CN104450868A - 黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量pcr检测技术及应用 - Google Patents

黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量pcr检测技术及应用 Download PDF

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CN104450868A CN201310415572.1A CN201310415572A CN104450868A CN 104450868 A CN104450868 A CN 104450868A CN 201310415572 A CN201310415572 A CN 201310415572A CN 104450868 A CN104450868 A CN 104450868A
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陈璐
谢学文
石延霞
柴阿丽
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Abstract

本发明涉及一种检测黄瓜细菌性角斑病菌的实时荧光定量PCR检测技术及其应用。该检测技术利用荧光染料（SYBRGreenI）和正义引物、反义引物和阳性标准品，建立了实时荧光定量PCR反应体系，可以快速、定量地检测黄瓜细菌性角斑病菌。同时，该方法可直接定量检测模拟病种表面所带的病原菌，省去了提取病原菌DNA的步骤，大大节省检测的时间，降低检测难度，并能真实反应种子带菌量，为病害的早期预测和预警提供方法和基础。因此，该方法适合作为植物病害诊断检测方法推广应用。

Description

黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术及应用
技术领域
本发明为一种黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术及应用，专用于检测黄瓜细菌性角斑病菌，属于农作物病害诊断与防治技术领域。
背景技术
黄瓜细菌性角斑病由丁香假单胞流泪致病变种（Pseudomonas syringae pv. lachrymans，Psl）引起，该病原菌属于丁香假单胞50个致病变种之一，是引起黄瓜（Cucumis sativus）的主要细菌性病害之一。该病原引起细菌性角斑病（Angular leaf spot），在世界上广泛发生，我国主要分布在华北、东北及华中地区，保护地及露地生产中均有发生。感病植物的主要症状：叶脉呈水浸状小斑点，病斑褪绿，进一步扩展逐渐发展成为近圆形或不规则病斑，病果会出现水浸状病斑。黄瓜细菌性角斑病发病时间短，在适宜的发病条件下7-10d可发病，除顶端嫩叶外，可使黄瓜整株叶片枯死，影响结瓜产量，一般减产可达 30%-50%，造成严重的经济损失。
传统的病原细菌检测采用培养基分离纯化与致病性鉴定的方法，随后血清学技术的应用使得病原细菌的快速检测成为可能。Rassmusen和Prosen于1991年首次采用PCR方法检测植物病原菌及感染种子，推动基于PCR方法的植物病原菌检测技术快速发展。20世纪90年代中期发展起来的实时荧光定量PCR技术可以对靶标核酸进行精确定量检测，突破了传统PCR技术只能对目标核酸进行定性检测的局限。实时荧光定量PCR技术的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和Ct值对未知模板进行定量分析的方法。常规PCR 中，扩增产物（扩增子）是通过终点法来分析检测，即PCR 反应结束后，DNA 通过琼脂糖凝胶电泳后进行成像分析。相对常规PCR 而言，应用实时荧光定量PCR 方法检测植物病原菌的主要优点是有实时性强，灵敏度高，特异性强，反应过程封闭，操作简易，处理量高等。
对黄瓜细菌性角斑病原菌的快速检测最早采用的方法是免疫学方法，特别是ELISA。Fogliano等建立基于ELISA的检测方法可以定量到0.1mg/g植物组织的角斑病原菌。而由于丁香假单胞种下致病变种多，难以获得特异性好的抗体，容易出现假阳性结果。基于PCR的分子生物学检测方法不受植物病症的限制，具有快速检测的特点。目前，通过ITS等序列的常规PCR方法可特异性检测角斑病原菌，但由于常规PCR本身存在的局限性，使得该方法的灵敏度和特异性受到局限，且常规PCR为半定量，不能定量检测受检植株或种子上的病原菌。由于黄瓜细菌性角斑病原菌为种传，少量甚至微量的病原菌在合适的气候条件下能够很快地传播，导致严重的病害流行，故高灵敏性和高特异性的实时荧光定量PCR检测黄瓜细菌性角斑病原菌的方法和对带菌种子的检测技术亟需建立。
发明内容
 本发明的目的在于提供角斑病菌的荧光定量PCR快速检测的方法，克服角斑病菌传统检测方法和半定量PCR检测方法的不足。
本发明的另一个目的在于提供一种荧光定量PCR试剂盒在黄瓜细菌性角斑病流行动态检测和种子带菌的早期检测等应用。
该检测技术，在植物病害诊断与防治领域适合推广。
本发明的技术具体包括以下步骤：
1、采用改良CTAB法提取病原菌总DNA，模拟带菌种子采用0.1%吐温20直接洗脱表面病原菌，得到相应的DNA样本；
2、特异性引物设计，为避免PCR反应中出现假阳性结果或对非目标菌株产生非特异性扩增，本发明通过系统分析丁香假单胞菌属（P. syringae）下不同致病变种的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gap1）基因序列，采用CLUSTAL对该区序列进行比较，寻找黄瓜细菌性角斑病原菌的特异序列，利用Primer 5.0针对该序列设计了其特异性荧光定量PCR引物Pslgap1-F/Pslgap1-R；通过Blast program（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）比较所设计的引物序列与其它生物种属没有显著同源性，并在丁香假单胞菌属（P. syringae）下不同致病变种间显示出高的特异性。正义引物序列为：（5’-TCGGCGACGCAATCAAT-3’），反义引物序列为：（5’-GGTGGTTTCACGCTTCAGG-3’），扩增片段大小为162bp； Pseudomonas syringae pv. lachrymans的glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （gap1）基因部分序列登录号为（HQ171970.1）和（AY610653.1）；
3、实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量反应体系为25μl，其中浓度为10μmol/L正义引物Pslgap1-F和反义引物Pslgap1-R各0.25μl、荧光染料SYBR Premix Ex Taq（内含TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg2+，SYBR GreenⅠ和 dNTP Mixture）12.5μl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液0.5μl，ddH2O补齐至25μl；
4、PCR反应程序为： PCR采用两步法，94℃ 30s，然后94℃ 5s、62℃ 30s为1个循环，共35个循环。PCR完成后，按0.1℃/s升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；
5、pMD-20载体插入gap1片段序列后转化大肠杆菌DH5α进行增殖，提取质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量，10倍梯度稀释成6个浓度梯度（2.6ng-2.6fg DNA /μl），按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；
6、取步骤1）中得到的DNA样本作为模板，按上述PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH2O，阳性对照采用角斑病菌菌株基因组DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct）与标准曲线对照，得到DNA样本中的gap1区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中角斑病菌的浓度。
黄瓜细菌性角斑病菌荧光定量PCR检测技术可以生成试剂盒，包括标准阳性DNA模板、荧光定量PCR反应液。
标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pGM-T（购自天根公司）载体制备而成。标准品的制备过程为：采用引物Pslgap1-F和Pslgap1-R扩增角斑病菌的gap1部分序列，电泳PCR产物后切下含有目的片段的凝胶，凝胶试剂盒回收纯化目的片段，加入pGM-T载体后16℃过夜连接，采用大肠杆菌DH5α感受态细胞转化。转化产物涂布LB平板记性培养，挑取白斑，采用引物对Pslgap1-F/ Pslgap1-R进行PCR鉴定。通过序列分析进一步鉴定阳性克隆结果的可靠性。选择PCR和序列分析均为阳性的克隆菌落，将其接种到含有氨苄青霉素的LB培养基，过夜培养。质粒DNA采用质粒小提试剂盒提取。DNA经A260紫外分光光度计定量，10倍梯度稀释为2.6ng-2.6fg /μl，于-20℃保存。
 荧光定量反应体系由正义引物Pslgap1-F、反义引物Pslgap1-R、荧光染料SYBR Premix Ex Taq 内含TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg2+，SYBR GreenⅠ和 dNTP Mixture组成。
 本发明优化的荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中SYBR Premix Ex Taq 12.5μl，10μmol正义引物Pslgap1-F和反义引物Pslgap1-R各0.25μl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液0.5μl，用 ddH2O补充至25μl。PCR采用两步法，94℃ 30s，然后94℃ 5s、62℃ 30s为1个循环，共35个循环。
本发明提供的角斑病菌荧光定量PCR试剂盒，针对角斑病菌基因组gap1基因特异的靶序列设计引物。通过优化反应体系（引物浓度、模版DNA浓度、扩增程序等）的优化，采用定量检测系统（包括ABI Prism系统、PE Applied Bioasystems、Bio-Rad），可用于黄瓜细菌性角斑病菌灵敏的、快速的、准确的定量检测。此荧光定量PCR检测方法多次重复试验误差值很小，复现性良好，引物对的检测灵敏度限点为2.6×10-2fg质粒DNA /μl，相当于297个细胞，比普通PCR灵敏性高出1000倍。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1）特异性高、鉴定速度快
引物扩增角斑病菌的特异性序列，PCR检测特异性高。自然条件下，传统的分离培养的方法检测黄瓜细菌性角斑病过程繁琐，鉴定周期长，在生产实践中达不到快速鉴定的要求，本发明克服了这一不足之处，并且对于病种、病植株表面带菌的检测无需DNA提取步骤，检测速度快。
2）灵敏度高、可准确定量
与普通PCR检测相比，本发明可以准确定量目标菌株。本方法在浓度为2.6ng-2.6fg/μl目标DNA浓度范围内，具有良好的线性关系，且检测灵敏度比普通PCR高1000倍；同时该检测方法重复性良好。
3）实用性高、应用范围广
可以定量检测带菌种子上的黄瓜细菌性角斑病菌，结合该病害种传发病阈值，可以为病害的早期预测预报提供方法依据。
附图说明
图1是引物对Pslgap1-F/Pslgap1-R特异性检测PCR扩增结果,其中1、2的模板为黄瓜细菌性角斑病菌基因组DNA，3~13的模板分别为番茄细菌性斑点病菌DNA、平菇褐斑病菌DNA、番茄青枯病菌DNA、甘蓝黑腐病菌NA、丝瓜叶斑病菌DNA、西葫芦叶斑病菌DNA、大白菜软腐病菌DNA、甜瓜果斑病菌DNA、黄瓜枯萎病菌DNA、甘蓝黑斑病菌DNA、黄瓜褐斑病菌DNA；N为阴性对照；M为150bp DNA ladder（Takara 公司）；
图2 实施例1荧光定量PCR扩增的标准曲线，纵轴为Ct值，横轴为Log DNA；标准误为0.997； 
图3 实施例1荧光定量PCR引物特异性扩增溶解曲线，纵轴为Delta Rn；横轴为 Cycle Number，曲线a，b，c，d，e和f的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为2.16ng，216pg，21.6pg，2.16pg，216fg，21.6fg；其中1的模板为黄瓜细菌性角斑病菌基因组DNA，2~12的模板分别为番茄细菌性斑点病菌DNA、平菇褐斑病菌DNA、番茄青枯病菌DNA、甘蓝黑腐病菌NA、丝瓜叶斑病菌DNA、西葫芦叶斑病菌DNA、大白菜软腐病菌DNA、甜瓜果斑病菌DNA、黄瓜枯萎病菌DNA、甘蓝黑斑病菌DNA、黄瓜褐斑病菌DNA； 
图4 实施例2中田间病植株样本分离的细菌性角斑病原菌和阳性对照菌株的PCR扩增结果，其中1~7的模板为分别对应表2中不同黄瓜细菌性角斑病菌供试菌株的基因组DNA；N为阴性对照；M为150bp DNA ladder（Takara 公司）；
图5实施例2田间病植株样本分离的黄瓜细菌性角斑病原菌和阳性对照菌株荧光定量PCR扩增的溶解曲线，纵轴为Delta Rn；横轴为 Cycle Number，模板为分别对应表2中不同黄瓜细菌性角斑病菌供试菌株的基因组DNA；
图6 普通PCR灵敏性扩增结果，其中1~12的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为2.6ng，260pg，26pg，2.6pg，260fg，26fg，2.6fg，0.26fg，2.6×10-2fg ，2.6×10-3fg，2.6×10-4fg, 2.6×10-5fg；N为阴性对照；M为150bp DNA ladder（Takara 公司）；
图7 实施例3荧光定量PCR阳性标准品的扩增曲线，纵轴为Delta Rn；横轴为 Cycle Number，曲线1，2，3，4，5和6的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为2.16ng，216pg，21.6pg，2.16pg，216fg，21.6fg。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述发明。应当理解，下列实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护范围。 
实施例1 黄瓜细菌性角斑病菌的特异性引物检测
采用黄瓜细菌性角斑病菌、丁香假单胞菌属下其他致病变种以及其他蔬菜常见细菌真菌性病害病原菌为材料，对角斑病菌引物对Pslgap1-F/Pslgap1-R进行特异性检测。相关病原细菌菌株在NA培养基培养。其它病原真菌菌株在PD培养基培养；所有菌株由固体培养基活化后转入液体培养基培养，病原细菌28℃培养24h，病原真菌28℃培养1周后收集菌丝或菌体提取DNA。DNA的提取采用改良CTAB提取法。
以角斑病菌及丁香假单胞菌属下其他致病变种以及其他蔬菜常见细菌真菌性病害病原菌基因组DNA为模板，利用引物对Pslgap1-F/Pslgap1-R进行普通PCR扩增，同时用该荧光定量PCR体系对上述菌株进行扩增，以检测该引物的特异性。普通PCR反应体系如下：总反应体积25μL，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP（10μmol/L）0.5μL，引物（10μmol/L）各0.25μL，模板DNA0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，最后以ddH2O补足至25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8 min。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测；荧光定量PCR循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果。
特异性检测引物对Pslgap1-F/Pslgap1-R对角斑病菌及丁香假单胞菌属下其他致病变种以及其它常见真细菌性病原菌的PCR扩增结果，该结果表明该引物具有良好的特异性。62℃退火条件下，只有角斑病菌扩增出162bp的产物，其他菌株和阴性对照均无相应扩增产物。荧光定量PCR扩增结果制作标准曲线和扩增曲线，只有阳性质粒克隆和角斑病菌在89℃有单一峰值，其他对照菌株和阴性对照无明显峰值，说明该引物特异性良好。
表1引物特异性检测菌株
编号 拉丁名 编号 病害名称
1 Pseudomonas syringae pv. lachrymans Psl-2 黄瓜细菌性角斑病
2 Pseudomonas syringae pv. tomato FQ11022402 番茄细菌性斑点病
3 Pseudomonas tolasii PG0803201702 平菇细菌性褐斑病
4 Pseudomonas sollanacearum FQ11080705 番茄青枯病
5 Pseudomonas cichorii SG11030803 丝瓜叶斑病
6 Erwinia persicina XHL11022302 西葫芦叶斑病
7 Erwinia carotovora subsp.carotovora BC11070402 大白菜软腐病
8 Acidovorax citrulli TG10062301 甜瓜果斑病
9 Xanthomonas campestris pv.campestris GL11030901 甘蓝黑腐病
10 Fusariumn oxysporum HG10062402 黄瓜枯萎病
11 Alternaria brassicae GL09112501 甘蓝黑斑病
12 Corynespora cassiicola HG09121903 黄瓜褐斑病
实施例2 田间病植株样本分离黄瓜细菌性角斑病菌的检测
2010年2月在廊坊永清采集黄瓜细菌性角斑病植株样本，分离致病菌，通过致病性实验将其确定为黄瓜细菌性角斑病原菌。对供试菌株用改良CTAB法进行DNA提取，利用引物对Pslgap1-F/Pslgap1-R按上述步骤进行普通PCR扩增，菌株Psl-2作为阳性对照，1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物，同时用荧光定量PCR技术对供试菌株和阳性对照菌株进行扩增。
表2田间病植株样本分离供试菌株
编号 拉丁名 编号 病害名
1 Pseudomona ssyringae pv. lachrymans Psl-2 黄瓜细菌性角斑病
2 Pseudomona ssyringae pv. lachrymans HG1202080101 黄瓜细菌性角斑病
3 Pseudomona ssyringae pv. lachrymans HG1202080201 黄瓜细菌性角斑病
4 Pseudomona ssyringae pv. lachrymans HG1202080301 黄瓜细菌性角斑病
5 Pseudomona ssyringae pv. lachrymans HG1202080401 黄瓜细菌性角斑病
6 Pseudomona ssyringae pv. lachrymans HG12020806 黄瓜细菌性角斑病
7 Pseudomona ssyringae pv. lachrymans HG12020807 黄瓜细菌性角斑病
引物对Pslgap1-F/ Pslgap1-R对田间病植株样本分离的细菌性角斑病原菌和阳性对照菌株的PCR扩增结果。62℃退火条件下，所有供试角斑病菌扩增出162bp的产物，阴性对照均无相应扩增产物。荧光定量PCR检测结果与常规PCR扩增结果一致，所有供试角斑病菌在89℃有单一峰值，表明该检测技术可以用于田间黄瓜细菌性角斑病菌及病植株样本的检测。
 
 实施例3 人工模拟病种样本检测
2012年11月于中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验温室内进行人工模拟种子带菌样本的制备及播种。健康黄瓜种子（中农6号）用75％的酒精对种子进行消毒30s，再用次氯酸处理15min，用无菌水清洗。采用菌悬液浸种法，制备9种不同浓度的菌悬液（1.0×108，1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×102，10，1，0 CFU/ml）。各取20粒黄瓜种子分别放入20ml浓度不同的菌悬液的无菌培养皿中，浸泡12h，浸泡后的种子在超净台中吹干，每个浓度每个重复取种子5粒，用2ml 含有0.1%的吐温20的无菌水洗种子。混合体系150rpm 震荡30分钟，取1μl浸出液进行荧光定量PCR检测。循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果，计算待测样品角斑病菌DNA含量。将其他带菌的种子播种到育苗钵中，放入保湿柜内，温室温度维持在20-30℃。从幼苗第一次出现发病症状开始调查，得出种子带菌发病的最低接种浓度。
 
表3 荧光定量PCR的CT值和模拟病种样本的DNA含量
编号 菌悬液浓度 (CFU/ml) 发病率(%) P. syringae pv. lachrymans DNA (fg/μl)
1 1×108 100 1024
2 1×107 33 204
3 1×106 70 64.6
4 1×105 33 44.2
5 1×104 20 11.6
6 1×103 10 1.68
7 1×102 0 0.16
8 10 0  —
9 1 0  —
10 0 0  —
采用人工接种的黄瓜病种样本对荧光定量PCR体系的可靠性和灵敏性进一步进行验证。上述结果表明本研究建立的黄瓜细菌性角斑病原菌荧光定量PCR检测体系具有高的可靠性及灵敏性，该检测方法的检测限点为0.16fg质粒DNA/μl，对应的病种表面带菌量为100CFU/ml。模拟病种进行播种，在子叶长出后进行调查，从而确定黄瓜细菌性角斑病原菌的最低发病接种浓度为1000CFU/ml，在该检测技术检测范围内可以准确将其定量。将该检测结果与田间检测结果相结合，可以建立准确的黄瓜细菌性角斑病田间预测预报系统。

Claims (3)

1.一种黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术，其特征在于包括以下步骤：
1）采用改良CTAB法提取病原菌总DNA，模拟种子带菌采用0.1%吐温20直接洗脱表面病原菌，得到相应的DNA样本；
2）特异性引物设计，通过分析丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）不同致病变种的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gap1）基因序列，采用CLUSTAL方法进行序列比较，对黄瓜细菌性角斑病原菌设计了其特异性PCR引物对Pslgap1-F/Pslgap1-R，所述的引物对为：正义引物Pslgap1-F序列为：5，- TCGGCGACGCAATCAAT -3，，反义引物Pslgap1-R 序列为：5，- GGTGGTTTCACGCTTCAGG -3，；
3）实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量反应体系为25μl，其中浓度为10μmol/L正义引物Pslgap1-F和反义引物Pslgap1-R各0.25μl、荧光染料SYBR Premix Ex Taq（内含TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg2+，SYBR GreenⅠ和 dNTP Mixture）12.5μl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液0.5μl，ddH2O补齐至25μl；
4）PCR反应程序为：PCR采用两步法，94℃ 30s，然后94℃ 5s、62℃ 30s为1个循环，共35个循环，PCR完成后，按0.1℃/s升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；
5）插入gap1片段序列的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度（2.6ng-2.6fg DNA μl-1），按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；
6）取步骤1）中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH2O，阳性对照采用角斑病菌菌株基因组DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct）与标准曲线对照，得到DNA样本中的gap1基因片段拷贝数，进而得到原来样本中角斑病菌的浓度。
2.权利要求1所述的一种检测黄瓜细菌性角斑病菌荧光定量PCR检测技术，该技术可以转化成商品化的检测试剂盒，试剂盒包括：正义引物Pslgap1-F、反义引物Pslgap1-R、荧光染料SYBR Premix Ex Taq 内含TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg2+ ，SYBR GreenⅠ和 dNTP Mixture，以及由插入gap1片段序列的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取的质粒DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释。
3.权利要求1所述的对黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术可以应用于对农田环境中黄瓜植株上细菌性角斑病菌的动态监测，并可以应用于种子带菌及带菌量的检测。
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