CN112048573A

CN112048573A - 用于检测棉花曲叶病毒的rpa引物、试剂盒及其检测方法与应用

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Publication number: CN112048573A
Application number: CN202011043581.9A
Authority: CN
Inventors: 汤亚飞; 何自福; 佘小漫; 李正刚; 于琳; 蓝国兵
Original assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2040-09-28
Also published as: CN112048573B

Abstract

本发明公开了用于检测棉花曲叶病毒的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用。其中，所述RPA引物的序列为：CLCV‑F：5'‑TATGGATGGATGAAAATATAAAGACCAGGAAT‑3'(SEQ ID NO.1)；CLCV‑R：5'‑GTATTTTCCTGCTTCCTGTTGATTGTAAAC‑3'(SEQ ID NO.2)。并基于此建立一种RPA检测方法。本发明中的RPA方法简便易操作、快速高效、特异性强、灵敏度高，相较于传统的PCR技术，更适合推广与应用。

Description

用于检测棉花曲叶病毒的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及用于检测棉花曲叶病毒的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用。

背景技术

棉花曲叶病是对棉花生产具有极大危害的病毒病害，在世界范围内对棉花生带来了巨大经济损失。目前，国际上已报道至少有10种病毒与该病害有关，其中木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV)是主要病原之一。棉花曲叶病病原均属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员，由烟粉虱以持久方式传播，可以嫁接传播，但不能通过机械摩擦接种和种子带毒传播。2007年，农业部正式将棉花曲叶病毒列入中国进境植物检疫性有害生物名录，成为一种检疫性病害。

中国是世界上最大的棉花生产国和消费国，适宜种植棉花的区域广泛。虽然该病毒并未在长江流域、黄河流域和西北内陆三大棉区出现传播危害，但其对于多种锦葵科作物的侵害也不容小视，且其传播介体烟粉虱分布广泛，该病害容易随着烟粉虱传播和扩散。

目前，用于检测棉花曲叶病毒的方法主要有基于血清学的酶联免疫方法(双抗体夹心酶联免疫吸附测定，DAS-ELISA)和基于PCR技术的分子检测(常规PCR、实时荧光PCR、纳米磁珠荧光PCR)。血清学方法检测植物病毒病具有直观、方便等特点，但在灵敏度方面依赖于抗血清的品质，在鉴别近缘病毒时有困难，且费时较长；PCR分子检测方法是目前植物病毒常规的检测方法之一，该方法特异、较灵敏，但需要购买专业仪器PCR仪，且较为费时。

因此，亟待开发出一种既能有效克服上述问题，又能高效的检测棉花曲叶病毒的方法，实现对棉花曲叶病毒的监控，为预警棉花曲叶病的爆发以及防控提供技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RPA引物；

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂；

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒；

本发明的另一目的在于提供一种棉花曲叶病毒的RPA检测方法；

本发明的另一目的在于提供上述RPA引物或上述检测试剂或上述检测试剂盒在植物中棉花曲叶病毒检测中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种RPA引物，该RPA引物的序列为：

CLCV-F：5'-TATGGATGGATGAAAATATAAAGACCAGGAAT-3'(SEQ ID NO.1)；

CLCV-R：5'-GTATTTTCCTGCTTCCTGTTGATTGTAAAC-3'(SEQ ID NO.2)。

本发明中的RPA引物是基于棉花曲叶病毒的外壳蛋白(coat protein，CP)基因序列设计得到。上述棉花曲叶病毒的外壳蛋白(coat protein，CP)基因序列GenBank序列登录号为： EF465535。

进一步地，上述检测试剂盒中还包括RPA重组酶试剂。

RPA技术主要是在25℃～42℃范围内的等温条件下，重组酶与引物DNA紧密结合形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白SSB的作用下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。

本发明的第二个方面，提供：

一种检测试剂，该检测试剂中含有上述的RPA引物。

本发明的第三个方面，提供：

一种检测试剂盒，该检测试剂盒中包括上述的RPA引物或上述的检测试剂。

进一步地，上述检测试剂盒还包括本领域常规使用的RPA试剂。

本发明的第四个方面，提供：

一种棉花曲叶病毒的RPA检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)将上述RPA引物和待测样品DNA加入至TwistAmp Basic RPA冻干酶粉管进行RPA 扩增，得到扩增产物；

(3)分析步骤(2)得到的上述扩增产物条带长度，判断待测样品中是否含有棉花曲叶病毒。

其中，上述TwistAmp Basic RPA冻干酶粉管来自TwistAmp Basic RPA试剂盒(TwistDx公司，英国)。

当然，也可以使用其他RPA试剂盒中的酶粉管进行RPA扩增；或

使用合理比例的重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶混合物进行RPA扩增。

进一步地，上述步骤(3)中判断待测样品中是否含有棉花曲叶病毒的标准为：

(1)若步骤(2)得到的上述扩增产物含有299bp条带，则上述待测样品中含有棉花曲叶病毒；

(2)若步骤(2)得到的上述扩增产物不含有299bp条带，则上述待测样品中不含有棉花曲叶病毒。

进一步地，上述步骤(2)RPA扩增体系为：

再水化buffer(Rehy-dration buffer)	29.5μL
		10μmol/L CLCV-F	2μL
10μmol/L CLCV-R	2μL
		待测样品DNA	2μL
280mmol/L醋酸镁	2.5μL
		无RNAase水	补足至50μL

进一步地，上述步骤(2)RPA扩增反应条件为：40℃反应20～50min。

更进一步地，上述步骤(2)RPA扩增反应条件为：40℃反应40min。

本发明的第五个方面，提供：

上述RPA引物或上述检测试剂或上述检测试剂盒在植物中棉花曲叶病毒检测中的应用。

进一步地，上述植物包括锦葵科作物。

其中，上述锦葵科作物包括锦葵属、花葵属、蜀葵属、赛葵属、黄花稔属、隔蒴苘属、苘麻属、翅果麻属、梵天花属、悬铃花属、秋葵属、木槿属、十裂葵属、桐棉属、棉属、大萼葵属植物。

更进一步地，上述植物包括棉花、黄秋葵、朱槿、红麻、垂花悬铃花。

本发明的有益效果是：

1.简便易操作：本发明的方法只需要恒温水浴锅或者稳定热源的设备就能进行实验，不需要专业的仪器，非专业人员均可操作，鉴定方法适应性强，克服了常规PCR专业性强及需要昂贵的专用仪器设备等局限性，从而达到实际生产中对植物病害鉴定快速、准确的要求。

2.快速高效：本发明的RPA检测方法最短20分钟就可以扩增出目的片段，而常规PCR 检测鉴定方法最短需要2～3小时，这样大大提高了检测效率。

3.特异性强：用于RPA扩增的引物要求由30～35个核苷酸组成，而用于普通PCR引物长度通常为20个左右的核苷酸，因此这种较长的引物与模板序列严格互补，大大提高了RPA 扩增的特异性，减少假阳性的概率。

4.灵敏度高：以棉花曲叶病毒阳性病样总DNA进行10倍系列稀释后用作模板，分别进行RPA反应和普通PCR反应。普通PCR可以在10^-2倍稀释模板中检测到，而RPA可以在 10^-3倍稀释模板中检测到，表明本发明的RPA检测方法比普通PCR检测灵敏度高10倍。

附图说明

图1为本发明中的RPA引物在不同反应时间下的电泳图，其中，M：2000bp Marker；1： 60min；2：50min；3：40min；4：30min；5：20min；

图2为本发明的RPA检测与普通PCR扩增灵敏度比较结果，其中，A：RPA扩增结果；B：普通PCR扩增结果；

图3为本发明的RPA引物特异性评价结果，其中，M：2000bp Marker，1：棉花曲叶病毒阳性样品；2：2中国台湾番茄曲叶病毒阳性样品；3：番茄黄化曲叶病毒阳性样品；4：泰国番茄黄化曲叶病毒阳性样品；5：中国南瓜曲叶病毒阳性样品；6：黄花捻曲叶病毒阳性样品；7：阴性对照；

图4为7种疑似病样的实际检测结果，其中，A：RPA扩增结果；B：普通PCR扩增结果，M：2000bp Marker；1-7：疑似病样；8：阴性对照；9：清水对照。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

引物设计

本发明实施例中的RPA引物，是根据棉花曲叶病毒的外壳蛋白(coat protein，CP)基因(GenBank序列登录号：EF465535)设计得到的，具体序列为：

CLCV-F：5'-TATGGATGGATGAAAATATAAAGACCAGGAAT-3'(SEQ ID NO.1)；

CLCV-R：5'-GTATTTTCCTGCTTCCTGTTGATTGTAAAC-3'(SEQ ID NO.2)。

植物样品中的DNA提取

采用本领域常规的植物DNA提取试剂盒或其他常规方法提取植物样品中的总DNA。

本发明实施中的提取方法具体为：

取待测植物样品的新鲜叶片约0.1g，使用植物基因组DNA提取试剂盒(EasyPurePlant Genomic DNA Kit，北京全式金生物技术有限公司)，按照说明书要求提取植物总DNA，保存于-20℃冰箱，备用。

RPA扩增反应

以棉花曲叶病毒阳性植株总DNA为模板，利用本发明设计的引物CLCV-F/CLCV-R进行 RPA扩增。

具体步骤为：

向已装有冻干酶粉的PCR试管中加入再水化Buffer 29.5μL、10μmol/L引物CLCV-F和 CLCV-R各2μL、模板DNA 2μL、280mmol/L醋酸镁2.5μL、无RNAase水12μL。

具体RPA扩增体系组成如下：

表1 RPA扩增体系组成

组分	用量
		再水化buffer(Rehy-dration buffer)	29.5μL
10μmol/L CLCV-F	2μL
		10μmol/L CLCV-R	2μL
模板DNA	2μL
		280mmol/L醋酸镁	2.5μL
无RNAase水	补足至50μL

反应温度为40℃，分别水浴20、30、40、50、60min，以探究最佳反应时间。

反应结束后，用DNA片段纯化试剂盒(Takara MiniBEST DNA FragmentPurifucation Kit，宝生物工程(大连)有限公司)对RPA产物进行纯化回收。

取纯化回收得到的RPA产物10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳20min，在凝胶成像系统上观察结果，最后根据琼脂糖凝胶电泳结果，确定最佳反应时间。

结果如图1所示。在反应温度为40℃条件下，分别温浴20min时就可以获得目的条带， 40min中获得的目的条带最亮，随着时间延长条带亮度无明显变化。综合琼脂糖凝胶电泳结果，确定40min为最佳反应时间。

RPA灵敏度检测

以棉花曲叶病毒阳性植物总DNA为模板进行稀释，稀释浓度梯度为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、 10^-4、10^-5六个稀释度，分别进行RPA和普通PCR检测，比较二者的检测灵敏度。RPA反应体系同上述RPA反应体系，然后在温度40℃条件下温浴40min，完成RPA的灵敏度测定实验。常规PCR扩增反应体系和反应程序如下所示。

常规PCR扩增的反应步骤：

以棉花曲叶病毒阳性植株总DNA为模板，以本发明设计的棉花曲叶病毒的特异引物 CLCV-F/CLCV-R进行PCR扩增。

反应体系为：

表2棉花曲叶病毒常规PCR扩增反应体系

组分	用量
		模板DNA	2μL
rTaq<sup>TM</sup>Premix	25μL
		10μmol/L CLCV-F	2μL
10μmol/L CLCV-R	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足至50μL

反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，54℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环完成后，72℃延伸10min。

取PCR产物在10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳20min，在凝胶成像系统上观察结果。

结果如图2所示。电泳结果显示，本发明实施例中的RPA引物在模板稀释倍数为10^-3时能扩增的目的条带，普通PCR在模板稀释倍数为10^-2时能扩增的目的条带，因此，本发明的RPA检测方法比普通PCR检测方法灵敏度高10倍。

RPA特异性检测

分别以棉花曲叶病毒、中国台湾番茄曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、泰国番茄黄化曲叶病毒、中国南瓜曲叶病毒、黄花捻曲叶病毒6种病毒的阳性植物总DNA为模板，采用上述RPA反应体系，然后在温度40℃条件下温浴40min，完成RPA的特异性测定实验。

检测结果如图3所示。本发明的RPA检测方法只能从棉花曲叶病毒阳性植物总DNA中扩增出目的条带，未能从其它几种病毒阳性植物总DNA中扩增出任何条带，说明本发明所建立的棉花曲叶病毒RPA检测技术具有较好的特异性。

RPA检测方法的实际检测效果验证试验

从广东省各地采集疑似感染棉花曲叶病毒的植物病样7份，提取总DNA，分别使用上述实施例中的棉花曲叶病毒RPA检测方法(相同的反应体系及反应条件)进行检测，并用常规 PCR扩增(反应体系和条件如上述实施例所示)加以验证。

结果如图4所示。结果表明，7份疑似病样品检测均为阳性，进一步应用PCR加以验证，其检测结果与RPA检测结果一致，二者的符合率为100％。说明本发明所建立的棉花曲叶病毒RPA检测方法能够实现田间病样的快速、准确检测与诊断。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院植物保护研究所

<120> 用于检测棉花曲叶病毒的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tatggatgga tgaaaatata aagaccagga at 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtattttcct gcttcctgtt gattgtaaac 30

Claims

1.一种RPA引物，其特征在于，所述RPA引物的序列为：

CLCV-F：5'-TATGGATGGATGAAAATATAAAGACCAGGAAT-3'；

CLCV-R：5'-GTATTTTCCTGCTTCCTGTTGATTGTAAAC-3'。

2.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有权利要求1或2所述的RPA引物。

3.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的检测试剂。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括RPA重组酶试剂。

5.一种棉花曲叶病毒的RPA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)将权利要求所述1所述RPA引物和待测样品DNA加入至TwistAmp Basic RPA冻干酶粉管进行RPA扩增，得到扩增产物；

(3)分析步骤(2)得到的所述扩增产物条带长度，判断待测样品中是否含有棉花曲叶病毒。

6.根据权利要求5所述的RPA检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述判断待测样品中是否含有棉花曲叶病毒的标准为：

(1)若步骤(2)得到的所述扩增产物含有299bp条带，则所述待测样品中含有棉花曲叶病毒；

(2)若步骤(2)得到的所述扩增产物不含有299bp条带，则所述待测样品中不含有棉花曲叶病毒。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述RPA扩增体系为：

8.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述RPA扩增反应条件为：40℃反应20～50min。

9.权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的检测试剂或权利要求3或4所述的检测试剂盒在植物中棉花曲叶病毒检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物包括锦葵科作物。