CN107937593A - 芸苔根肿病菌的特异性pcr引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供芸苔根肿病菌的特异性PCR引物及检测方法。所述特异性PCR引物Pb4871F和Pb4871R(SEQ ID NO:1‑2)是根据根肿病菌全基因组序列中保守的内转录间隔区序列设计的。该对引物可用于芸苔根肿病菌分子鉴定及病害流行动态监测，为十字花科根肿病的早期诊断及病菌检测提供了快速准确、简便有效的方法，对有效监测根肿病菌在田间的发生发展动态及根肿病的预测预报提供了重要手段和技术支持。

Description

芸苔根肿病菌的特异性PCR引物及检测方法

技术领域

本发明涉及根肿病菌的检测，具体地说，涉及芸苔根肿病菌的特异性PCR引物及检测方法。

背景技术

芸苔根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)是一种专性寄生植物病原菌，侵染十字花科等作物引起根肿病。随着十字花科等作物种植面积的扩大，根肿病发生与为害在世界范围内日趋严重，在我国的江西、安徽、浙江、江苏、上海、北京、辽宁、吉林、黑龙江、湖南、湖北、福建、广西、云南、西藏、四川、贵州、广东等省市自治区均有发生。世界范围内每年由根肿病造成的经济损失可达10～15％。十字花科根肿病主要危害根部，形成大小不等的肿瘤，被根肿病菌侵染的植株生长缓慢，易混有腐生菌造成腐烂，伴有腥臭味。根肿病的主要传播途径包括带菌土壤、农事操作、雨水流动等方式。根肿病菌休眠孢子可在土中存活7～8年，萌发和侵染的适宜温度为18～25℃，最适土壤含水量为70％，最适土壤pH值5.4～6.5。主要的传播途径包括带菌土壤、农事操作、雨水流动等方式。

在农业实践生产中，播种前的田间土壤及作物被侵染但未显症阶段，无法避免根肿病菌的侵染及病害诊断，导致十字花科根肿病一旦发生，造成病害防治十分困难。加之根肿病菌不能在人工培养基上进行培养，传统的病原鉴定研究方法无法对该病菌进行快速、简易的鉴定和诊断。近年来，随着分子生物学技术的广泛应用，聚合酶链式反应(PCR)扩增技术逐渐应用到植物病害的分子鉴定、生态监测等方面，解决了许多传统技术难以解决的问题。因此，设计一套高效精准的十字花科蔬菜根肿病菌检测技术体系，可以有效的监测并预防根肿病的发生与传播，对根肿病的流行预警及病害防控等具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一对用于检测芸苔根肿病菌的特异性PCR引物。

本发明的另一目的是提供芸苔根肿病菌的特异性PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明根据根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)全基因组序列中保守的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列(NCBIaccession number KX011135.1)，设计出一对用于检测芸苔根肿病菌的特异性PCR引物Pb4871F和Pb4871R，引物序列如下：

正向引物Pb4871F：5’-CGACACTGTTAAATTGCGGGGAC-3’(SEQ ID NO:1)

反向引物Pb4871R：5’-ACGAGACCGACTATATCTTAAGCGAC-3’(SEQ ID NO:2)

本发明还提供含有上述引物对的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供上述引物对或含有上述引物对的检测试剂或试剂盒在十字花科作物及土壤中根肿病菌检测中的应用。

前述的应用是指采用普通PCR或实时荧光定量PCR进行检测。

本发明还提供芸苔根肿病菌的特异性PCR检测方法，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述引物Pb4871F和Pb4871R进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

优选地，PCR反应体系为：

PCR反应条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性30秒，58℃-68℃退火30秒，72℃延伸30秒，共25个循环；72℃延伸8-20分钟，最后4℃保存。

更优选地，退火温度为58℃、60℃、62℃、64℃、66℃或68℃。最优选62℃。

前述的方法，步骤3)用1.2％-1.4％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若出现244bp大小的特征条带，则表明样品中含有根肿病菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明基于根肿病菌全基因组序列中保守的内转录间隔区，设计出可快速检测根肿病菌的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出根肿病菌。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高(普通PCR检测灵敏度可达1fg水平，实时荧光定量PCR检测灵敏度可达1ag水平)。本发明提供的引物可用于芸苔根肿病菌分子鉴定及病害流行动态监测，为十字花科根肿病的早期诊断及病菌检测提供了快速准确、简便有效的方法，对有效监测根肿病菌在田间的发生发展动态及根肿病的预测预报提供了重要手段和技术支持。

附图说明

图1为本发明芸苔根肿病菌与根肿菌门中其他真菌的部分ITS序列比对结果；其中，下划线部分为引物设计位点，灰色部分为相同碱基。

图2为本发明实施例2中PCR反应体系优化结果；其中，Lane 1-4分别为反应体系10μL，20μL，50μL及ddH₂O。

图3为本发明实施例2中根肿病菌及不同物种的扩增产物核酸序列比对及聚类分析结果。

图4为本发明实施例2中根肿病菌PCR反应条件优化结果；其中，Lane 1-6分别为退火温度58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃。

图5为本发明实施例2中根肿病菌PCR反应灵敏性检测结果；其中，Lane 1-8分别为DNA模板反应量10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg。

图6为本发明实施例2中根肿病菌实时荧光定量PCR反应灵敏性检测结果；其中，A，扩增曲线，表明不同模板浓度扩增反应成梯度变化；B，熔点峰图，表明不同模板均能扩增单特异峰(即唯一PCR扩增产物；图中曲线分别为DNA模板反应量10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、10ag、1ag。

图7为本发明实施例2中根肿病菌PCR反应特异性检测结果；其中，Lane1-12分别为Plasmodiophora brassicae，Brassica napus，Penicillium sp.，Alternaria alternata，Rhizoctonia solani，Fusarium avenaceum，Botrytis cinerea，Colletotrichumdestructivum，Sclerotinia sclerotiorum，Pseudomonas fluorescens，Bacillusmegaterium，ddH₂O。

图8为本发明实施例2中对实际样品的PCR检测结果；其中，Lane1-6分别为根肿病菌休眠孢子、罹病白菜根、罹病油菜根、发病田土样、带菌种子样品，ddH₂O。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1根肿病菌特异性引物的设计与合成

根据芸苔根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)全基因组序列中保守的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列(NCBI accession numberKX011135.1)，与根肿菌门中其他真菌马铃薯粉痂菌(Spongospora subterranea)、禾谷多粘菌(Polymyxa graminis)、水云毛利亚菌(Maullinia ectocarpii)、吴龙氏卵菌(Woronina pythii)的部分ITS序列进行相似性比对(图1)，找到根肿病菌的特异性区域。利用软件及人工修正设计的特异性引物Pb4871F/Pb4871R(表1)，PCR扩增产物大小为244bp。

表1根肿病菌快速检测引物序列

实施例2芸苔根肿病菌的特异性PCR检测方法

1、模板DNA提取

采用不同方法提取模板DNA，其中根肿病菌休眠孢子及植物和种子样品使用DNAsecure Plant Kit(TianGen)，真菌采用改良CTAB法，细菌采用Bacteria Genomic DNAKit(CWBio)，土壤样品采用DNeasy PowerSoil Kit(Qiagen)。通过不同方法提取的DNA模板通过超微量分光光度计定量分析(表2)。

表2不同生物DNA模板浓度

2.根肿病菌PCR反应体系

模板DNA(50ng)依据设计引物推荐退火温度(62℃)，优化PCR反应体系(表3)。结果表明，不同PCR反应体系均能够成功进行根肿病菌的靶标片段有效扩增(图2)。将扩增产物测序并进行核酸序列比对，结果表明该反应体系扩增片段与特异性引物设计所依据的靶标基因片段相同，且扩增片段序列与供试样品(寄主植物，内生细菌、真菌等)相似性较低(图3)。

表3根肿病菌检测PCR反应体系

3.根肿病菌PCR反应条件

PCR的反应条件如下：预变性95℃ 2min；变性95℃ 30秒,退火温度58-68℃ 30秒,72℃延伸30秒，25个循环；继续72℃延伸8-20min；最后4℃保存。通过1.2-1.4％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，退火温度在58-68℃之间，均可以有效检测根肿病菌靶标片段(图4)。

4.根肿病菌PCR灵敏性

将根肿病菌DNA模板进行梯度PCR用于灵敏性检测。结果表明，常规PCR检测灵敏度可以达到10^-6ng水平(即1fg，图5)。同时，将该对引物用于实时荧光定量PCR检测，其检测灵敏度可以达到10^-9ng水平(即1ag，图6)。

实时荧光定量PCR的反应体系及条件如下：

表4根肿病菌检测qPCR反应体系

反应条件：95℃ 3min；95℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，50个循环；扩增完成后即生成熔解曲线。

5.根肿病菌PCR特异性

选取根肿病菌、植物寄主(油菜)、真菌(青霉菌Penicillium digitatum，链格孢菌Alternaria alternata，丝核菌Rhizoctonia，镰孢菌Fusarium，灰葡萄孢菌Botrytiscinerea，炭疽菌Colletotrichum，核盘菌Sclerotinia sclerotiorum)、内生细菌(假单胞菌Pseudomonas fluorescens，芽孢杆菌Bacillus)进行PCR反应验证引物特异性。结果表明，特异性引物只能成功扩增以检测根肿病菌DNA，其他生物样品无法进行有效扩展(图7)，说明引物具有物种特异性。

6.根肿病菌PCR样品检测

选取根肿病菌休眠孢子、罹病白菜根、罹病油菜根、发病田土样、带菌种子样品，提取DNA，采用上述优化条件进行PCR检测。结果表明，该反应体系可以用于多种样品的根肿病菌检测及病害早期诊断与防控预警系统(图8)。

本发明克服了现有技术存在的引物设计数据库信息不完善及未考虑病样内生菌的假阳性扩增的缺陷，结合现代真菌学及分子生物学研究技术手段，建立了一套高效精准的根肿病菌鉴定技术体系，通过特异性引物的PCR反应，快速、准确地检测植物组织、土壤、种子样品中的根肿病菌，为十字花科根肿病的诊断及病害流行监测预报提供技术支持。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 芸苔根肿病菌的特异性PCR引物及检测方法

<130> KHP171119057.2

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgacactgtt aaattgcggg gac 23

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgagaccga ctatatctta agcgac 26

Claims (9)

1.芸苔根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)的特异性PCR引物对，其特征在于，所述引物对为：

正向引物Pb4871F：5’-CGACACTGTTAAATTGCGGGGAC-3’

反向引物Pb4871R：5’-ACGAGACCGACTATATCTTAAGCGAC-3’。

2.含有权利要求1所述引物对的检测试剂或试剂盒。

3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在十字花科作物及土壤中根肿病菌检测中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用普通PCR或实时荧光定量PCR进行检测。

5.芸苔根肿病菌的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物Pb4871F和Pb4871R进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)PCR反应体系为：

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)PCR反应条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性30秒，58℃-68℃退火30秒，72℃延伸30秒，共25个循环；72℃延伸8-20分钟，最后4℃保存。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，退火温度为58℃、60℃、62℃、64℃、66℃或68℃，优选62℃。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)用1.2％-1.4％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若出现244bp大小的特征条带，则表明样品中含有根肿病菌。