CN107254552A

CN107254552A - 一种基于rpa检测番茄黄化曲叶病毒的方法

Info

Publication number: CN107254552A
Application number: CN201710494231.6A
Authority: CN
Inventors: 周莹; 乔鑫; 刘梅; 张玮; 燕继晔; 乔广行
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2017-06-26
Filing date: 2017-06-26
Publication date: 2017-10-17
Anticipated expiration: 2037-06-26
Also published as: CN107254552B

Abstract

本发明公开了一种基于RPA检测番茄黄化曲叶病毒的方法。本发明提供了用于检测番茄黄化曲叶病毒的引物对，为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。本发明中的RPA引物可有效扩增靶基因，特异性达100％，灵敏度为6×10⁵拷贝/μL；与番茄常见病毒病无交叉反应。本发明为育苗圃的苗木筛查提供了可用的快速检测方法。对于防止番茄黄化曲叶病毒的扩散蔓延具有重要意义。

Description

一种基于RPA检测番茄黄化曲叶病毒的方法

技术领域

本发明属于植物病害诊断领域，涉及一种基于RPA检测番茄黄化曲叶病毒的方法。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是引起番茄黄化曲叶病的重要病原，被感染的番茄植株表现曲叶、斑驳、黄化、节间缩短以及植株矮化等症状。我国于2006年在上海首次发现TYLCV，随后该病害由南向北扩散，给番茄生产造成了严重影响。

番茄黄化曲叶病毒病害的综合防治措施中，除使用抗病毒品种和对传播介体进行防治外，预防该病毒病的发生也非常重要，而快速、准确地检测病毒是预防工作的重要前提。

目前番茄黄化曲叶病毒的检测方法主要包括生物学检测、电子显微镜检测、血清学检测以及分子生物学检测等技术。生物学检测是将病毒接种于寄主植物上，根据典型症状来判断，该方法直观便捷，但对于具有类似症状的病毒较难分辨，而且耗时较长。电镜检测可以直接观察病毒的形态结构以及病毒侵染寄主植物后所引起的植物超微结构变化，是一种最直接的观察方法，但对于病毒的分类和归属较难判定，并且病毒的提纯工作对技术要求高。血清学检测是在免疫酶基础上发展起来的免疫测定技术，该方法被广泛用于植物病毒检测。分子生物学PCR检测主要是通过病毒的核酸来检测病毒，它比血清学方法的灵敏度要高，能检测到更高数量级的病毒，特异性强、操作简便、可用于大量样品检测。自PCR技术发明以来，PCR已经成为病毒检测一种普遍采用的方法。但由于PCR技术对仪器的依赖度高，需要精密的温度循环仪器才能完成扩增过程。加之成本高、耗时长，这些局限性使其应用大多限制于条件完善的实验室内，难以广泛应用于现场检测。

近年来，恒温核酸扩增技术的出现恰可解决PCR技术的局限，它对仪器的要求大为简化，反应时间明显缩短，因而日益受到关注。重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymerase Amplification，RPA)是恒温核酸扩增技术的一种，可在常温下进行反应，且反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便。目前RPA技术在医学病原物的快速诊断中得到了一些应用，农业领域中主要用于转基因作物的检测。专利《一种检测GII型诺如病毒的试剂盒及其用途》(专利号：CN201310271924.0)公开了利用RPA技术检测GII型诺如病毒的引物对和探针及包含所述引物对和探针的试剂盒。专利《应用RPA技术对转基因水稻华恢1号品系特异性鉴定》(专利号：CN201310391525.8)和专利《Cry1Ab/Cry1Ac抗虫基因RPA检测方法》(专利号：CN201310390769.4)公开了利用RPA技术鉴定转基因作物的引物及探针组合以及方法。用于植物病毒检测的报道较少，番茄黄化曲叶病毒病是近几年番茄上最严重的病害之一，快速、准确地检测该病原对于病害防治至关重要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于检测番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellowleaf curl virus,TYLCV)的引物对。

本发明所提供的用于检测番茄黄化曲叶病毒的引物对，具体为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellowleaf curl virus,TYLCV)的重组酶聚合酶扩增试剂。

本发明所提供的用于检测番茄黄化曲叶病毒的重组酶聚合酶扩增试剂，包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs、醋酸镁和权利要求1所述的引物对。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellowleaf curl virus,TYLCV)的重组酶聚合酶扩增试剂盒。

本发明所提供的用于检测番茄黄化曲叶病毒的重组酶聚合酶扩增试剂盒，含有所述引物对或所述试剂。

根据需要，所述试剂盒中还可含有阳性质粒；所述阳性质粒为含有序列表中序列4所示DNA片段的重组质粒。

在本发明中，所述阳性质粒具体为将序列表中序列4所示DNA片段与pMD18-T质粒连接后所得的重组质粒。

所述引物对或所述试剂或所述试剂盒在如下任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)检测或辅助检测番茄黄化曲叶病毒；

(2)制备用于检测或辅助检测番茄黄化曲叶病毒的产品；

(3)检测或辅助检测待测番茄植株是否感染番茄黄化曲叶病毒；

(4)制备用于检测或辅助检测待测番茄植株是否感染番茄黄化曲叶病毒的产品；

(5)检测或辅助检测待测病毒是否为番茄黄化曲叶病毒；

(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为番茄黄化曲叶病毒的产品。

本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测番茄植株是否感染番茄黄化曲叶病毒的方法。

本发明所提供的检测或辅助检测待测番茄植株是否感染番茄黄化曲叶病毒的方法，具体可包括如下步骤：

(a)从待测番茄植株样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；

(b)按照如下方法确定所述待测番茄植株样品是否感染番茄黄化曲叶病毒：若所述扩增产物中含有343bp的DNA片段，则所述待测番茄植株样品感染或候选感染了番茄黄化曲叶病毒；若所述扩增产物中不含有343bp的DNA片段，则所述待测番茄植株样品未感染或候选未感染番茄黄化曲叶病毒。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为番茄黄化曲叶病毒的方法。

本发明所提供的检测或辅助检测待测病毒是否为番茄黄化曲叶病毒的方法，具体可包括如下步骤：

(a)从待测病毒中提取基因组作为模板，采用所述引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；

(b)按照如下方法确定所述待测病毒是否为番茄黄化曲叶病毒：若所述扩增产物中含有343bp的DNA片段，则所述待测病毒为或候选为番茄黄化曲叶病毒；若所述扩增产物中不含有343bp的DNA片段，则所述待测病毒不为或候选不为番茄黄化曲叶病毒。

在上述两种方法中，所述343bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示DNA片段。

在实际应用中，判断扩增产物中是否含有343bp的DNA片段时，可通过将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(如1.5％琼脂糖凝胶电泳)，看电泳图谱上是否含有大小为343bp的目的条带：电泳图谱上含有343bp的目的条带，则扩增产物中含有相应的343bp的DNA片段。

在实际应用中，判断扩增产物中是否含有序列表中序列3所示DNA片段，可通过对扩增产物进行核苷酸序列测定来判断。

在上述两种方法的步骤(a)中，进行所述重组酶聚合酶扩增时，所述引物对中两条引物在反应体系中为等摩尔使用。所述引物对中两条引物在反应体系中的终浓度均为0.4μmol/L。

在上述两种方法的步骤(a)中，进行所述重组酶聚合酶扩增时，反应条件具体为30-42℃(如37℃)孵育20-40min(如40min)。

本发明具有的优点：(1)本发明检测番茄黄化曲叶病毒的方法操作简便，仪器要求低，无需变温仪器，可用于实验室快速检测，为番茄黄化曲叶病毒的防控工作提供一种新的、可靠的技术支持。(2)本发明中的RPA引物可有效扩增靶基因，特异性达100％，灵敏度为6×10⁵拷贝/μL，比普通PCR的灵敏度高10倍；与番茄常见病毒病无交叉反应。(3)本发明的RPA等温扩增体系，反应快速，在37℃条件下，即可实现靶基因的有效扩增，可以实现番茄黄化曲叶病毒快速检测，也为育苗圃的苗木筛查提供了可用的快速检测方法。对于防止番茄黄化曲叶病毒的扩散蔓延具有重要意义。

附图说明

图1为RPA方法检测TYLCV的核苷酸引物筛选。A中，M：DNA marker DL 2000；1-3：引物组合T1(1：番茄样品；2：阳性对照；3：阴性对照)；4-6：引物组合T2(4：番茄样品；5：阳性对照；6：阴性对照)；7-9：引物组合T3(7：番茄样品；8：阳性对照；9：阴性对照)；10-12：引物组合T4(10：番茄样品；11：阳性对照；12：阴性对照)。B中，M：DNA marker DL 2000；1-3：引物组合T5(1：番茄样品；2：阳性对照；3：阴性对照)；4-6：引物组合T6(4：番茄样品；5：阳性对照；6：阴性对照)；7-9：引物组合T7(7：番茄样品；8：阳性对照；9：阴性对照)；10-12：引物组合T8(10：番茄样品；11：阳性对照；12：阴性对照)。

图2为RPA方法检测TYLCV的特异性分析。M：DNA marker DL 2000；1：TYLCV；2：ToCV；3：CMV；4：TMV；5：阴性对照。

图3为RPA方法检测TYLCV的灵敏度分析。A为本发明RPA检测结果；B为普通PCR检测结果。A和B中，M：DNA marker DL 2000；1：6×10⁹拷贝/μL；2：6×10⁸拷贝/μL；3：6×10⁷拷贝/μL；4：6×10⁶拷贝/μL；5：6×10⁵拷贝/μL；6：6×10⁴拷贝/μL；7：6×10³拷贝/μL；8：6×10²拷贝/μL；8：6×10¹拷贝/μL；9：阴性对照。

图4为RPA方法检测番茄样品中的TYLCV。M：DNA marker DL 2000；1-6：待测番茄样品；7：阳性对照；8：阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、番茄黄化曲叶病毒的RPA检测核苷酸引物组合筛选

(1)参照番茄黄化曲叶病毒DNA-A基因序列(GenBank：KM506961.1)，结合RPA引物设计的特点，设计11条RPA引物(表1)，组成8对引物组合(表2)，用于筛选实验。

(2)称取0.1g番茄样品叶片，使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNAExtraction Kit提取样品DNA，按照试剂盒说明书操作。

(3)取1μL番茄样品总DNA作为模板，依次加ddH₂O 13μL、10μmol/L的正向引物2μL、10μmol/L的反向引物2μL、干粉溶解缓冲液(Rehydration buffer)29.5μL，最后加280mmol/L醋酸镁2.5μL启动反应，总体积为50μL，混匀后37℃孵育40min。同时以健康番茄样品DNA作为阴性对照。其中，干粉溶解缓冲液与280mmol/L醋酸镁为TwistAmp Basic RPA检测试剂盒中产品。

(4)50μL RPA产物与同体积的(Tri饱和酚：氯仿＝1:1，体积比)混合，12000rpm离心10min，吸取上清5μL进行琼脂糖凝胶电泳20min后染色拍照。

结果见图1，引物对T4(F3和R3)组合条带最为清晰，条带大小为343bp(序列3)，易于与引物二聚体区分，是检测TYLCV的最佳PRA引物组合。即：

正向引物F3：5’-CATGTAACTTATAATCATCAGGAGGCAGCCAAG-3’(序列1)；

反向引物R3：5’-GAATTTGGACGACATTACAGCCTCAGACTGGT-3’(序列2)。

理论扩增产物为343bp，具体序列如序列表中序列3所示。

表1 用于检测TYLCV的RPA引物

表2 RPA引物组合以及产物大小

实施例2、番茄黄化曲叶病毒的RPA检测方法的特异性分析

(1)提取番茄黄化曲叶病毒阳性样品和健康番茄样品的DNA、番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)、黄瓜花叶病毒(Cucumer mocsic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)阳性样品的RNA。使用植物基因组DNA及RNA提取试剂盒提取。

(2)提取的RNA经过以下方法反转录：dNTPs(2.5mmol/L)3μL，5×MMLVbuffer 2μL，MMLV(200U/μL)1μL，Rnaseinhibitor(40U/μL)1μL，随机六聚引物和Oligo(dT)18引物各0.5μL，植物总RNA 1μL，用灭菌ddH₂O补足到20μL，混匀，42℃温育1h获得cDNA。

(3)第(1)步提取的DNA和第(2)步获得的cDNA各取1μL作为模板，依次加ddH₂O 13μL、10pmol/L的正向引物F3 2μL、10pmol/L的反向引物R3 2μL、干粉溶解缓冲液(Rehydration buffer)29.5μL，最后加280mmol/L醋酸镁2.5μL启动反应，总体积为50μL，混匀后37℃孵育40min。同时以灭菌ddH₂O代替模板作为空白对照。其中，干粉溶解缓冲液与280mmol/L醋酸镁为TwistAmp Basic RPA检测试剂盒中产品。

特异性分析结果见图2，除了TYLCV阳性样品扩增出343bp的目的条带(序列3)外，ToCV、CMV、TMV和空白对照均未出现条带，表明建立的TYLCV RPA检测方法具有很好的特异性。

实施例3、番茄黄化曲叶病毒的RPA检测方法的灵敏度分析

(1)重组质粒为含有TYLCV基因组的质粒pMD18-T-TYF6R6，由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所植病组保存。该重组质粒由引物TYF6：CGGATGGAAATTGTGCTGA和TYR6：ACTATCTTCCTCTGCAATC扩增TYLCV阳性样品获得的DNA片段(序列4)与pMD18-T质粒连接后所得。重组质粒大小为2692+2155＝4847bp。

用微量分光光度计测定质粒浓度为30.3ng/μL。根据以下公式计算出质粒的拷贝数为6×10⁹拷贝/μL，将该质粒作为标准样品母液，-20℃保存备用。

质粒拷贝数计算公式：A＝(B×6.022×10²³)/(C×650×10⁹)，其中A为拷贝/μL，B为质粒浓度，C为重组质粒长度。

(2)将重组标准质粒DNA进行10倍梯度逐级稀释，分别得到原液、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7不同稀释液后各吸取1μL作为模板，依次加ddH₂O 13μL、10pmol/L的正向引物F3 2μL、10pmol/L的反向引物R3 2μL、干粉溶解缓冲液(Rehydration buffer)29.5μL，最后加280mmol/L醋酸镁2.5μL启动反应，总体积为50μL，混匀后37℃孵育40min。同时以健康番茄样品DNA作为阴性对照。其中，干粉溶解缓冲液与280mmol/L醋酸镁为TwistAmpBasic RPA检测试剂盒中产品。

(3)50μL RPA产物与同体积的(Tri饱和酚：氯仿＝1:1，体积比)混合，12000rpm离心10min，吸取上清5μL进行琼脂糖凝胶电泳20min后染色拍照。

实验同时设置普通PCR对照。引物为TYQ1和TYQ2，扩增片段大小为132bp。PCR反应体系为：2×Taq DNA Master mix 12.5μL、TY-Q1与TY-Q2引物各1μL、不同拷贝数的重组质粒模板1μL、ddH₂O 9.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。反应完毕后吸取上清5μL进行琼脂糖凝胶电泳20min后染色拍照。

TYQ1：5’-TCGTTGTGTTAGTGATGTTAC-3’

TYQ2：5’-TTAGTGTGATTCTGCTTCTTG-3’

TYLCV RPA检测方法的灵敏度结果见图3，TYLCV RPA检测灵敏度达到6×10⁵拷贝/μL，高于普通PCR 10倍。

实施例4、番茄样品的TYLCV RPA检测

(1)采集6个番茄样品(经实施例3中普通PCR方法确定感染了TYLCV)，称取0.1g番茄样品叶片，使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit提取样品DNA，按照试剂盒说明书操作。

(2)取1μL番茄样品总DNA作为模板，依次加ddH₂O 13μL、10pmol/L的正向引物F3 2μL、10pmol/L的反向引物R3 2μL、干粉溶解缓冲液(Rehydration buffer)29.5μL，最后加280mmol/L醋酸镁2.5μL启动反应，总体积为50μL，混匀后37℃孵育40min。同时以TYLCV阳性样品(重组质粒pMD18-T-TYF6R6)和番茄健康样品DNA作为阳、阴性对照。其中，干粉溶解缓冲液与280mmol/L醋酸镁为TwistAmpBasic RPA检测试剂盒中产品。

结果见图4，6个待测番茄样品与阳性对照均扩增出343bp的目的条带(序列3)，而阴性对照未出现任何条带，说明建立的RPA方法能够用于番茄样品中的TYLCV检测。

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种基于RPA检测番茄黄化曲叶病毒的方法

<130> GNCLN171147

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

catgtaactt ataatcatca ggaggcagcc aag 33

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

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gaatttggac gacattacag cctcagactg gt 32

<210> 3

<211> 343

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 3

catgtaactt ataatcatca ggaggcagcc aagtatgaga accatactga aaacgccttg 60

ttattgtata tggcatgtac gcatgcctct aatccagtgt atgcaactat gaaaatacgc 120

atctatttct atgattcaat atcaaattaa taaaatttat attttatatc atgagttgct 180

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cgtctagata ttccctatat gaggaggtag gtcctggatt gcagaggaag atagt 2155

Claims

1.用于检测番茄黄化曲叶病毒的引物对，为如下(a)或(b)：

2.用于检测番茄黄化曲叶病毒的重组酶聚合酶扩增试剂，包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs、醋酸镁和权利要求1所述的引物对。

3.用于检测番茄黄化曲叶病毒的重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有阳性质粒；所述阳性质粒为含有序列表中序列4所示DNA片段的重组质粒。

5.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂或权利要求3或4所述的试剂盒在如下任一中的应用：

(1)检测或辅助检测番茄黄化曲叶病毒；

(2)制备用于检测或辅助检测番茄黄化曲叶病毒的产品；

(5)检测或辅助检测待测病毒是否为番茄黄化曲叶病毒；

6.一种检测或辅助检测待测番茄植株是否感染番茄黄化曲叶病毒的方法，包括如下步骤：

(a)从待测番茄植株样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；

7.一种检测或辅助检测待测病毒是否为番茄黄化曲叶病毒的方法，包括如下步骤：

(a)从待测病毒中提取基因组作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述343bp的DNA片段为序列表中序列3所示DNA片段。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，进行所述重组酶聚合酶扩增时，所述引物对中两条引物在反应体系中为等摩尔使用。

10.根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，进行所述重组酶聚合酶扩增时，反应条件为30-42℃孵育20-40min。