CN107868845A - 一种甘薯黑斑菌巢式pcr检测引物及其分子检测方法 - Google Patents

一种甘薯黑斑菌巢式pcr检测引物及其分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘薯黑斑病菌巢式PCR检测引物及其快速检测方法，专用于甘薯黑斑病菌特异检测。主要采用设计了一套甘薯黑斑病菌巢式PCR引物（序列如SEQ ID NO.1‑4所示），经过两轮PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到出现大小为340 bp单一条。所发明的巢式PCR引物可被用于生产实践中甘薯黑斑病菌感染的植株和储藏期甘薯带菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为甘薯黑斑病菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种甘薯黑斑菌巢式PCR检测引物及其分子检测方法
技术领域
本发明涉及甘薯黑斑病菌巢式PCR检测引物及其分子检测方法，专用于甘薯黑斑病菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间和储藏期甘薯黑斑病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
背景技术
甘薯是世界上重要的粮食、饲料和工业原料用作物，在世界粮食生产中总产排列第七位。中国是世界上最大的甘薯生产国，每年甘薯种植面积约500 万hm2，约占世界的53.5%；年生产量约1.1 万吨，约占世界的82.2%。甘薯黑斑病由甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted) 侵染甘薯引起，是严重危害甘薯生产的三大病害之一，每年由于该病造成的产量损失达5%~10%，严重时可达20%～50%。此外，病薯还可产生甘薯黑斑霉酮(ipomeama rone)和甘薯黑斑霉二酮(ipomeanine)等有毒物质，人和家畜食用后可引起中毒，甚至死亡。因此，对甘薯黑斑病早期快速、准确的鉴定是十分必要的。
传统甘薯黑斑病菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而其它鉴定方法目前未见报道。因此，建立一套快速、灵敏、准确的甘薯黑斑病菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。
PCR技术具有快速、灵敏、准确等优点，已成为当前植物病原检测的主要手段。PCR技术主要有：普通PCR、巢式PCR与实时荧光定量PCR。普通PCR虽然其成本较低，但是其灵敏度较差，容易在大规模检测中出现一些漏检；实时荧光定量PCR具有高的灵敏度，但是其操作比较复杂且需要专门的仪器和试剂耗材，其成本较高，不适用于田间大规模检测；巢式PCR兼具两者的优点，其灵敏度可以达到普通PCR的1000倍，且其操作和成本与普通PCR差异不大，因此，巢式PCR可以满足对甘薯黑斑病菌快速、灵敏、准确、稳定的检测。此套检测技术可应用于甘薯黑斑菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供技术支持。
发明内容。
本发明的目的是针对现有技术中甘薯黑斑菌的生物学检测方法所需周期长，并且目前并没有相关分子检测技术报道的问题，提供一种甘薯黑斑菌的巢式PCR检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的甘薯黑斑病菌的快速检测方法。
实现本发明的目的包括下列步骤：
1．巢式PCR引物的设计
我们从GenBank中下载甘薯黑斑病菌全基因组序列，然后以已报道物种的Tsr1基因序列为种子序列进行BLAST，在甘薯黑斑病菌基因组中鉴定Tsr1基因。采用Primer Premier 6软件设计一套巢式PCR检测引物，包括2条外引物(CfTsr1-F和CfTsr1-R) 和 2条内引物(CfTsr1INF和CfTsr1INR)，引物序列分别为：
CfTsr1-F：ACTCTCACCCAACGTCCTAGC；
CfTsr1-R：TTGTTGTAGATGGTGGTAGGCA；
CfTsr1INF：CGTCGTCTATTGCGTGTCTCTG；
CfTsr1INR：GGAGTGTTGCCTGGTTGTGAG；
2．甘薯黑斑病菌快速检测体系的建立
巢式PCR检测体系：第一轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1-F与CfTsr1-R各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，10-150 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃10min；16℃ forever。第二轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1INF与CfTsr1INR各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，取1 μl第一轮PCR产物作为DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；16℃ forever。
所述的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法。所述琼脂糖凝胶电泳法：取5 μl PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现大小为340 bp单一条带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
该方法可用于带菌的植株和薯块的高灵敏度快速检测。建立甘薯黑斑病菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于甘薯黑斑病菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。
本发明的关键性技术是甘薯黑斑病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证甘薯黑斑病菌的特异引物序列，本发明以我国福建的甘薯黑斑病菌和21种其它病原真菌或卵菌为供试材料，采用CTAB法提取甘薯黑斑病菌的DNA。
具体方法如下：将少许菌丝置于研钵中，加液氮研磨至粉末状，加少许于1.5ml的EP管中；加入900ul 2%预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液（提取液的配方为：2%CTAB；100 mmol/L Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐），PH 8.0；20 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠），pH 8.0；1.4 mol/L NaCl）和9ul的β—巯基乙醇及90ul的10%的SDS；混匀后放入60℃水浴1h，期间每10min上下摇晃一次，然后12000rpm，离心10min；转移上清至新的1.5ml的离心管中（约700ul），加与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1），颠倒使其混匀，12000rpm离心10min；转移上清至新的1.5ml的离心管中（约600ul），加与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒使其混匀，12000rpm离心10min；转移上清至新的1.5ml的离心管中，加2倍体积的冰无水乙醇和1/10体积的3M NaAC，充分混匀，-20℃沉淀1小时以上，12000rpm离心10min；弃上清，用75%的乙醇洗两遍，吸干液体；随后加50ul的ddH2O+1µl RNase，在37℃酶解60min，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100 ng/μl待用。
经对供试甘薯黑斑病菌菌株和20株其它病原菌的特异性进行巢式PCR验证。
巢式PCR检测体系：第一轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1-F与CfTsr1-R各1 µl（10µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，10-150 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃10min；16℃ forever。第二轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1INF与CfTsr1INR各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，取1 μl第一轮PCR产物作为DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；16℃ forever。
除了来自我国福建的甘薯黑斑病菌的琼脂糖凝胶电泳检测出现大小约为340bp的单一条带外，检测了21种其它病原菌的琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。这说明该引物可被用于生产实践中发病或带菌组织中甘薯黑斑病菌快速可靠的检测和鉴定。
①当在用于甘薯组织中存在甘薯黑斑病菌时，采用NaOH快速裂解法提取甘薯黑斑病菌的DNA，具体过程如下：(1)将甘薯病组织或薯块洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病组织加入10 μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5 min；(3)取上清20 μl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1 μl原液、 10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。
②当在用于甘薯苗床土壤中存在甘薯黑斑病菌时，采用土壤DNA提取法提取土壤中甘薯黑斑病菌的DNA。具体方法如下：取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5 ml 离心管中，每管加入500 μl 0.4% 脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000 rpm离心15 min。取上清加入等体积蛋白酶K 缓冲液，加终浓度为10 µg/ml蛋白酶K，55℃水浴1-3 h。水浴结束后，加入1/2体积的7.5 M NH4AC溶液，上下颠倒混匀。12000 rpm离心15 min。吸上清加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀（沉淀时间1.5h）。沉淀结束后，12000 rpm离心15 min。用70%乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用10 μl TE（或无菌超纯水）溶解，−20℃保存备用。
按如下巢式PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测：
①巢式PCR反应体系：第一轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1-F与CfTsr1-R各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，10-150 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃10min；16℃ forever。第二轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1INF与CfTsr1INR各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，取1 μl第一轮PCR产物作为DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；16℃ forever。
②取5 μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现大小约为340 bp单一条带，即可判断所述的组织或土壤中存在甘薯黑斑病菌；否则所述的组织或土壤中未存在甘薯黑斑病菌。
本发明有益效果：本发明方法适用于发病组织或土壤中甘薯黑斑病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中甘薯黑斑病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1、结果可靠：本发明所设计出的巢式PCR检测引物，已经对源于中国福建、云南、四川等地的甘薯黑斑病菌和带甘薯黑斑病菌的土样、植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；
2、特异性强：本发明所采用的巢式PCR检测引物是针对甘薯黑斑病菌Tsr1基因序列中4个不同区域设计出4条特异性引物，并且对22种不同病原菌进行验证，只有甘薯黑斑病菌可以扩增出特异条带，具有针对甘薯黑斑病菌的特异性。
3、灵敏度高：巢式PCR对甘薯黑斑病菌的的检测灵敏度在DNA水平上可达到1.86pg，比常规PCR检测高1000倍。
4、实用性好：本发明所设计出的巢式PCR引物，可用于带甘薯黑斑病菌的组织和土壤的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织和土壤中存在的甘薯黑斑病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。
附图说明
图1为本发明甘薯黑斑病菌的特异巢式PCR的琼脂糖凝胶电泳图。其中： M：DL2000 DNA marker，1：甘薯黑斑病菌，2：龙眼灰斑病菌，3：番茄早役病菌，4：炭疽菌，5：香蕉枯萎菌，6：黄瓜枯萎病菌，7：花生黄曲霉，8：葡萄黑曲霉，9：瓜果腐霉，10：大豆丝核菌，11：毛豆丝核菌，12：立枯丝核菌，13：荔枝霜疫霉，14：草莓疫霉，15：细交链霉，16：致病疫霉，17：西瓜疫霉，18：辣椒疫霉，19：大豆疫霉，20：拟盘多毛孢，21：炭角菌属，22：核盘菌，23：阴性对照。
图2为本发明甘薯黑斑病菌的巢式PCR灵敏性检测结果图。图2中A表示常规PCR灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳检测结果；图2中B表示巢式PCR灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道11为阴性对照，泳道1–10模板浓度分别为150 ng/µl, 30 ng/µl, 6 ng/µl, 1.2 ng/µl, 240 pg/µl, 48 pg/µl, 9.3 pg/µl, 1.86pg/µl, 372 fg/µl, 74.5 fg/µl（见实施例2）。
图3为本发明对发病植株的检测结果图。其中：泳道1为阴性对照；泳道2为阳性对照，泳道3实验室接种甘薯黑斑病菌甘薯，4、5、6为带病甘薯组织，泳道7、8为健康组织；泳道M为DL 2000 DNA marker（见实施例3）。
具体实施方式
本发明的技术内容包括甘薯黑斑病菌的巢式PCR检测引物，巢式PCR引物及其序列分别为：
CfTsr1-F：ACTCTCACCCAACGTCCTAGC；
CfTsr1-R：TTGTTGTAGATGGTGGTAGGCA；
CfTsr1INF：CGTCGTCTATTGCGTGTCTCTG；
CfTsr1INR：GGAGTGTTGCCTGGTTGTGAG；
利用巢式PCR引物检测甘薯黑斑病菌经琼脂糖凝胶电泳出现大小约为340 bp单一条带。
主要试剂：2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技(北京)有限公司；DNAmarker 购自宝生物工程大连有限公司；其余试剂均购自生工生物（上海）技术有限公司。引物由生工生物（上海）技术有限公司合成。
实施例1：巢式PCR引物对甘薯黑斑病菌的特异性扩增
1．甘薯黑斑病菌的巢式PCR特异检测
①巢式PCR反应体系：第一轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1-F与CfTsr1-R各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，10-150 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃10min；16℃ forever。第二轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1INF与CfTsr1INR各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，取1 μl第一轮PCR产物作为DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；16℃ forever。
②取5 μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现大小约为340 bp单一条带，如果仅有甘薯黑斑病菌出现条带则特异性良好，否则，其特异性差。
2．检测结果
检测的特异性：除了甘薯黑斑病菌PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现大小约为340 bp单一条带外，检测了21种真菌和卵菌菌株，其琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带（结果见图1），说明此引物具有很强的特异性。
实施例2：巢式PCR引物对甘薯黑斑病菌的灵敏性检测
1．甘薯黑斑病菌的巢式PCR灵敏性检测
采用5倍浓度系列稀释法将提取的甘薯黑斑病菌DNA稀释成150 ng/µl, 30 ng/µl, 6ng/µl, 1.2 ng/µl, 240 pg/µl, 48 pg/µl, 9.3 pg/µl, 1.86 pg/µl, 372 fg/µl, 74.5fg/µl共10个不同浓度梯度。
①巢式PCR反应体系：第一轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1-F与CfTsr1-R各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl， DNA模板 1 μl，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃10min；16℃ forever。第二轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1INF与CfTsr1INR各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，取1 μl第一轮PCR产物作为DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；16℃ forever。
②取5 μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小约为340 bp单一条带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果：甘薯黑斑病菌巢式PCR灵敏性检测，琼脂糖凝胶电泳出现大小约为340 bp单一条带，检测灵敏度可达1.86 pg（见图2 B）。
实施例3：发病组织中甘薯黑斑病菌的检测。
1．样品采集：植物组织品采自福建福州市农贸市场。
2．DNA提取及检测
发病甘薯组织采用NaOH快速裂解法提取甘薯黑斑病菌DNA。
按下述方法进行巢式PCR检测：
①巢式PCR反应体系：第一轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1-F与CfTsr1-R各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，DNA模板 1 μl，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃ 10min；16℃ forever。第二轮PCR 20 μl反应体系中CfTsr1INF与CfTsr1INR各1 µl（10 µmol/L），2×Taq PCR Master Mix 10 μl，取1 μl第一轮PCR产物作为DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；16℃ forever。
②取5 μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小约为340 bp单一条带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
3．检测结果
如图3所示，发病组织中感染甘薯黑斑病菌，琼脂糖凝胶电泳出现大小约为340 bp单一条带，而健康组织琼脂糖凝胶电泳检测中则未出现条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种甘薯黑斑菌巢式PCR检测引物及其分子检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actctcaccc aacgtcctag c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttgttgtaga tggtggtagg ca 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtcgtctat tgcgtgtctc tg 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggagtgttgc ctggttgtga g 21

Claims (4)

1.一种甘薯黑斑病菌巢式PCR检测引物，其特征在于：所述引物包括2条外引物CfTsr1-F、CfTsr1-R 和 2条内引物CfTsr1INF、CfTsr1INR，序列如下：
CfTsr1-F：ACTCTCACCCAACGTCCTAGC；
CfTsr1-R：TTGTTGTAGATGGTGGTAGGCA；
CfTsr1INF：CGTCGTCTATTGCGTGTCTCTG；
CfTsr1INR：GGAGTGTTGCCTGGTTGTGAG。
2.一种甘薯黑斑病菌的巢式PCR分子检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的巢式PCR引物进行巢式PCR反应， 第一轮PCR 20 μl反应体系中10 µmol/L CfTsr1-F与CfTsr1-R各1 µl，2×Taq PCR Master Mix 10 μl，10-150 ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃ 10min；16℃ forever；第二轮PCR 20 μl反应体系中10 µmol/L CfTsr1INF与CfTsr1INR各1 µl，2×Taq PCR Master Mix 10 μl，取1 μl第一轮PCR产物作为DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；PCR反应程序为：95℃ 预变性 3min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃30s，35个循环；72℃ 10min；16℃ forever。
3.根据权利要求2所述的甘薯黑斑病菌的巢式PCR分子检测方法，其特征在于：取5 μl第二轮扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现大小为340 bp单一条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。
4.如权利要求1所述的引物在甘薯黑斑病菌早期诊断、监测和鉴定中的应用。
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