CN105755157A - 一种水稻稻瘟病菌的pcr检测引物组及其检测方法 - Google Patents

一种水稻稻瘟病菌的pcr检测引物组及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组及其检测方法。根据水稻稻瘟病菌的DNA设计了一对PCR特异性扩增引物：上游引物HMG?F，序列如序列表SEQ ID No.1所示；下游引物HMG?R，序列如序列表SEQ ID No.2所示。经过PCR扩增可在水稻稻瘟病菌纯DNA及带菌的植株中特异性地扩增出长度为356bp的基因产物。本发明的特异性检测引物及其用法可被用于水稻生产中水稻稻瘟病菌感染的植株的快速检测，同时可用于田间水稻稻瘟病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为由Magnaporthe grisea引起的水稻稻瘟病的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)PCR检测引物组及其检测方法。
背景技术
水稻是中国重要的粮食作物之一，水稻的高产稳产直接关系到国家的安全与稳定。稻瘟病是长期威胁水稻生产的主要因素，也是影响水稻高产和稳产的限制性因素之一。该病不仅影响产量而且影响品质，具有传播范围广，流行速度快和大区流行的特点。在适宜条件下，短时间即可造成大面积灾害。每年均有不同程度的发生，流行年份发病地区一般减产l0％～20％，严重时可减产40％～50％，如不及时防治，局部田块甚至颗粒无收，所以稻瘟病的防治受到人们的普遍重视和广泛关注。选育和推广抗病品种是控制该病的首要措施，但由于近年来单一品种种植面积过大，病菌生理分化明显，变异速度快，品种布局不合理，栽培措施不当，导致抗病品种在3-5年内丧失抗病性，致使稻瘟病的发生有逐年加重的趋势，给水稻生产造成极大的损失。在水稻生产中，化学防治是一种主要的防治措施，稻瘟病的早期正确识别诊断是化学防治的基础。传统的稻瘟病菌鉴定方法主要通过形态学，如菌丝及孢子的形态来鉴定，但形态学鉴定方法繁琐，病菌分离需要周期长，易污染，并且需要丰富的实践经验。随着分子生物学技术的迅速发展，分子标记已成为稻瘟病菌监测的主要手段，与常规的形态鉴定法相比，分子标记具有快速准确等优点，为稻瘟病快速诊断鉴定提供了一种新方法。
发明内容
针对现有技术中水稻稻瘟病菌的生物学检测方法所需周期时间长的不足之处，本发明的目的在于提供一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组及其检测方法，用于带菌的水稻植株高灵敏度快速分子检测。
本发明的目的通过如下技术手段实现：一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组，上游引物HMG-F，序列如序列表SEQ ID No.1所示；下游引物HMG-R，序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、如上所述的一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组，对水稻稻瘟病菌特异性扩增出356bp的产物。
2、如上所述的一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组，在水稻稻瘟病菌监测及诊断鉴定方面的应用。
3、如上所述的一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组，PCR检测方法的检测体系如下所示：94℃预变性5min，94℃变性60sec，52℃退火60sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min。
4、如上所述的一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组的PCR检测方法，所述的混合液的成分如下所示：
本发明的水稻稻瘟病菌特异分子检测引物组以及方法灵敏度高、易于操作、结果可靠、特异性强，该方法可用于带菌的水稻植株高灵敏度快速分子检测，该发明对于水稻稻瘟病菌引起病害显症之前的早期监测及病害的防治最佳时期的确定都具有重要的指导意义，为制定稻瘟病防治策略提供科学依据。
附图说明
图1为本发明所要检测的水稻稻瘟病病菌的特异性PCR扩增图；M：DNAMaker 2000；泳道1：水稻稻瘟病菌MO-41(M.oryzae)；泳道2：水稻稻瘟病菌菌株MO-17(M.oryzae)；泳道3：水稻稻瘟病菌菌株MO-01(M.oryzae)；泳道4：水稻褐变穗病菌(A.alternate)；5.水稻恶苗病菌(F.moniliforme)；泳道6：水稻稻曲病菌(U.virens)；泳道7：水稻立枯病菌(F.oxysporium)；泳道8：水稻立枯病菌(F.graminearum)；泳道9：水稻立枯病菌(R solani)；泳道10：水稻立枯病菌(F.equiseti)；泳道11：水稻纹枯病菌(R.solani)；泳道12：水稻胡麻斑病菌Bipolaris oryzae；泳道13：水稻叶鞘腐败病菌Sarocladium oryzae；泳道14：无菌水；
图2为本发明水稻稻瘟病病菌的灵敏性检测扩增结果图；M：DNA Maker2000；泳道1～8：模板DNA浓度分别为10-3ng/μL、10-2ng/μL、10-1ng/μL、0.5ng/μL、1.0ng/μL、10ng/μL、102ng/μL、103ng/μL；泳道9：无菌水。
图3为本发明发病叶片的检测结果图；M：DNA Maker 2000；泳道1～5：接种4h、8h、12h、18h、24h的水稻发病叶片；泳道6：无菌水。
具体实施方式
实施例1
本实施例的技术内容包括水稻稻瘟病病菌的特异性检测引物，根据水稻稻瘟病病菌(Magnaporthe oryzae)核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，设计了对水稻稻瘟病病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物组，即特异性分子检测引物序列为：
上游引物HMG-F:5'-TCCACCCCTGTGACATAACC-3'
下游引物HMG-R:5'-TCAGTGTA CCG ACGAGCC-3'
水稻稻瘟病病菌特异性分子检测方法的建立：
1.当用于水稻植株中可能存在水稻稻瘟病病菌检测时：
(1)采用CTAB法提取水稻植株DNA。
具体步骤：①将1g水稻植物组织在液氮中研磨，然后装入2.0mL离心管中；②加入65℃预热的2×CTAB提取缓冲液700μL，颠倒混匀充分后，放入65℃恒温水浴锅中，保温60min，每10min上下颠倒混匀一次；③加入等体积(约700μL)的氯仿/异戊醇(24：1)，室温下12000rpm离心15min；④将上清液转入新的2.0mL的离心管中，加入等体积(约700μL)的氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀，室温12000rpm离心10min；⑤取上清液，重复④操作1次；⑥取上清液，转入新的2.0mL离心管中，加入等体积(约700μL)异丙醇沉淀缓冲液，混匀，－20℃下放置30min，观察沉淀生成，可延长放置时间，使沉淀增加；⑦12000rpm离心10min，去上清液，用70％乙醇洗3次，将沉淀吹干。每管加25μL TE，室温下溶解。
(2)PCR扩增：PCR反应体系25μL，包括DNA模板(100ng/μL)2μL，10×PCR buffer 2.0μL，HMG-F Primer(10μM)0.6μL，HMG-R Primer(10μM)0.6μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，Mg2+(25mM)3.0μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O补齐至25μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性60sec，52℃退火60sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min。
2.菌丝体是否为水稻稻瘟病菌判定时：
(1)采用CTAB法提取水稻稻瘟病病菌菌丝体DNA。
具体步骤：①搜集病菌菌丝，吸干后转移到研钵中，用液氮研磨至粉末状。②称取大约100mg冷冻干燥后的菌丝粉末迅速转入2.0mL的离心管中，加入2×CTAB提取缓冲液600μL，颠倒混匀充分后，放入65℃恒温水浴锅中，保温60min，每10min上下颠倒混匀一次；③加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，室温下14000rpm离心5min；④将上清液转入新的2.0mL的离心管中，加入等体积(约700μL)的氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀，室温12000rpm离心10min；⑤取上清液，重复④操作1次；⑥取上清液，转入新的2.0mL离心管中，加入等体积(约700μL)异丙醇沉淀缓冲液，混匀，－20℃下放置30min，观察沉淀生成，可延长放置时间，使沉淀增加；⑦12000rpm离心10min，去上清液，用70％乙醇洗3次，将沉淀吹干。每管加25μL TE，室温下溶解。
(2)PCR反应体系25μL，包括DNA模板(100ng/μL)2.0μL，10×PCR buffer2.0μL，HMG-F Primer(10μM)0.6μL，HMG-R Primer(10μM)0.6μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，Mg2+(25mM)3.0μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O补齐至25μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性60sec，52℃退火60sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min。
3.PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，1×TBE为电泳缓冲液，上样6μL电泳检测。电泳结束后用凝胶成像系统分析，170bp处出现特异条带，说明水稻组织中存在水稻稻瘟病病菌(Magnaporthe oryzae)，如果是菌丝体，证明该菌丝体为水稻稻瘟病病菌(Magnaporthe oryzae)菌丝体，否则所述的植株样品不存在水稻稻瘟病病菌(Magnaporthe oryzae)或该菌丝体非水稻稻瘟病病菌(Magnaporthe oryzae)。
实施例2：
引物对水稻稻瘟病病菌特异性扩增
1.水稻稻瘟病病菌的特异性检测
PCR反应体系25μL，包括DNA模板(100ng/μL)2.0μL，10×PCR buffer 2.0μL，HMG-F Primer(10μM)0.6μL，HMG-R Primer(10μM)0.6μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，Mg2+(25mM)3.0μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O补齐至25μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性60sec，52℃退火60sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min。
2.检测结果
检测的特异性：利用设计的特异性引物HMG-F/HMG-R，对各供试菌株进行PCR扩增。以无菌水(泳道14)作为阴性对照。如图1所示，只有水稻稻瘟病菌Magnaporthe grisea(泳道1～3)扩增出了长度为356bp的单一条带；而其他供试菌株及阴性对照(无菌水)均未扩增出目的条带(泳道4～13)。这表明本发明所设计的引物对水稻稻瘟病菌具有特异性，可用于水稻稻瘟病菌的检测。
实施例3：
引物对水稻稻瘟病病菌灵敏性检测
1.DNA浓度稀释：
利用紫外分光光度计测定试验所用菌株的DNA浓度，将DNA浓度稀释至103ng/μL、102ng/μL、10ng/μL、1.0ng/μL、0.5ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL。
2.水稻稻瘟病病菌灵敏性检测
PCR反应体系25μL，包括DNA模板(100ng/μL)2μL，10×PCR buffer 2.0μL，HMG-F Primer(10μM)0.6μL，HMG-R Primer(10μM)0.6μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，Mg2+(25mM)3.0μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O补齐至25μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性60sec，52℃退火60sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min。以1×TBE为电泳缓冲液，取6μL PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
检测结果：如图2所示，所设计的特异性引物只有在DNA浓度为0.5ng/μL、1.0ng/μL、10ng/μL、102ng/μL、103ng/μL(泳道4～8)时，扩增出一条356bp的条带，在DNA浓度为10-3ng/μL、10-2ng/μL、10-1ng/μL(泳道1～3)和阴性对照(泳道9)中，均未扩增出目的条带。说明该PCR反应的最小检测浓度为0.5ng/μL。
实施例4：
发病植株中水稻稻瘟病病菌的检测
1.样品处理：采用喷雾接种法，剪取生育期一致的健康水稻叶片，无菌水冲洗3次，放入铺有湿润的无菌滤纸的大培养皿中，配制浓度为1×106个/mL的水稻稻瘟病菌孢子悬浮液，在每片叶的上、中、下三个部位分别滴一滴孢子悬浮液，每滴5μL，用无菌的湿棉球保湿，放入26℃恒温箱中培养。在培养时间为4h、8h、12h、18h、24h时，进行取样，用锡纸包裹，放入超低温冰箱中保存备用。
1.DNA提取及检测
采用上述实施的CTAB法提取水稻样本基因组DNA。按照下述方法分别对接种4h、8h、12h、18h、24h的水稻叶片DNA进行PCR扩增，PCR反应体系25μL，包括DNA模板(100ng/μL)2.0μL，10×PCR buffer 2.0μL，HMG-FPrimer(10μM)0.6μL，HMG-R Primer(10μM)0.6μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，Mg2+(25mM)3.0μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，ddH2O补齐至25μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性60sec，52℃退火60sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，1×TBE为电泳缓冲液，上样6μL电泳检测。
2.检测结果
如图3所示，当接种时间为12h、18h、24h的水稻发病叶片中扩增出356bp的条带(泳道3～5)。随着接种时间的增加，扩增出的条带越亮，病组织中的菌含量越多。在病原菌接种水稻叶片12h时，并无明显发病症状时，便可检测到水稻稻瘟病菌。因此，此特异性引物可以用来鉴定水稻植株是否感染水稻稻瘟病菌。

Claims (5)

1.一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组，其特征在于，上游引物HMG-F，序列如序列表SEQ ID No.1所示；下游引物HMG-R，序列如序列表SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组，其特征在于，对水稻稻瘟病菌特异性扩增出356bp的产物。
3.根据权利要求3所述的一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组，在水稻稻瘟病菌监测及诊断鉴定方面的应用。
4.根据权利要求1所述的一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组，其特征在于，PCR检测方法的检测体系如下所示：94℃预变性5min，94℃变性60sec，52℃退火60sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min。
5.根据权利要求4所述的一种水稻稻瘟病菌的PCR检测引物组的PCR检测方法，其特征在于，所述的混合液的成分如下所示：
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Application publication date: 20160713