CN111705158A - 一种用于检测甘薯黑斑病菌的lfd-rpa可视化检测引物组及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测甘薯黑斑病菌的LFD‑RPA可视化检测引物组及检测方法，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。包括基于LFD‑RPA的可视化检测引物组：2条引物CfRPAF和CfLFD‑RPAR，以及1条探针CfLF‑Probe；并公开了检测方法和应用。本发明提供的检测引物组具有特异性强、结果可靠、灵敏度高、实用性好、操作简便快速的优势，结果肉眼直接可见，可以真正实现便捷式的现场快速检测。

Description

一种用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组及 检测方法

技术领域

本发明涉及农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，更具体的说是涉及一种用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组及检测方法。

背景技术

甘薯是我国主要的粮食作物之一，也是重要性轻工业原料和饲料作物。我国甘薯消费的形式除了加工淀粉、酒精外，鲜食用、叶菜用比例有所增加，国家发改委已将甘薯选定为燃料乙醇生产的首选非粮原料作物。甘薯作为新型能源作物，在保障国家粮食安全和能源安全中占有重要的地位。中国是世界上最大的甘薯生产国，每年种植面积约500万公顷，约占世界的53.5％；年生产量约1.1万吨，约占世界的82.2％。

甘薯黑斑病(sweep potato black rot)是甘薯栽培和贮藏中十分常见和危害十分严重的病害，又名黑疤病，在世界各甘薯产区均有发生，是甘薯生产上严重影响产量的三大病害之一。据统计，我国每年由该病造成约5％-10％的甘薯损失，严重时甚至可以达到20％-50％或更高的损失。其病原菌为甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis etHalsted)，该菌分布广泛、种群分化复杂，主要危害幼苗茎基部及块根组织，引起死苗、烂床、烂窖，对甘薯生产影响极大。甘薯品种间黑斑病抗性差异明显，高抗品种较少，而且在高抗的品种中，兼具高产、高干率的品种尚未发现，成为疫区产量提高的主要限制性因素之一。带有黑斑病菌的病薯内可产生甘薯黑疱霉酮(ipomeamarone)等呋喃萜类有毒物质，家畜食用后可引起中毒症状，此外，用病薯作发酵原料会毒害酵母菌和糖化酶菌，延缓发酵过程，降低酒精产量和质量，严重制约甘薯产业的发展。因此，研发出甘薯黑斑病的早期快速诊断方法并进行及时监测，对保障甘薯健康生产及食品安全至关重要。

传统的病害检测技术需要对病原菌进行分离培养，根据病原菌菌落的大小、形状、生物学特性等进行鉴定，耗时耗力，病害诊断需要积累丰富的实践经验，且一些病原真菌的外部形态特征十分复杂，既具相似性，又存在不稳定性，使检测难度大大增加。常规PCR、巢式PCR、LAMP和实时荧光定量PCR等分子技术已经应用于甘薯黑斑病菌的检测。但是，常规PCR、巢式PCR及实时荧光定量PCR检测技术需要专业仪器并由分子生物学专业实验人员操作，检测时间长，操作复杂。循环恒温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，简称LAMP)需针对靶基因的6个位点设计出4条引物，并且在较高的恒温条件下(60～65℃)保温30～90分钟进行反应，引物设计复杂，且易出现假阳性。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase ploymerase amplification,RPA)技术是在重组酶介导下模拟体内DNA的复制过程。重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物后，寻找并定位双链DNA同源序列，从而实现对模板上目标区域的指数扩增。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在37℃～42℃等温条件下，反应20min左右即可得到扩增产物。RPA可以与侧向流动层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。该方法检测时间短，5min左右就能目测结果，肉眼判读。

重组酶聚合酶核酸扩增技术(RPA)对样本要求低，可在25～45℃下15min内将痕量核酸模板扩增到可检测水平，与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，LFD)结合应用形成的LFD-RPA体系能实现肉眼直接判定结果，因而具有极为广泛的应用前景。

目前LFD-RPA检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，甘薯黑斑病菌的检测国内外均未见报道。

因此，提供一种基于LFD-RPA的可视化检测引物组及检测方法，用于检测甘薯黑斑病菌相关工作是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组及检测方法。专用于甘薯黑斑病菌的高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间甘薯黑斑病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30～35bp，探针序列的长度为46～52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选偶然得到。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组，包括2条引物CfRPAF和CfLFD-RPAR，以及1条探针CfLF-Probe，引物及探针序列分别为：

CfRPAF：5’-TTCTCACAACCAGGCAACACTCCTAATAAC-3’，SEQ ID NO.1；

CfLFD-RPAR：5’-TCTCTTGGCAATGACTCTTGTTGTAGATGG-3’，SEQ ID NO.2；

CfLF-Probe：5’-[FAM]CCCAGCAGCTCGGGCCTGACCCTAGTGGCAA[THF]AGGCACTTGCCTACC[C3 spacer]-3’

所述下游引物CfLFD-RPAR的5’端添加有Biotin，所述探针CfLF-Probe的5’端用FAM标记，3’端有C3-spacer修饰，且在探针中间距5’端31bpA和32bpA中间用THF修饰。

本发明还提供了一种利用上述用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组的检测方法，包括以下步骤：

(1)待检测样品基因组DNA的提取；

(2)LFD-RPA检测：以步骤(1)提取的DNA为模板，利用引物CfRPAF、CfLFD-RPAR及CfLF Probe探针进行扩增和温育；

(3)采用侧流层析试纸条进行检测；取步骤(2)的反应产物与HybriDetect AssayBuffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。

优选的：体系为50μl，包含29.5μl Rehydrationbuffer反应缓冲液，10μM CfRPAF和CfLFD-RPAR各2.1μl，探针10μM CfLF-Probe 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，RPA冻干酶粉5mg，2.5μl 280mM醋酸镁。

配置好后需颠倒混匀。

优选的：步骤(2)温育为：39℃温育5min，将反应管再次混匀，继续39℃温育20min。

优选的：步骤(3)反应产物和HybriDetect Assay Buffe体积比为1:10。

具体的，每10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetectAssay Buffer混合。

优选的：步骤(3)结果的评判标准：试纸条出现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有甘薯黑斑病菌；当试纸条只有质控区出现一条带颜色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有甘薯黑斑病菌。

本发明还提供了上述用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组在甘薯黑斑病菌的诊断、检测、鉴定中的应用。

本发明还提供了上述用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组在制备甘薯黑斑病菌的诊断、检测、鉴定试剂盒中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于LFD-RPA的可视化检测引物组及检测方法，取得的技术效果在于利用LF-RPA检测引物组及其检测方法用于生产实践中甘薯黑斑病菌感染的植株和土壤中甘薯黑斑病菌的快速、灵敏、准确的检测，同时能用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为甘薯黑斑病菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。具有以下优势：

特异性强：本发明基于甘薯黑斑病菌Tsr1基因序列设计了RPA反应所需特定引物和探针，该基因不仅高度保守，而且对其它病原菌高度特异；所设计引物与探针经大量实验筛选获得，扩增效果良好，条带特异性强，与其它病原菌无交叉反应。

结果可靠：本发明所设计出的LFD-RPA检测引物与探针，已经对源于中国福建、四川等地的甘薯黑斑病菌进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；

灵敏度高：LFD-RPA对甘薯黑斑病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到1pg，比常规PCR检测高1000倍。

实用性好：本发明所设计出的LFD-RPA引物与探针组合，用于带甘薯黑斑病菌的组织和土壤的高灵敏度快速检测，本方法的实用性强，能满足对带菌组织和土壤中存在的甘薯黑斑病菌进行快速检测和鉴定的需要；

操作简便快速：应用本发明方法，对甘薯黑斑病菌的组织和土壤进行检测可在30min内完成，且RPA核酸扩增是在恒温条件下进行，无需热循环仪器，再者RPA反应的最适温度在37℃-40℃之间，甚至常温下也可完成反应，极大的扩展了RPA适用范围，同时，其结果肉眼直接可见，可以真正实现便捷式的现场快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的甘薯黑斑病菌的LFD-RPA检测结果图。其中：第1管为阴性对照，第2管为含甘薯黑斑病菌DNA的阳性检测；C：质控线，T：检测线。

图2附图为本发明提供的甘薯黑斑病菌的LFD-RPA特异性检测结果图。其中：1为阴性对照，2、3、4为分别来源福建、四川、云南地区的甘薯黑斑病菌DNA；5-22为表1中编号4-21对应的其它真菌和卵菌菌株DNA；C：质控线，T：检测线。

图3附图为本发明提供的甘薯黑斑病菌的LFD-RPA灵敏性检测结果图。其中：1为阴性对照，2–10模板DNA浓度分别为100ng·μl-1,10ng·μl-1,1ng·μl-1,100pg·μl-1,10pg·μl-1,1pg·μl-1,100fg·μl-1，10fg·μl-1和1fg·μl-1；C：质控线，T：检测线。

图4附图为本发明提供的对发病植株检测结果图。其中：1为阴性对照，2为甘薯黑斑病菌DNA，3为健康组织，4-8分别为人工接种3d，6d，9d，12d，15d甘薯幼苗；C：质控线，T：检测线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组及检测方法。实施例中所需原料均为市售渠道采购，例如主要试剂：RPA扩增试剂盒TwistAmpTM nfo kits是TwistDX公司的产品，产品目录号为TANF002KIT，其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以冻干粉状态储存于RPA反应管中；检测用Milenia GenLineHybriDetect试剂盒包含侧流层析试纸条和HybriDetect Assay Buffer溶液为德国Milenia Biotec GmbH公司产品，货号041；未提及的方法均为实验室常规方法，例如检测引物与探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在此，不在一一赘述。

实施例1

甘薯黑斑病菌LFD-RPA检测引物组(引物与探针)的设计。

1.甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted)Tsr1基因的获得

(1)甘薯黑斑病菌基因组DNA的提取：

采用CTAB法提取甘薯黑斑病菌基因组DNA，具体过程如下：取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl 2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2％CTAB；100mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，pH 8.0；20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH 8.0；1.4mol/L NaCl)和90μl 10％SDS(十二烷基苯磺酸钠)后混匀，于55～60℃水浴1.5h，每10min振荡混匀一次，水浴1.5h后离心(12,000rpm)15min，取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)，离心(12,000rpm)5min，取上清液(水相)，加入与上清液等体积的氯仿抽提一次(12,000rpm)离心5min，吸上清(350μl)，加0.1体积(35μl)的3mol/L NaAC溶液和2体积(700μl)的冰无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700μl冰70％乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE(10mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/μl待用。

(2)PCR反应体系：50μl反应体系，包含2×Taq PCR Master Mix 25μl，通用引物Tsr1_1453for/Tsr1_2308rev(10μmol/L)各2μl，步骤(1)中提取的模板DNA 100ng，用无菌双蒸水补足至50μl。通用引物引自Sch mitt et al.2009，序列为Tsr1_1453for：5’-CCNGAYGARATYGARCTNCAYCC-3’，SEQ ID NO.4；Tsr1_2308rev：5’-CTTRAARTANCCRTGNGTNCC-3’，SEQ ID NO.5，其中N＝A,G,C,T；R＝A,G；Y＝C,T；

(3)PCR反应体系：步骤(2)的反应体系置于下列条件中反应，94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

(4)将步骤(3)反应所得产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，得到Tsr1基因的核苷酸序列(5’-ATTGAACTCTCACCCAACGTCCTAGCCAGGGAGCGTTTGTCTCGATACCGTGGTCTCAAGTCCCTGCGTACCAGTGAGTGGGTTGTCGATGAGGACCGTGCCCACGAGCCTGAAGACTGGCGTCGTCTATTGCGTGTCTCTGACTACCAAGGCACGAGATCCCGCGTGACTCGTGAGGCTCTTGTTGGCGGCGTGGCCCCAGGCACACGAGTCAGTGTGTACATCAGTGGCGCTATTCCAGAGCATGTTAAGACGCTCCCGAGCGCTGCTCTGCACCCTGTGACGCTCTTCTCGCTGCTGCGCCACGAACACAAGCAGACGGTTTCCAATGTGCTGATTAATCTCAGCTCCGAATACCCAACTTCGATCAAGTCCAAGGAGGAACTGATTATGCAATGCGGCGCTCGCCGTTTTATTATCAAGCCTCTATTCTCACAACCAGGCAACACTCCTAATAACGTGCACAAATATGCCCGGTATCTACATCCAGGACAAAGCGCCGTGGCTACCTTCACAGGGCCTGTCACCTGGGGTCCTGTGCCAGCATTGTTCTTTAAGCGCACGGCCGATGTAGAGAACGTGGCTGAAAGCTCAGCTATCCCCAGCAGCTCGGGCCTGACCCTAGTGGCAACAGGCACTTGCCTACCACCATCTACAACAAGAGTCATTGCCAAGAGAGTAATTCTCACTGGCCACCCGTACCATATTCACAAGCGAGTGGTAACCATCCGCTACATGTTCTTCAACAAGGAGGATGTGGAGTGGTTCAAAGCCCTGCCGTTGTGGACTAAGAGAGGCCGAACTGGTTTCGTCAAGGAAAC-3’SEQ ID NO.6)。

2.甘薯黑斑病菌LFD-RPA检测引物与探针的设计

RPA引物长度一般为30至35个核苷酸，扩增片段大小在100～400bp之间，根据测序所得Tsr1基因的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0软件设计RPA上下游引物对并进行筛选，得到扩增效率高、灵敏度和特异性最好的引物对。随后，对筛选得到的最佳引物进行修饰，在下游引物的5’端加入一个生物素(Biotin)标记位点。筛选得到的最佳引物序列如下：

CfRPAF：5’-TTCTCACAACCAGGCAACACTCCTAATAAC-3’，SEQ ID NO.1；

CfLFD-RPAR：5’-[Biotin]TCTCTTGGCAATGACTCTTGTTGTAGATGG-3’，SEQ ID NO.2；

探针长度设计原则：一般为46～52bp，并且5’端标记FAM荧光基团，距5’端最短30bp、3’端最远15bp处碱基由四氢吠喃(THF)替代。

参考上述原则设计探针，5’端用FAM标记，3’端有C3-spacer修饰，且在探针中间距5’端31bpA和32bpA中间用THF修饰。探针序列如下：

CfLF-Probe：5’-[FAM]CCCAGCAGCTCGGGCCTGACCCTAGTGGCAA[THF]AGGCACTTGCCTACC[C3 spacer]-3’。

实施例2

LFD-RPA引物与探针组合对甘薯黑斑病菌的可视化检测。

(1)甘薯黑斑病菌基因组DNA的提取同实施例1提取过程。

(2)LFD-RPA反应体系：反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液(Rehydrationbuffer)，10μM CfRPAF和CfLFD-RPAR各2.1μl，探针10μM CfLF-Probe 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到5mg RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁(MgAc)并颠倒混匀；将模板DNA替换为等量的ddH₂O做阴性对照。

(3)LFD-RPA反应：步骤(2)的反应体系在39℃温育5min，将反应管再次混匀，继续39℃温育20min；

(4)结果检测：取10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。试纸条出现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有甘薯黑斑病菌；当试纸条只有质控区出现一条带颜色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有甘薯黑斑病菌。

本实施例的检测结果见图1。图1可视化检测结果表明：实验组以甘薯黑斑病菌基因组DNA为模板，试纸条出现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，为阳性；而对照组以ddH₂O为模板，只在质控区出现一条带颜色条带，检测区没有条带，为阴性。说明本发明的LFD-RPA检测引物与探针组合能够用于甘薯黑斑病菌的可视化检测。

实施例3

LFD-RPA引物与探针组合对甘薯黑斑病菌的特异性扩增。

以我国福建、四川、云南的3株甘薯黑斑病菌和18种其它病原真菌及卵菌为供试材料，对检测引物与探针的特异性进行LFD-RPA验证。

(1)供试菌株：

(2)供试菌株基因组DNA的提取：同实施例1提取过程。

(3)LFD-RPA反应体系：反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液(Rehydrationbuffer)，10μM CfRPAF和CfLFD-RPAR各2.1μl，探针10μM CfLF-Probe 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁(MgAc)并颠倒混匀；将模板DNA替换为等量的ddH₂O做阴性对照。

(3)LFD-RPA反应：步骤(2)的反应体系在39℃温育5min，将反应管再次混匀，继续39℃温育20min。

(4)结果检测：取10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。试纸条出现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有甘薯黑斑病菌；当试纸条只有质控区出现一条带颜色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有甘薯黑斑病菌。

本实施例的检测结果见图2。检测的特异性：除了来自我国福建、四川、云南的3株甘薯黑斑病菌检测结果可观察到试纸条出现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区外，其它18种病原真菌菌株检测试纸条只有质控区出现一条带颜色条带，检测区没有条带(结果见图2)，说明此检测引物与探针组合具有很强的特异性。

实施例4

LFD-RPA引物与探针组合对甘薯黑斑病菌的灵敏性检测。

(1)采用10倍浓度系列稀释法将提取的甘薯黑斑病菌DNA稀释成100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl DNA，共9个不同浓度梯度。

(2)LFD-RPA反应体系：反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液(Rehydrationbuffer)，10μM CfRPAF和CfLFD-RPAR各2.1μl，探针10μM CfLF-Probe 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁(MgAc)并颠倒混匀；将模板DNA替换为等量的ddH₂O做阴性对照。

(3)LFD-RPA反应：步骤(2)的反应体系在39℃温育5min，将反应管再次混匀，继续39℃温育20min。

(4)结果检测：取10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。试纸条出现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有甘薯黑斑病菌；当试纸条只有质控区出现一条带颜色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有甘薯黑斑病菌。

本实施例的检测结果见图3。图3结果表明50μl体系中含有1pg/μl的甘薯黑斑病菌DNA的试纸条出现两条带颜色条带，呈阳性反应，表明LFD-RPA检测甘薯黑斑病菌DNA的灵敏度可达1pg/μl，具有很高的灵敏度。

实施例5

发病组织中甘薯黑斑病菌的检测。

(1)样品采集：采用甘薯黑斑病菌分生孢子液人工接种甘薯幼苗。

(2)甘薯黑斑病菌基因组DNA提取：发病植物组织采用实施例1的NaOH快速裂解法提取甘薯黑斑病菌基因组DNA。

(3)LFD-RPA反应体系：反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液(Rehydrationbuffer)，10μM CfRPAF和CfLFD-RPAR各2.1μl，探针10μM CfLF-Probe 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁(MgAc)并颠倒混匀；将模板DNA替换为等量的ddH₂O做阴性对照。

(4)LFD-RPA反应：步骤(3)的反应体系在39℃温育5min，将反应管再次混匀，继续39℃温育20min。

(5)结果检测：取10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。试纸条出现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有甘薯黑斑病菌；当试纸条只有质控区出现一条带颜色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有甘薯黑斑病菌。

(6)本实施例的检测结果见图4；图4结果表明，人工接种甘薯幼苗3d，6d，9d，12d，15d的样品及阳性对照RPA检测试纸条呈现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，结果为阳性，表明样本中含有甘薯黑斑病菌；健康组织及阴性对照只有质控区出现一条带颜色条带，证明了甘薯黑斑病菌LFD-RPA检测方法检测结果准确可靠，具有很强的实用性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组及检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttctcacaac caggcaacac tcctaataac 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctcttggca atgactcttg ttgtagatgg 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccagcagct cgggcctgac cctagtggca aaggcacttg cctacc 46

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccngaygara tygarctnca ycc 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttraartan ccrtgngtnc c 21

<210> 6

<211> 821

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attgaactct cacccaacgt cctagccagg gagcgtttgt ctcgataccg tggtctcaag 60

tccctgcgta ccagtgagtg ggttgtcgat gaggaccgtg cccacgagcc tgaagactgg 120

cgtcgtctat tgcgtgtctc tgactaccaa ggcacgagat cccgcgtgac tcgtgaggct 180

cttgttggcg gcgtggcccc aggcacacga gtcagtgtgt acatcagtgg cgctattcca 240

gagcatgtta agacgctccc gagcgctgct ctgcaccctg tgacgctctt ctcgctgctg 300

cgccacgaac acaagcagac ggtttccaat gtgctgatta atctcagctc cgaataccca 360

acttcgatca agtccaagga ggaactgatt atgcaatgcg gcgctcgccg ttttattatc 420

aagcctctat tctcacaacc aggcaacact cctaataacg tgcacaaata tgcccggtat 480

ctacatccag gacaaagcgc cgtggctacc ttcacagggc ctgtcacctg gggtcctgtg 540

ccagcattgt tctttaagcg cacggccgat gtagagaacg tggctgaaag ctcagctatc 600

cccagcagct cgggcctgac cctagtggca acaggcactt gcctaccacc atctacaaca 660

agagtcattg ccaagagagt aattctcact ggccacccgt accatattca caagcgagtg 720

gtaaccatcc gctacatgtt cttcaacaag gaggatgtgg agtggttcaa agccctgccg 780

ttgtggacta agagaggccg aactggtttc gtcaaggaaa c 821

Claims (8)

1.一种用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组，其特征在于：包括2条引物CfRPAF和CfLFD-RPAR，以及1条探针CfLF-Probe，引物及探针序列分别为：

CfRPAF：5’-TTCTCACAACCAGGCAACACTCCTAATAAC-3’，SEQ ID NO.1；

CfLFD-RPAR：5’-TCTCTTGGCAATGACTCTTGTTGTAGATGG-3’，SEQ ID NO.2；

CfLF-Probe：5’-[FAM]CCCAGCAGCTCGGGCCTGACCCTAGTGGCAAAGGCACTTGCCTACC[C3spacer]-3’，SEQ ID NO.3；

所述下游引物CfLFD-RPAR的5’端用Biotin标记，所述探针CfLF-Probe的5’端用FAM标记，3’端有C3-spacer修饰，且在探针中间距5’端31bpA和32bpA中间用THF修饰。

2.一种利用权利要求1所述用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待检测样品基因组DNA的提取；

(2)LFD-RPA检测：以步骤(1)提取的DNA为模板，利用引物CfRPAF、CfLFD-RPAR及CfLFProbe探针进行扩增和温育；

(3)采用侧流层析试纸条进行检测；取步骤(2)的反应产物与HybriDetect AssayBuffer混合，然后将试纸条置于混合液中，室温静置5min后观察结果。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，反应体系为50μl，包含29.5μlRehydrationbuffer反应缓冲液，10μM CfRPAF和CfLFD-RPAR各2.1μl，探针10μM CfLF-Probe 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，RPA冻干酶粉5mg，2.5μl 280mM醋酸镁。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述温育为：39℃温育5min，将反应管再次混匀，继续39℃温育20min。

5.如权利要求4所述的检测甘薯黑斑病菌的方法，其特征在于，步骤(3)所述反应产物和HybriDetectAssay Buffe体积比为1:10。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)结果的评判标准：试纸条出现两条带颜色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有甘薯黑斑病菌；当试纸条只有质控区出现一条带颜色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有甘薯黑斑病菌。

7.权利要求1所述用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组在甘薯黑斑病菌的诊断、检测、鉴定中的应用。

8.权利要求1所述用于检测甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可视化检测引物组在制备甘薯黑斑病菌的诊断、检测、鉴定试剂盒中的应用。

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