CN113462814A

CN113462814A - 一种检测甘薯金脉病毒的rpa引物和探针、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN113462814A
Application number: CN202110557534.4A
Authority: CN
Inventors: 沈文涛; 王赫; 庹德财; 周鹏; 言普; 黎小瑛
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2021-10-01

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测甘薯金脉病毒的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法。本发明以甘薯金脉病毒编码的CP基因特定保守序列为模板，设计特定引物和探针。采用本发明的引物和探针进行检测甘薯金脉病毒，仅需以甘薯病叶DNA为模板，进行等温扩增，不需要精密仪器，操作简单，结果可视化，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，敏感性高，特异性强，诊断准确，整个检测过程只需25分钟，结果的判定极其简便，适用于甘薯金脉病毒的田间快速检测。

Description

一种检测甘薯金脉病毒的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测甘薯金脉病毒的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

甘薯在世界范围内广泛种植，是一种无性繁殖作物，易受到病毒的感染，侵染后便会代代相传，影响到甘薯的正常生长，从而造成产量下降，品质变差，种质和种性退化。甘薯金脉病毒(Sweet potato golden vein associated virus,SPGVAV)属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，是危害甘薯生长仅次于甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus，SPLCV)的另外一种DNA病毒，在世界甘薯产区均有分布，病害发生严重时可造成甘薯绝产，对甘薯产业发展造成巨大威胁。

甘薯金脉病毒仅在巴西，美国，韩国进行报道，中国尚无明确报道。甘薯金脉病毒侵染甘薯后，甘薯植株会出现，花叶、叶片、叶柄叶脉金黄等症状。目前，防治甘薯金脉病毒病尚无有效措施，且无高效、快速检测技术的建立。因此，建立高效、快速、实用的甘薯金脉病毒检测技术，对甘薯金脉病毒的防控具有重要的意义。

目前，检测甘薯病毒的检测方法主要有植物指示法、酶联免疫吸附法、PCR技术、环介导、等温扩增LAMP等。指示植物检测法，方法简单，但是无法确定侵染病毒的种类，灵敏度也较低。目前，已有很多利用血清学检测方法鉴定甘薯病毒的报道，其中以酶联免疫吸附法最为普遍。该方法：灵敏度高、快速直观、可大量检测甘薯病毒但是耗时较长，费用较高、对复合感染样品不够灵敏、假阳性较强。利用分子生物学技术建立的普通PCR、(RT)PCR技术等方法使得甘薯病毒的检测操作简单，灵敏可靠，但对操作人员有一定的要求，且需要配备昂贵的仪器，限制了田间使用。等温扩增LAMP，可适用于田间检测，但引物设计繁琐，检测过程中易受气溶胶污染，导致结果出现假阳性。

重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplication,RPA)是由Piepenburg等于2006年研发的一种新型核酸等温扩增技术是依赖重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶完成对模板DNA指数型扩增的一种快速灵敏的核酸恒温扩增技术，该技术与利用胶体金免疫层析原理检测的侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，LFD)结合应用，实现检测结果可视化。

该技术不借助大型仪器设备，无需温度循环，通过模拟生物体内DNA复制，在恒定温度下，短暂时间内，实现目标片段扩增。该技术具有快速、经济有效、操作性强、特异性强和敏感性高等优点被广泛应用到动植物病原菌检测。目前，国内外尚未有将该技术用于检测甘薯金脉病毒的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测甘薯金脉病毒的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法。本发明试剂盒结合侧流层析试纸条可实现甘薯金脉病毒的高效、快速、准确、特异性检测，整个检测过程只需25分钟，且结果的判定极其简便，适用于甘薯金脉病毒的田间快速检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种检测甘薯金脉病毒的引物和探针，包括RPA上游引物、RPA下游引物和RPA探针，

所述RPA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述RPA下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述RPA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。本发明针对甘薯金脉病毒CP基因的保守区域设计了SEQ IDNO:1～2所示核苷酸序列的RPA引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的RPA探针，核苷酸序列如下：

SEQ ID NO:1：5’-AACTTCGAGACAGCTATCGTGCCCTACACTG-3’

SEQ ID NO:2：5’-CCCTTGTAAAATCCGAGACACAGACAAACG-3’；

SEQ ID NO:3：5’-TGCTGTCCCAATTGCTGCCCGAAGCTATGT CCCGGTTTCAAGAGGC-3’。

本发明中，所述RPA引物的下游引物的5’端标记biotin。RPA探针的5’端标记荧光基团，3’端修饰阻断基团；荧光基团包括但不仅限于FAM，阻断基团用于阻止链的延伸，包括但不仅限于C3-spacer。RPA探针5’端第31位的碱基进行脱碱基替换修饰。

一些具体实施例中，所述RPA引物的下游引物的5’端标记biotin。RPA探针的5’端标记FAM，将5’端第31位的碱基C替换为四氢呋喃连接子(THF)，3’端修饰spacer，获得的序列具体如下：

RPA下游引物：5’-Biotin-CCCTTGTAAAATCCGAGACACAGACAAACG-3’；

RPA探针序列：5’-FAM-TGCTGTCCCAATTGCTGCCCGAAGCTATGT-THF-CCGGTTTCAAGAGGC-[C3-spacer]-3’。

本发明还提供了所述的RPA引物和探针在制备检测甘薯金脉病毒的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测甘薯金脉病毒的试剂盒，本发明所述的RPA引物和探针。

一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测内参基因的SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的通用引物。

其中，通用引物为：

SPGvav-F：5’-GTCCCAATTGCTGCCCGA-3’(SEQ ID No.4)；

SPGvav-R:5’-AAATAAGCCCTGCAACGCAGC-3’(SEQ ID No.5)

一些实施方案中，本发明试剂盒还包括RPA酶、溶解剂、荧光扩增试剂、无菌水、反应驱动液、标准质粒、侧流层析试纸条中的一种或几种。

本发明还包括一种甘薯金脉病毒的检测方法，利用本发明试剂盒对待测样本的DNA进行RPA扩增，利用侧流层析试纸条对扩增产物进行检测，根据显色情况判定是否含有甘薯金脉病毒。

判定方法为：若试纸条的质控区和检测区均出现红色条带，则检测结果为阳性，表明待测样本中含有甘薯金脉病毒；若试纸条仅质控区出现红色条带，则检测结果是阴性，表明样本中不含有甘薯金脉病毒；若质控区和检测区均不出现红色条带或仅质控区出现红色条带，则检测结果无效。

本发明中，每50μLRPA扩增体系包括：溶解剂20μL、引物探针液4.8μL(上下游引物各2.1μL，探针0.6μL)、无菌双蒸水21.2μL、待测样本DNA为2μL或空白对照2μL、反应驱动液2μL。

具体配置方法如下：

按以上体系将除反应驱动液外的其他组分混合，获得每份样本的预混液，充分振荡混匀并短暂离心；

对于每份样本，将48μL匀混液转移至每管荧光扩增试剂中。振荡混匀直到扩增试剂重悬，并短暂离心。

对于每份样本，在反应管盖上加所述2μL反应驱动液，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中，获得所述RPA扩增体系。

一些具体实施例中，引物、探针的浓度为10μM。

RPA扩增的程序为：37℃反应25min，4℃保持。

本发明基于甘薯金脉病毒CP基因的保守片段设定引物和探针，对其它病原高度特异，再应用重组酶聚合酶扩增侧流层析的方法制备了快速检测甘薯金脉病毒的试剂盒，敏感性高，特异性强，诊断准确，整个检测过程只需25分钟，结果的判定只需观察侧流层析试纸条显示的结果即可，操作极其简便；得到核酸样品后整个反应过程可以在非实验室环境下进行，不仅适用于室内鉴定而且可以应用于田间现场检测。

附图说明

图1为实施例1RPA检测方法的建立结果，1-a为甘薯金脉病毒，1-a为阴性对照；

图2为敏感性测试结果；

图3为特异性检测结果；

图4为田间检测结果；

图5为引物筛选其中，从左到右依次为引物组合依次为SPG-F2/SPG-R1、SPG-F2/SPG-R2、SPG-F2/SPG-R3、SPG-F1/SPG-R1、SPG-F1/SPG-R2、SPG-F1/SPG-R3。

具体实施方式

本发明提供了一种检测甘薯金脉病毒的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下列实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中得到。

通用引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。ERA试剂盒购自苏州先达基因科技有限公司。提取病毒DNA试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1标准质粒的构建

1.引物的设计与合成

通过对GeneBank中甘薯金脉病毒基因进行序列比对，确定保守区域，设计1对通用引物，可对甘薯金脉病毒12个样品检测，扩增出PCR片段，用于标准质粒的构建；所有引物由上海生工生物技术有限公司合成。

其中，所述的一对通用引物序列如下所示

SPGvav-F：5’-GTCCCAATTGCTGCCCGA-3’(SEQ ID No.4)

SPGvav-R:5’-AAATAAGCCCTGCAACGCAGC-3’(SEQ ID No.5)

2.甘薯金脉病毒DNA的制备

参照病毒DNA提取试剂盒说明书，提取甘薯金脉病毒总DNA，获得DNA。

3.标准质粒的制备

以上述方法制备的DNA为模板，进行PCR扩增,反应体系为50μL:灭菌超纯水加至50μL。反应程序为95℃预变性3min，然后95℃20s，72℃30s，30个循环；72℃延伸2min，4℃保存。

PCR扩增产物为675bp，经1％琼脂糖凝胶电泳回收，克隆至pCE2-TA/Blunt-Zerovector载体连接，转化，蓝白斑筛选，挑取单个白色菌落，用引物SPGvav-F(SEQ ID No.4)和SPGvav-R(SEQ ID No.5)进行菌落PCR验证。将重组菌摇菌培养，试剂盒提取质粒DNA，送至上海生工生物工程有限公司测序，将测序正确的重组菌摇菌培养，试剂盒提取质粒DNA，获得标准质粒，将其命名为pSPG-CP.

实施例2快速检测甘薯金脉病毒RPA侧流层析试纸条检测方法的优化与建立

1.RPA引物与探针的设计

本实施例针对甘薯金脉病毒不同基因保守区设计了一系列的RPA引物与探针，具体见表1.

本发明所设计的引物及探针序列如表1所示。

表1

注：表1中的下游引物的5’端标记biotin。

2.利用RPA扩增反应筛选引物和探针

试剂盒提取DNA，以DNA为模板用于PRA方法扩增甘薯金脉病毒的不同基因序列。具体步骤：

(1)于离心管管底中分别加入各检测基因的上下游引物各2.1μL(10μmol/L),LF探针0.6μL(10μmol/L),溶解剂20μL(10μmol/L)，模板DNA2μL，用ddH2O补足到体积48μL，充分振荡混匀并短暂离心。

(2)对于每份样品，将48μL预混液转移到每管试纸扩增试剂中。振荡混匀直到扩增试剂重悬，并短暂离心。

(3)对于每份样本，在反应管盖上加2μL激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡并再次快速离心。

(4)将反应管放入合适的恒温仪(37℃)中孵育25分钟

反应结束后，再用横向流动试纸条进行检测或其他下游应用。

3.引物和探针的筛选结果

如图1所示，SPG-F1和SPG-R3引物探针组的检测组的RPA产物为阳性，试纸条在检测区和质控区出现条带，而阴性对照RPA产物在检测区未出现条带，仅质控区出现条带。

4.RPA扩增反应体系的优化

以提取病毒DNA为模板进行扩增。

首先，确定RPA-LFD方法的最佳反应温度，分别试验20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃不同反应温度，并且将孵育时间设定为30min。结果表明反应温度低于30℃时，在试纸条上没有出现试验条带，在30℃时出现较弱的试验条带，在35℃-45℃之间试验条带没有可观察的差异，结果表明该试验的最佳反应温度为35℃-45℃，因此，本发明选择37℃作为该方法的反应温度。

测试37℃条件下，不同孵育时间对于扩增结果的影响，该实验考察了10min、15min、20min、25min、30min、35min的结果，结果表明在扩增20min的时候，试验条带上出现微弱的条带，当反应时间在20min-35min之间时试验条带没有出现明显的差异，为了保证检测效果的稳定性，因此，选择25min作为该试验的孵育时间。

用该体系对对设计合成的两条上游引物、三条下游引物与探针组合进行评价，评价结果表明本发明(SPG-F1和SPG-R3)引物与探针组合能够产生最强的扩增信号，特异性最好，无任何杂带产生，结果见图5。

检测结果判定：一个样品在特定的条件下(37℃，25min)试纸条上控制线为阳性，并且检测线为阳性的样品为阳性样品；试纸条上控制线为阳性，而检测线为阴性的样品为阴性样品，如图1所示。

5.反应敏感性检测

在进行RPA-LFD方法的灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，稀释出浓度梯度为10¹⁰-10¹拷贝/反应的共计10个梯度作为模板。扩增反应在温度设定为37℃的PCR仪中进行，时间设定为25min，通过试纸条检测扩增结果。如图2所示，从该结果可以看出，该方法的敏感性为10⁵拷贝/反应。并且具有较广的检测范围，至少在10¹⁰-10⁵拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。

6.特异性的检测

在进行RPA-LFD方法的特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用模板分别为甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri lankan cassava mosaic virus,SLCMV)、番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl virus,TYLCV)甘薯C病毒(Sweet potato virus C,SPVC)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)。反应温度设为37°的PCR仪中进行，时间设定为25min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。结果表明，只有甘薯金脉病毒(Sweet potatogolden vein associated virus,SPGVAV)能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，该方法具有很好的特异性，结果如图3所示。

7.RPA-LFD方法检测田间样品

8.样本处理

9.采集感染疑似甘薯金脉病毒的甘薯叶片，将样品浸于含液氮的研砵中，反复研磨。

10.田间样品检测

待测样品均为经本实验室利用PCR方法检测过甘薯金脉病毒样本7份阳性样本和5份阴性样本。利用试剂盒快速提取总DNA。以提取的12份样本的DNA分别为模板，以标准质粒为阳性对照、ddH₂O为阴性对照。利用实施4组装的RPA侧流层析检测试剂盒进行检测。37℃25min.。取5μL的RPA扩增产物用295μL的产物稀释液稀释。侧流层析试纸条进行检测，若试纸条的检测区出现阳性检测条带，则待测样本中含有甘薯金脉病毒；若试纸条的检测区未出现阳性检测条带，待测样本中没有甘薯金脉病毒。

11.经RPA侧流层析检测试剂盒检测，呈阳性的7份，呈阴性的样本5份，说明样品中有7份为甘薯金脉病毒阳性，5份样品为甘薯金脉病毒阴性，即不含有甘薯金脉病毒如图4所示。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种检测甘薯金病毒的RPA引物和探针、试剂盒及检测方法

<130> MP21002263

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacttcgaga cagctatcgt gccctacact g 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccttgtaaa atccgagaca cagacaaacg 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgctgtccca attgctgccc gaagctatgt cccggtttca agaggc 46

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcccaattg ctgcccga 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaataagccc tgcaacgcag c 21

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtaagacgg aggctgaact tcgagacagc tatcg 35

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccatcttgaa ctcatagtcc tggaccttac aggg 34

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccttcccatc tatacccata gacttcacac aaa 33

Claims

1.一种检测甘薯金脉病毒的引物和探针，其特征在于，包括RPA上游引物、RPA下游引物和RPA探针，

所述RPA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述RPA下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述RPA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述RPA引物的下游引物的5’端标记biotin；

所述RPA探针的5’端标记荧光基团，3’端修饰阻断基团；所述RPA探针第31位的碱基进行脱碱基替换修饰；RPA探针5’端第31位的碱基进行脱碱基替换修饰。

3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述脱碱基替换修饰具体为将RPA探针5’端第31位的碱基替换为THF。

4.权利要求1～3任一项所述的引物和探针在制备检测甘薯金脉病毒的试剂盒中的应用。

5.一种检测甘薯金脉病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物和探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括RPA酶、溶解剂、荧光扩增试剂、无菌水、反应驱动液、标准质粒、侧流层析试纸条中的一种或多种。

7.一种甘薯金脉病毒的检测方法，其特征在于，利用权利要求1～4任一项所述的引物和探针或权利要求5～6任一项所述的试剂盒对待测样本的DNA进行RPA扩增，利用侧流层析试纸条对扩增产物进行检测，根据显色情况判定是否含有甘薯金脉病毒。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述试纸条的判定方法为：若试纸条的质控区和检测区均出现红色条带，则检测结果为阳性，表明待测样本中含有甘薯金脉病毒；若试纸条仅质控区出现红色条带，则检测结果是阴性，表明样本中不含有甘薯金脉病毒；若质控区和检测区均不出现红色条带或仅质控区出现红色条带，则检测结果无效。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增的程序为：37℃反应25min，4℃保持。