CN111440892A - 一种与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记及应用，利用本发明中的分子标记引物，可在幼苗期时对柱型与普通型苹果的杂交群体后代中进行分子标记的辅助选择，能够有效的克服1～2年生的柱状苹果杂交群体后代中柱状苹果树与普通型苹果树在幼苗期形态学不易鉴定的缺点，并且这种方法快速，简单，准确，可以在一定程度上提高育种效率，加速育种工作的进程。

Description

一种与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
柱状树形是苹果育种上可利用的一个优良性状，具有这种优良性状的苹果称为柱状苹果，其具有特异的生长习性，主要表现为节间短，短枝多，侧枝少，植株整体呈自然单干形，这既不同于普通型，也不同于短枝型和矮化型，而这种树形紧凑且修剪量小的植株非常适合高度密植和机械化管理。但在育种实践中，柱状苹果树与普通型苹果树在幼苗期时不易区分，实生苹果苗栽植后需要2～3年的时间才能从形态学上区分，一般费时费力。利用遗传标记进行辅助选择可以极大的提高选择效率，减少育种过程时间和成本以及育种过程中的盲目性。
公开号为CN106191276A的中国专利公开了一种利用分子标记快速区分柱状苹果苗木的方法，该专利以两对寡聚脱氧核糖核普酸序列作为引物对，同时对与柱状基因相连锁的分子标记进行扩增，对引物的扩增产物电泳结果中至少有一对引物有所述分子标记对应的特异条带的，则说明对应的苹果苗木为柱状苹果；两对引物的扩增产物电泳结果均无对应的特异条带的，则为普通型苹果。在此基础上，发明人进一步进行研究，发现与苹果柱状树形基因相连锁的分子标记不止上述两个，发明人还发现了其它与之相关的分子标记，更加有利于柱状树形苹果分子标记辅助育种体系的建立，为柱状苹果的育种分子学育种打下基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记及引物对。
本发明的目的之二在于提供上述与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记的应用。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
本发明公开了一种与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记C6536-31519引物对的脱氧核糖核苷酸序列为：
C6536-31519-F：TGGATGGTGGGATTTCTTGT
C6536-31519-R：AAGGAAACCACATTGCCAAA。
本发明还公开了上述分子标记的检测方法，利用分子标记C6536-31519引物对以被检测苹果基因组DNA为模板进行扩增，如果能扩增出如Seq ID No.1所示的196bp DNA片段，即可判断为该苹果为柱状苹果。具有果柱状树型的苹果包括但不限于以下品种：润太一号’、‘舞佳’、‘舞姿’和‘舞美’。
本发明还公开了上述分子标记引物对在苹果柱状树型辅助育种中的用途。也就是说本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选柱状苹果。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。
本发明还保护含有上述分子标记C6536-31519引物对的鉴定柱型苹果的试剂盒，该试剂盒可以用于对品种的检测。
另外，上述分子标记还可以对苹果柱状树形相关的基因进行定位或检测。这些应用均可以按照常规的方法进行。
本发明具有如下优点：
本发明在已经公开的柱状苹果分子标记基础上，又发现了新的分子标记，更加有利于柱状树形苹果分子标记辅助育种体系的建立，为柱状苹果的育种分子学育种打下基础。
利用本发明中的分子标记引物，可在幼苗期时在柱型与普通型苹果的杂交群体后代中进行分子标记的辅助选择，避免了在幼苗期时形态学不易鉴定的缺点，本发明的分子标记能够有效的克服1～2年生的柱状苹果杂交群体后代中柱状苹果树与普通型苹果树在幼苗期不易区分的缺点，并且这种方法快速，简单，准确，可以在一定程度上提高育种效率，加速育种工作的进程。
本发明的分子标记具有检测方便、扩增产物稳定、特异性高的特点，可以简便、快速、高通量地应用于苹果育种实践及品种鉴定。
附图说明
图1是特异性SSR分子标记C6536-31519在普通型和柱状苹果品种中的扩增产物凝胶电泳图：
图中，M为500bp DNA Marker，泳道1为柱状苹果‘润太一号’，泳道2为柱状苹果‘舞佳’，泳道3为普通型苹果‘富士’，泳道4为普通型苹果‘九月奇迹’，泳道5为普通型苹果‘华硕’，泳道6为普通型苹果‘福布拉斯’，泳道7为普通型苹果‘蜜脆’，泳道8为柱状苹果‘舞姿’，泳道9为柱状苹果‘舞美’。
图2是特异性SSR分子标记C6536-31519在‘润太一号’与‘蜜脆’的杂交群体后代的扩增产物凝胶电泳图：
图中，M为500bp DNA Marker，11、13、16～21、23、25、27泳道为柱型苹果。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明所选用的柱状苹果‘润太一号’、‘舞佳’、‘舞美’、‘舞姿’，普通型苹果‘富士’、‘九月奇迹’、‘华硕’、‘福布拉斯’、‘蜜脆’，以上生物材料在申请人单位的实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验或者公众也可以通过购买的方式获取。
实施实例1分子标记的开发及其特异性引物设计
本发明的发明人前期利用柱状苹果(蜜脆、金冠、嘎拉)和非柱状苹果(舞佳)作为亲本，构建了3个杂交群体，共2215个单株，筛选出了与柱状基因连锁的若干分子标记，已将柱状基因定位到第10条染色体1647023262和C562932009之间。利用已公布的苹果和桃的基因组序(http：//www.rosaceae.org)，对定位区间内的核苷酸序列进行分析，并筛选SSR(8个以上的两个核苷酸重复或6个以上三个核苷酸重复)，使用primer 5.0软件设计如下引物：
上游引物C6536-31519-F：TGGATGGTGGGATTTCTTGT，
下游引物C6536-31519-R：AAGGAAACCACATTGCCAAA。利用该引物对待测样本进行PCR扩增，结果发现，柱状苹果样品的PCR产物有196bp条带，经测序其序列如序列表中SEQID NO.1所示，而普通型苹果的样品没有这条带。
实施例2利用特异性SSR分子标记C6536-31519对苹果品种中的柱状表型的验证
以柱状苹果‘润太一号’、‘舞佳’、‘舞美’、‘舞姿’，普通型苹果‘富士’、‘九月奇迹’、‘华硕’、‘福布拉斯’、‘蜜脆’，为材料，利用本发明中的SSR分子标记C6536-31519，进行苹果柱形性状的鉴定，具体步骤如下：
一、苹果基因组DNA提取
1、取2ml离心管，放入0.1g已经用液氮研磨好的苹果叶片，并加入800μL的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液和20μLβ-巯基乙醇，混匀后放入65℃的水浴锅中水浴60min，每20min将样品从水浴锅中取出，轻轻的上下颠倒5min；
2、从水浴锅中取出后加入等体积的24：1(氯仿：异戊醇)，轻轻地上下颠倒5min混匀，常温离心12000rpm 15min，抽取上清液转至新的离心管中；
3、重复步骤2，直至离心管中的有机相和水相的像交界处的白色杂质消失为止；
4、抽取大约500μL的上清液至新的离心管中，并加入提前预冷好的2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠，混匀，放置在-20℃中静置20min；
5、从-20℃中取出后，12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL70％的乙醇清洗沉淀一次，12000rpm离心5min，弃上清，加入500μL无水乙醇再洗涤一次，12000rpm离心5min，倒掉无水乙醇，并在通风橱中晾干乙醇；
6、加入约100μL的TE和0.5μL的RNase混匀，在37℃水浴锅中水浴30min；取5μL的DNA利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及质量。
二、PCR扩增
将检测过的苹果基因组DNA作为模板，利用引物对C6536-31519进行PCR扩增。
PCR反应采用10μL体系：
Figure BDA0002528104040000061
PCR反应程序：
1)94℃2min
2)94℃30sec
3)52℃30sec
4)72℃30sec
重复2)到4)35个循环
5)72℃5min
三、对扩增产物进行电泳检测
PCR反应结束后，将产物进行8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，检查不同待测样品DNAPCR反应中产生的DNA条带。其中，所述引物对C6536-31519的脱氧核糖核苷酸序列为：
上游引物C6536-31519-F TGGATGGTGGGATTTCTTGT
下游引物C6536-31519-R AAGGAAACCACATTGCCAAA
琼脂糖凝胶电泳结果见图1。鉴定结果显示，9份苹果品种资源的表型与电泳结果的条带类型相符合，准确性100％。因此本发明的SSR分子标记可用来鉴定苹果柱形性状。
实施实例3利用特异性SSR分子标记C6536-31519对‘润太一号’与‘蜜脆’的杂交群体后代进行柱状树形鉴定
以柱状苹果‘润太一号’和普通型苹果‘蜜脆’的杂交后代为材料，使用本发明中的SSR分子标记C6536-31519，采用实施实例1中的方法，进行苹果柱形性状的鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果见图2。鉴定结果显示，杂交后代中，有11份柱状树形苹果树。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记及应用
<130> 2020
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 196
<212> DNA
<213> Malus pumila Mill.
<400> 1
tggatggtgg gatttcttgt ttttggagaa ctggtacctt caaaatacgg taaaattgtt 60
tgctaactgt tacaaagttt tttagagaga gagagagaga gagagagaga aagaaagaga 120
ggggagggaa gagagtgtct ggtctctttt agttgacatc catcaatcta aattcatttg 180
gcaatgtggt ttcctt 196

Claims (6)

1.一种与苹果柱状树形基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记C6536-31519的引物对序列为：
C6536-31519-F：TGGATGGTGGGATTTCTTGT；
C6536-31519-R：AAGGAAACCACATTGCCAAA。
2.权利要求1所述的分子标记的在鉴定苹果柱状树形性状中的应用，其特征在于，利用分子标记C6536-31519的引物对以被检测苹果DNA为模板进行PCR扩增，如果能扩增出如SEQID NO.1所示的196bp的条带，则该苹果植株为柱状树形。
3.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的分子标记引物对在苹果柱状树型辅助育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具有柱状树形的苹果包括以下品种：润太一号’、‘舞佳’、‘舞姿’和‘舞美’。
5.一种鉴定苹果柱状树形的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述分子标记C6536-31519的引物对。
6.权利要求1所述的分子标记在与苹果柱状树形相关的基因定位中的应用。
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