CN114196787A - 一种中国南瓜曲叶病毒rpa-lfd快速可视化检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种中国南瓜曲叶病毒rpa-lfd快速可视化检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中国南瓜曲叶病毒RPA‑LFD快速可视化检测试剂盒及其应用，涉及基因工程技术领域，包含如下引物组和RPA‑LFD检测试纸条：所述的引物组的核苷酸序列如下所示：SLCCV‑444‑F：5'‑CCTATGTTTCCCGTGCAGTTGTCCCCATTG‑3'，Bio‑SLCCV‑444‑R：5'‑Biotin‑CACGATGCATGTTCTTCACCGTTGCAGTGC‑3'。本研究建立的RPA‑LFD方法适用于南瓜样品中SLCCV的快速检测，RPA‑LFD检测体系操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强，不依赖多种实验设备，可应用于现场诊断，LFD检测结果可通过肉眼直接观察。

Description

一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒及其应用。
背景技术
中国南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl China virus，SLCCV)是一种植物单链DNA病毒，属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，吴会杰、彭斌、康保珊，等著作的《中国南瓜曲叶病毒编码的AC5基因功能分析》中指出，该病毒在自然条件下可以侵染多种葫芦科作物，如南瓜、甜瓜等，该病毒由烟粉虱进行持久性传播，被侵染后的植株表现为矮化、叶片皱缩卷曲，严重影响果实的产量和品质。温室内南瓜产区病毒病发生十分严重，并出现烟粉虱等传毒介体，受病毒病侵染的南瓜叶片表现为褪绿黄化、皱缩、畸形、坏死，并且植株矮化，不结果实。典型症状如图1所示。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合，以代替传统PCR热循环中的变性和复性过程的新型恒温体外核酸扩增技术，与利用胶体金免疫层析原理检测的侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，LFD)结合应用，实现可视化检测。现有的对SLCCV检测的方法有PCR等，未见RPA-LFD快速检测方法。因此，提出一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒及其应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒及其应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒，包含如下引物组和RPA-LFD检测试纸条：
所述的引物组的核苷酸序列如下所示：
SLCCV-444-F：5'-CCTATGTTTCCCGTGCAGTTGTCCCCATTG-3'，
Bio-SLCCV-444-R：5'-Biotin-CACGATGCATGTTCTTCACCGTTGCAGTGC-3'；能够有效且特异的扩增出中国南瓜曲叶病毒的外壳蛋白片段；
探针Nfo-probe-SLCCV：
FAM-TATGGATGGATGAAAATATCAAGACTAAAAAT(THF)CATACTAATAGTGTCAT-C3-Spacer。
进一步改进在于，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。
本发明还提供了一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒在检测中国南瓜曲叶病毒中的应用。
进一步改进在于，RPA反应试剂包括以下成分：A buffer、B buffer、上游引物、下游引物、探针、ddH2O和醋酸镁。
进一步改进在于，在反应前，将除DNA模板、B buffer和醋酸镁之外的试剂预混形成预混液，所述预混液中包括A buffer 29.4μl，上游引物2μl，下游引物μl，探针0.6μl，ddH2O11.5μl，待进行试验时再加入1-2μlDNA模板、2.5μl醋酸镁、2.5μlB buffer，反应即可开始。
进一步改进在于，包含以下步骤：
(1)对待测南瓜样本提取植物基因组DNA或者直接提取待测样本的破碎种子或汁液作为模板；
(2)采用预混液对待测样本进行重组酶聚合酶扩增，反应条件为39℃、18min，由此得到带有修饰标记的扩增产物；
(3)将待测样品进行RPA反应后的扩增产物用无菌水稀释20倍后，将侧流层析试纸条插入该反应液中，待3-5min后观察。
(4)结果判读：若试纸条上显示两条带，上面条带代表控制线，下面条带代表检测线，表明该样本含有中国南瓜曲叶病毒；若试纸条上只显示出一条控制线条带在上面，表明该样本不含有中国南瓜曲叶病毒。
本发明提具有如下有益效果：
本发明提供了一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒，本研究建立的RPA-LFD方法适用于南瓜样品中SLCCV的快速检测。与RT-PCR等检测方法相比，RPA-LFD检测体系操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强，不依赖多种实验设备，可应用于现场诊断，LFD检测结果可通过肉眼直接观察。同时RPA-LFD方法为远距离、不易携带样品的检测，以及从资源受限地区调运苗木过程中的病毒检测提供了便利方法。
附图说明
图1为安徽省太和县南瓜病毒病的典型症状；
图2为安徽省太和县SLCCV CP序列电泳检测结果；
图3为SLCCV CP保守序列RPA电泳检测结果，+为阳性对照300bp，扩增目的片段444bp；
图4为RPA-LFD检测SLCCV的特异性分析；
图5为RPA-LFD检测不同稀释倍数下DNA模板的特异性分析；
图6为RPA-LFD检测产物在不同稀释倍数下的特异性分析；
图7为RPA-LFD检测田间南瓜样品的SLCCV感染情况；
图8为3号田间样品不同时间梯度的RPA-LFD检测结果(时间单位：min)。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本发明所用方法如无特别说明均为本领域技术人员所知晓的常规方法，所用试剂等，如无特别说明，均为市售购买产品。
2020年10月，在安徽省太和县旧县镇精准扶贫就业基地的南瓜温室中，南瓜表现出大面积的叶片花叶、黄化、坏死及植株矮化等症状，造成整个温室中的南瓜颗粒无收，我们采集了具有典型病毒病症状的带毒样品，对其样品进行编号后置于液氮中速冻，并保存于-80℃超低温冰箱。
2、方法
2.1检测方法
2.1.1植物总DNA提取
参照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒Plant Genomic Kit进行植物总DNA提取。
2.1.2 RT-PCR检测
根据NCBI中所报道的SLCCV CP序列设计特异性引物，以DNA为模板，利用2×Mix(购于北京艾德莱生物有限公司)进行RT-PCR扩增检测。
扩增引物为：
SLCCV-CP-F：5'-ATGTCGAAGCGACCAGCCGA-3'；
SLCCV-CP-R：5'-TTAATTTGTTACCGAATCAT-3'，扩增片段长度为771bp。
反应条件为：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送至南京生工生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST进行比对。
2.1.3 RPA检测
RPA检测方法参照安普未来DNA恒温快速扩增试剂盒说明书。根据NCBI中所报道的SLCCV CP序列和RPA检测试剂盒要求设计特异性引物进行RPA检测。
所用检测引物为SLCCV-444-F：5'-CCTATGTTTCCCGTGCAGTTGTCCCCATTG-3'；SLCCV-444-R：5'-CACGATGCATGTTCTTCACCGTTGCAGTGC-3'。
反应步骤：在每个干粉反应管中依次加入A buffer 29.4μl，上游引物和下游引物(10μM)各2μl，ddH2O 12.1μl，DNA模板2μl，B buffer 2.5μl，反应体系共为50μl。反应条件为：38℃30min。反应结束后，加入50μl酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)抽提液，1：1混匀抽提反应液，12000rpm离心5min，取5μl上清进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小为444bp。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物送至南京生工生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST进行比对。
2.1.4 LFD检测RPA反应产物
参照安普未来DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)使用说明书操作，并按照要求合成SLCCV引物和探针，序列如下。
SLCCV-444-F：5'-CCTATGTTTCCCGTGCAGTTGTCCCCATTG-3'；
Bio-SLCCV-444-R：5'-Biotin-CACGATGCATGTTCTTCACCGTTGCAGTGC-3'，
Nfo-probe-SLCCV：FAM-TATGGATGGATGAAAATATCAAGACTAAAAAT(THF)CATACTAATAGTGTCAT-C3-Spacer。
反应步骤：在每个干粉反应管中依次加入A buffer 29.4μl，上游引物和下游引物(10μM)各2μl，探针0.6μl，ddH2O 11.5μl，DNA模板2μl，B buffer 2.5μl，反应体系共为50μl。反应条件为：38℃10min。
反应结束后，取10μl加入含有190μl ddH2O的离心管中，混匀后，将胶体金试纸条的样品端放入离心管中，5min内观察质控线与检测线判读结果。结果判定：当对照线(Control line)显示清晰时，表明试纸条结果可信，如观察到测试线(Test line)则为阳性，未观察到测试线则为阴性，未见对照线则检测结果无效。
可以预先将上述试剂按照一定比例混合制成预混液，该预混液比例为BufferA29.5μl，上游引物2μl，下游引物2μl，探针0.6μl，ddH2O11.5μl。通过试验该预混液按照此配比可在4℃下存放一年，反应体系稳定，灵敏度高。待进行试验时再加入DNA模板、2.5μlBbuffer和2.5μl醋酸镁，反应即可开始。
2.2结果与分析
2.2.1安徽省太和县南瓜基地病毒病发生情况
本研究对安徽省太和县旧县镇精准扶贫就业基地的南瓜温室进行了调查分析。温室内南瓜产区病毒病发生十分严重，并出现烟粉虱等传毒介体，受病毒病侵染的南瓜叶片表现为褪绿黄化、皱缩、畸形、坏死，并且植株矮化，不结果实。典型症状如图1。
2.2.2 RT-PCR检测鉴定
根据合成的SLCCV CP特异性引物进行RT-PCR验证，检测结果发现，我们所采集的8组样品中，均检测出相应条带，但是不同的样品所呈现的条带清晰度不同，条带大小约为750bp，如图2所示。PCR产物通过测序后，确定为中国南瓜曲叶病毒。
2.2.3 RPA检测鉴定
我们采用RPA恒温快速检测技术对SLCCV的CP保守序列进行快速检测，结果发现电泳结果显示获得较亮的目的条带，较普通RT-PCR相比条带清晰，其灵敏度比普通RT-PCR高，且用时短，仅需38℃30min，如图3所示，所扩增条带大小约为450bp，PCR产物通过测序后，确定为中国南瓜曲叶病毒。
2.2.4 RPA-LFD检测特异性分析
我们将采集的8组样品通过RPA-LFD反应(38℃10min)，胶体金试纸条检测结果均显示出控制线(Control)和测试线(Test)，即样品检测均为阳性，且不同样品表现出Test条带颜色差异，阴性对照(Negative)中未见测试线，如图4所示，表明建立的RPA-LFD方法能特异地检测SLCCV。
2.2.5 RPA-LFD检测灵敏度分析
我们将第5组样品的DNA模板分别进行10倍、100倍、1000倍的稀释，再插入试纸条，检测不同DNA模板稀释倍数下的灵敏度。如图5所示，结果发现随着稀释倍数的不断增加，检测线的条带越来越淡，到稀释1000倍的时候，控制线几乎看不见条带，肉眼很难观察。
此外，我们将第5组RPA后的产物分别进行10倍、100倍、1000倍的稀释，再插入试纸条，检测不同稀释倍数下试纸条的灵敏度。如图6所示，结果发现随着稀释倍数的不断增加，检测线的条带越来越淡，到稀释1000倍的时候，控制线仅出现微弱的条带，肉眼观察不明显。
2.2.6 RPA-LFD检测田间样品
为了验证建立的SLCCVRPA-LFD方法的田间实用性，我们从田间随机采集了5株南瓜叶片进行RPA-LFD检测。样品反应38℃10min后，我们发现3号样品通过试纸条检测出现微弱条带，如图7所示，通过分析发现，3号样品检测条带较微弱可能是由于我们将田间的叶片直接磨碎后作为反应模板，样品浓度比较低，反应时间较短，导致Test条带不明显。因此我们对3号样品进行了不同时间梯度的RPA-LFD反应，分别为15min、20min、25min、30min和35min。检测结果如图7所示，当反应15min时，Test条带相比较10min来说，亮度已经明显增加，当反应20min及以上时，条带更加清晰，说明随着反应时间的增加，同时样品也进行着充分的反应，Test条带也清晰可见，进一步表明我们建立的RPA-LFD检测方法可用于田间南瓜样品的SLCCV检测，并且反应时间为20min-30min较好。如图8所示。
2.3结论
本研究建立的RPA-LFD方法适用于南瓜样品中SLCCV的快速检测。与RT-PCR等检测方法相比，RPA-LFD检测体系操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强，不依赖多种实验设备，可应用于现场诊断，LFD检测结果可通过肉眼直接观察。同时RPA-LFD方法为远距离、不易携带样品的检测，以及从资源受限地区调运苗木过程中的病毒检测提供了便利方法。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒，其特征在于，包含如下引物组和RPA-LFD检测试纸条：
所述的引物组的核苷酸序列如下所示：
SLCCV-444-F：5'-CCTATGTTTCCCGTGCAGTTGTCCCCATTG-3'，
Bio-SLCCV-444-R：5'-Biotin-CACGATGCATGTTCTTCACCGTTGCAGTGC-3'；
探针Nfo-probe-SLCCV：
FAM-TATGGATGGATGAAAATATCAAGACTAAAAAT(THF)CATACTAATAGTGTCAT-C3-Spacer。
2.根据权利要求1所述的一种中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒，其特征在于，所述的核酸检测试纸条为通用型RPA-LFD核酸检测试纸条。
3.一种如权利要求1-2任一所述的中国南瓜曲叶病毒RPA-LFD快速可视化检测试剂盒在检测中国南瓜曲叶病毒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，RPA反应试剂包括以下成分：A buffer、Bbuffer、上游引物、下游引物、探针、ddH2O和醋酸镁。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在反应前，将除DNA模板、B buffer和醋酸镁之外的试剂预混形成预混液，所述预混液中包括A buffer 29.4μl，上游引物2μl，下游引物μl，探针0.6μl，ddH2O11.5μl，待进行试验时再加入1-2μlDNA模板、2.5μl醋酸镁、2.5μlBbuffer，反应即可开始。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包含以下步骤：
(1)对待测南瓜样本提取植物基因组DNA或者直接提取待测样本的破碎种子或汁液作为模板；
(2)采用预混液对待测样本进行重组酶聚合酶扩增，反应条件为39℃、18min，由此得到带有修饰标记的扩增产物；
(3)将待测样品进行RPA反应后的扩增产物用无菌水稀释20倍后，将侧流层析试纸条插入该反应液中，待3-5min后观察。
(4)结果判读：若试纸条上显示两条带，上面条带代表控制线，下面条带代表检测线，表明该样本含有中国南瓜曲叶病毒；若试纸条上只显示出一条控制线条带在上面，表明该样本不含有中国南瓜曲叶病毒。
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