μg·μL^-1的gp32蛋白、900 ng·μL^-1的T4 uvsX重组酶、200 ng·μL^-1的T4uvsY重组酶和1μg·μL^-1大肠杆菌核酸内切酶Ⅳ，混合均匀以备用；

（3）制备引物及探针预混液Buffer C（7.5μL）：将2.1μL 10μM上引物、2.1μL 10μM下引物、0.6μL 10μM探针和2.7 μL水混合均匀以备用；

（4）将Buffer A、Buffer B、Buffer C和1μL的模板（1μL 30ng·μL^-1- 0.3fg·μL^-1ASGV质粒或1μL 1μg·μL^-1-0. 1ng·μL^-1总RNA反转录产物）加入200μL离心管中，用水补至47.5μL，混合均匀并离心；

（5）在反应管的盖子上加入2.5μL 10μM醋酸镁，先涡旋，再离心；

（6）立即将试管在适当的加热仪器中37℃，温育20 min，反应4 min时，取出管，上下用力颠倒8次，离心，放入仪器中温育16min。

2.3 RPA-LFD扩增产物可视化观测

（1）取2μL反应产物与98μL含0.1％Tween的PBS混合均匀；

（2）取10μL上步稀释产物均匀涂于试纸条取样点；

（3）静置于200μL含0.1％Tween的PBS缓冲液中，2-5 min，观察结果。

2.4 反应温度的筛选：体系的反应温度分别设定为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、39℃、42℃、45℃、50℃和55 ℃共11个不同的反应温度，重复试验，确定最佳的反应温度。当RPA-LFD反应温度为30℃时，试纸条可肉眼观测到条带；30-45℃时，扩增效果无明显差异；25℃以下以及50℃以上，无可观测扩增（图1，B）。综合考虑，将37℃作为最佳反应温度。

2.5 反应时间的筛选：分别以4种病毒标准质粒（0.3pg·μL^-1）为模板进行扩增。反应时间分别设定为1 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min及30 min，重复试验，确定最佳的反应时间。反应时间为20-30min时，扩增效果较好，且无明显差异（图1，A）。因此，将20min作为最适宜的反应时间。

对比例1

一种检测苹果茎沟病的RPA方法，步骤如下：

一、以苹果茎沟病毒标准质粒（0.3pg·μL^-1）为模板进行RPA扩增，体系的反应温度分别设定为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、39℃、42℃、45℃、50℃和55 ℃共11个不同的反应温度，重复试验，确定最佳的反应温度。

其它步骤参照实施例1。

二、RPA琼脂糖凝胶电泳观测扩增产物

①RPA扩增产物纯化后，2%琼脂糖凝胶电泳观测结果。纯化方法参照普通DNA产物纯化试剂盒（DP204，天根）

②向吸附柱中加入500μLBL，14000g，离心1 min，弃废液；

③向RPA扩增产物中加入250μLPB，充分混匀后加入吸附柱中；

④室温放置2 min，14000g，离心1min，弃废液；

⑤加入600μLPW（含无水乙醇），静置3min，14000g，离心1min，弃废液，重复该步一次；

⑥15000g，空离2 min，并室温静置3 min；

⑦将柱子装在灭菌的1.5ml离心管上，加入30μL EB，静置3min，14000g，离心1min；

⑧2%的琼脂糖凝胶电泳观察RPA纯化产物条带。

对比例2

一种检测苹果茎沟病的RT-PCR方法，步骤如下：

RT-PCR反应体系（25μL）：2×Premix Taq™12.5μL，10μmol·L^-1上（下）引物1μL（见实施例1）、模板1μL（与实施例1相同）、灭菌水9.5μL，混匀并离心。

反应程序为94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃1min，循环32次；72℃10min；4℃终止反应。

应用效果例

一、灵敏度试验

以质粒为模板，以30 ng·μL^-1为初始浓度，以10为倍数依次进行稀释，同时设置阴性对照，分别进行RPA（琼脂糖凝胶电泳）、RPA-LFD和RT-PCR扩增检测，RPA琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果；RPA-LFD的扩增产物经稀释后，静置于含有0.1%Tween的PBS缓冲液中2-5 min，观察扩增结果。

RT-PCR的灵敏度300fg·μL^-1；RPA-LFD和RPA（琼脂糖凝胶电泳）的灵敏度分别为0.3fg·μL^-1和3fg·μL^-1；RPA-LFD的灵敏度最高，其次是RPA（琼脂糖凝胶电泳），最低的是RT-PCR（图2）。RPA-LFD灵敏度比RT-PCR高1000倍，比RPA（琼脂糖凝胶电泳）灵敏度高10倍，三种方法检出率一致性较高，结果可靠。

二、特异性试验

由10个田间样品的RPA-LFD和RT-PCR的检测结果可以发现，RT-PCR 检测出感染ASGV的样品数为5，RPA-LFD检出数为6，两种检测体系的检测结果一致性较高，说明RPA的特异性较好，检测结果可靠（图3）。

三、序列分析

将纯化产物连接载体后，转化、提质粒，测序并与已知的序列进行BLAST。ASGV与德国苹果分离物AC（登陆号：JX080201.1）序列相似度最高，为98.17%，说明所建立的RPA-LFD检测体系可准确检测ASGV。

四、用于大田检测

对51份田间样品进行RPA-LFD和RT-PCR检测（1μL 1μg·μL^-1总RNA反转录产物），结果表明，RPA-LFD检测出ASGV的样品数为33，RT-PCR检测出ASGV的样品数为31，两种检测体系阳性检出率的一致率在96.08% -100%之间（图4）。因此，本研究建立ASGV的RPA-LFD检测体系，结果准确，可用于检测病毒含量低的苹果脱毒苗的快速检测及鉴定。

五、结论

我国是苹果生产大国，但病毒病的发生大大限制了苹果的质量和产量。准确地检测和诊断病毒病是苹果病害管理的重要步骤，因此，开发一种快速灵敏高效的诊断方法，在购买种植材料前就判断是否携带病毒，对于控制、降低植物病毒造成的损失是至关重要的。

目前对于苹果病毒病检测的研究进展主要集中于聚合酶链式但应和免疫学的一些方法。虽然PCR和RT-PCR被广泛用于植物病毒检测，但进行分析所需的成本和时间仍然很高，这可能制约植物病毒检测的发展。自2006年首次报告RPA以来，由于其操作简单，灵敏度高，选择性多，兼容性高，扩增速度快以及在较低的恒定温度下即可完成操作等优点，使越来越多的人关注RPA技术的应用。与其他等温扩增技术相比，RPA不需要热变性步骤，即使存在一些已知的PCR抑制剂或粗提物，也可在不到20 min内扩增低至1-10个目标拷贝，使得其在病毒检测上有显著的优点。通过温度梯度、反应时间梯度以及模板浓度等方面的优化，建立了特异性强，灵敏度高的ASGV快速检测体系。在反应时间上，RPA比RT-PCR缩短了1个小时；在灵敏度上，RPA-LFD分别比普通的RT-PCR高10³倍；在反应温度上，RPA是酶促变性，37℃即可很好的进行扩增，RT-PCR必须经过热变性，需要精密的热循环仪，这也使得RT-PCR难以在大田使用。

在比较RT-PCR、RPA-LFD检测ASGV结果时，为了避免假阳性的出现，不仅设置灭菌水、已确认过的无毒材料两种阴性对照，并将检测结果不一致的RPA产物送去测序。Blast比对分析得知，其与印度李分离物（登陆号：HE978837.1）序列相似度最高，为99.26%。证明这个检测结果的差异，是由于RT-PCR检测的灵敏度低于RPA-LFD所造成的。在扩增产物检测方面，最方便快捷的是RPA-LFD，在5 min内即可观测结果，并且该过程不需要其他仪器。

大多数植物病毒诊断都基于血清学和PCR，农民和种植者必须将他们的样品运送到相对专业的机构，且该检测需要高质量和数量的核酸的模板。而在运输样品过程中，往往会降低样品到达时的质量，而有效的核酸提取技术不仅会提高检测成本，提取回收过程中使用的化合物可能会干扰PCR和RT-PCR。但RPA不需要高质量的模板，也不需要专业人员操作。如上所述，RPA有可能在大田现场进行病毒检测，有助于及时根除感病植株，从而最大限度地降低病毒传播相关的风险。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南农业大学

<120> 一种检测苹果茎沟病的RPA引物对、探针及试剂盒和使用方法

<160> 3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 病毒属 (Virus)

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（30）

<400> 1

tttgccactg gtctgaaaat gaatcgtcta 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 病毒属 (Virus)

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（30）

<400> 2

ggcatgtcaa cctgcaagac cgcgaccaag 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> 46

<223> n= dSpacer

<400> 3

ggaaagtaac ctggaactgg agggttagga ntcgtgtgaa attccg 46

Claims (10)

1.一种检测苹果茎沟病的RPA引物对和探针，其特征在于：所述RPA引物对序列如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2所示，其中SEQ ID NO.2序列的5’端设有生物素标记，探针序列如SEQID NO.3所示，探针在5’端用FAM进行荧光标记，30-31bp之间设有dSpacer无碱基位点，3’端用C3Spacer进行磷酸化修饰。

2.利用权利要求1所述的RPA引物对和探针检测苹果茎沟病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系包括25μL预混液Buffer A、10μL预混液Buffer B、7.5μL引物及探针预混液Buffer C和2.5μL 10μM醋酸镁。

3.根据权利要求2所述的RPA引物对和探针检测苹果茎沟病的试剂盒，其特征在于：所述25μL预混液Buffer A，包括终浓度：4mM的DTT、180mM的乙酸钾、10% 的Carbowax20M、400μM的dNTPs、6mM的ATP、100mM pH为 8.1 的Tris、70 mM的磷酸肌酸，混合均匀以备用。

4.根据权利要求2所述的RPA引物对和探针检测苹果茎沟病的试剂盒，其特征在于：所述10μL预混液Buffer B，包括终浓度 175ng·μL^-1的Bsu DNA聚合酶、500 ng·μL^-1的肌酸激酶、4μg·μL^-1的gp32蛋白、900 ng·μL^-1的T4 uvsX重组酶、200 ng·μL^-1的T4 uvsY重组酶和1μg·μL^-1大肠杆菌核酸内切酶Ⅳ，混合均匀以备用。

5.根据权利要求2所述的RPA引物对和探针检测苹果茎沟病的试剂盒，其特征在于：所述7.5μL引物及探针预混液Buffer C，包括2.1μL 10μM上引物、2.1μL 10μM下引物、0.6μL10μM探针和2.7 μL水混合均匀以备用。

6.权利要求1-5任一项所述的检测苹果茎沟病的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：

（1）以待测样品叶片总RNA的反转录产物或以ASGV标准质粒作为模板；

（2）将Buffer A、Buffer B、Buffer C和1μL模板加入200μL离心管中，用水补至47.5μL，混合均匀并离心；

（3）向离心管中加入2.5μL 10μM醋酸镁，先涡旋，再离心；

（4）立即将试管在适当的加热仪器进行RPA-LFD反应，使用试纸条检测并观察结果。

7.根据权利要求6所述的检测苹果茎沟病的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤（1）中ASGV标准质粒的物质的量浓度为30ng·μL^-1- 0.3fg·μL^-1，总RNA的反转录产物的物质的量浓度为1μg·μL^-1-0. 1ng·μL^-1。

8.根据权利要求6所述的检测苹果茎沟病的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤（4）中RPA-LFD反应的反应温度为37℃、反应时间为20min。

9.根据权利要求6所述的检测苹果茎沟病的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤（4）试纸条检测的步骤为：取2μL RPA反应产物与98μL含0.1％Tween的PBS混合均匀，然后均匀涂于试纸条取样点，静置于200μL含0.1％Tween的PBS缓冲液中，2-5 min后，观察结果。

10.权利要求7-8任一项所述的检测苹果茎沟病的试剂盒的使用方法的最低检测灵敏度为0.3fg·μL^-1。