CN100427927C - 稻曲病菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测稻曲病菌实时荧光定量PCR的试剂盒及其应用。该试剂盒利用荧光探针(Taqman)和正义引物、反义引物和阳性标准品，建立了实时荧光PCR反应体系，可以快速、定量地检测稻曲病菌。适用于对农田环境中(包括土壤中越冬菌量以及稻田浮萍和水稻植株上)稻曲病菌进行实时监测；也可以用于水稻种子带菌检测以及比较稻曲病菌在不同水稻品种中的增殖速度。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测稻曲病菌的实时荧光定量PCR试剂盒，包括稻曲病菌特异性引物和与之相匹配的荧光标记探针，适用于对农田环境中(包括土壤中越冬菌量以及稻田浮萍和水稻植株上)稻曲病菌进行实时监测；也可以用于水稻种子带菌检测以及比较稻曲病菌不同菌株在不同水稻品种植株中的增殖速度。
背景技术
由Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak.引起的稻曲病是一种世界性水稻真菌病害，在中国、日本和印度等国家危害较重。稻曲病是一种水稻穗部病害，病菌将谷粒转变成稻曲球，表面覆盖大量粉状、墨绿色的厚垣孢子。该病显著地影响水稻产量和稻米品质，发病严重的年份产量损失率为30-50％，并且加工后的稻米混有大量厚垣孢子。稻曲病菌厚垣孢子含有真菌毒素Ustilaxin。日本研究者的动物毒性实验结果表明，厚垣孢子水浸出液和微量Ustilaxin
A能引起鼠肝脏和肾脏坏死，剂量较大时引起前胃溃疡、糜烂和胸腺萎缩。我国研究者的试验也表明用混有稻曲病粒的谷糠饲养家畜、家禽能引起慢性中毒，使其内脏发生病变。
20世纪50年代稻曲病在我国开始轻微发生，80开始年代由次要病害上升为主要病害，并遍及全国各主要水稻种植区。目前我国大多数优质、高产的常规稻主栽品种及杂交稻组合对稻曲病都表现感病，甚至高度感病，加之环境中积累了大量的菌源，稻曲病在各水稻种植区频繁暴发成灾。自20世纪80年代以来，日本对混入病粒的稻米在流通阶段通常不予评定等级。我国在稻曲病发病严重的年份，加工出的稻米甚至呈淡绿色，食用后对人体健康极为不利。当前，我国人民对农产品的需求已经逐渐从数量型消费向质量型消费转变，随着人们对绿色食品的日益重视，稻曲病对我国稻米无公害生产的影响将日益突出。
20世纪50年代日本最早开始研究稻曲病的发生规律，目前国内外研究者普遍认为稻曲病为单循环病害。但是由于人工接种技术不成熟的限制，迄今，水稻对稻曲病抗性遗传研究还是空白，因而难以培育抗病品种，长期以来，防治一直以喷施化学农药为主。稻曲病为穗部病害，若待发现症状再进行防治为时已晚，因此监测病原菌的群体动态，是适时有效防治该病、实现农药安全减量使用的前提。
采用人工分离培养和常规的显微镜观察可以检查土壤中越冬厚垣孢子的数量；但是稻田中微生物种类繁多，稻曲病菌生长速度缓慢，并且厚垣孢子萌发产生的菌丝和分生孢子没有特异的形态特征，采用显微镜观察和分离培养等病理学手段都难以鉴定，因此无法了解水稻生长季节田间稻曲病菌的数量变化和对植株的侵染及其在植株中的增殖状况。
分子检测技术的发展为检测稻曲病菌提供了可能。研究表明核糖体ITS区的核酸序列具有区别真菌种的潜能。在前期研究中，申请者等全面研究了稻曲病及其同科(麦角菌科)近缘真菌的18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA和ITS2核酸序列的系统发育(序列已登录NCBI/Genbank，Acc No.AB092689，AB092943-AB092957，AB065423，AB038594，AB065432等)，经与22种近缘真菌该区核酸序列进行比较，设计了稻曲病菌特异性引物，建立了PCR检测方法(Zhou et al，J.Phytopathology，2003，151(9)：513-518)。
PCR方法可以特异地从土壤和植物组织中检测稻曲病菌，具有常规植物病理学检测方法无法替代的特异性好和灵敏性高的优点。但是，这种传统的PCR方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA的拷贝数。由于PCR的终产物与起始模板量之间没有线形关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
荧光定量PCR是通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析的一项新技术。建立稻曲病菌的荧光定量PCR检测方法，将有效地监测该病菌在环境中及水稻植株中的数量，为稻曲病发生的预测预报和快速鉴定水稻品种的抗性差异提供一种新技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稻曲病菌实时荧光定量PCR试剂盒，可以快速准确地定量检测稻曲病菌，特异性好、灵敏性高。
本发明的另一个目的在于提供一种荧光定量PCR试剂盒在对稻曲病流行监测预报以及研究稻曲病菌在水稻植株中增殖速度、种子带菌检测等方面的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
稻曲病菌实时荧光定量PCR试剂盒包括标准阳性DNA模板、荧光定量反应液。
标准阳性DNA模板由含有插入目标片段的pUCm-T(购自Sangon公司)载体制备而成。标准品的制备过程为：采用引物ITS4和ITS5扩增稻曲病菌的ITS区，PCR产物电泳后切下含有目标片段的凝胶，目标片段用凝胶试剂盒回收纯化后与pUCm-T载体16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化产物涂平板培养，挑取白斑，采用引物为US1-3/US2-5和UF1/UR1进行PCR鉴定。阳性克隆通过序列分析进一步鉴定结果的可靠性。选择PCR和序列分析均为阳性的克隆，接种到含有氨卞青霉素的LB培养基过夜培养，用SDS碱解法制备质粒DNA。DNA经紫外分光光度计A260定量，经10倍梯度稀释为250ng-250fg/μl，保存于-20℃。
荧光定量反应液由正义引物UF1、反义引物UR1、荧光探针(Taqman)、10×PCR缓冲液、1mmol/LdNTP、25mmol/L Mg2+、Taq DNA聚合酶组成。
为避免由于引物专化性较低，PCR反应中出现假阴性结果或对非目标真菌产生非特异扩增，本发明在系统分析稻曲病菌ITS区、18S rRNA和5.8S rRNA核酸序列系统发育的基础上，采用软件CLUSTAL，与麦角菌科近缘真菌的该区序列进行比较，寻找稻曲病菌特异性序列区域；选择稻曲病菌特异性序列区域，设计实时荧光PCR引物和探针，通过Blastnpogram(Http://www.Ncbi.nlm.nil.gov/blast)比较所设计的引物和探针序列与其它生物种是否具有显著的同源性。本发明设计的稻曲病菌引物和探针序列与其它生物种没有显著同源性。正义引物UF1序列为：5’-GAGGGCACCCGGAACCAG-3’，反义引物UR1序列为：5’-CACTCAGACATGCATTGGAAAACA-3’，扩增片段为77bp(图1)。荧光探针UP1序列为：5’FAM-CGCCCGCCGGAGGATACAACCAAA-TAMRA 3’，探针5’端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA，UF1、UR1和UP1在稻曲病菌基因组ITS序列上的位置如下：
attaccgagt ttttacgctc caaaccccat gtgaacctat acctacgccg ttgcttcggc gggctttcaa gc
cccgggcagccgcctccc ccccgacgcc ctcgcgcctg ggaggg
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<< <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
US2-5 US4-5
atcaaaactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatg
tga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagtattctg gcgggcat
gcctgttcgagc gtcatttcaa ccctcaagct ctgtcttgcg cttggtgttgg ggatcggcc ctgcccgcca
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
US3-3
gcccgggcgg gccgcccccg aaatgaatcg gcggtctcgt cgcagcctcc tctgcgtagt aattcagttatcct
>>>>>>>>>>>>>>
cgcact tggagcgcgg cgcggccact gcccgtaaa
>>>>>>>>>>>>>>
US1-3
Ustilaginoidea virens 18S rRNA，ITS1，5.8S rRNA，ITS2部分序列NCBI登录号为AB092956。US3-3/US4-5和US1-3/US2-5扩增子长度分别为232bp和380bp。
本发明优化的荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中10×PCR缓冲液2.5μl，10μmol/L正义引物UF1和反义引物UR1各1μl，20μmol/L荧光探针UP11μl，1mmol/LdNTP2μl，25mmol/L Mg2+2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl(自制)，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液1μl。PCR采用两步法，扩增反应程序为先95℃10min，然后95℃15s、60℃1min为1个循环，共40个循环。
在本发明提供的检测稻曲病菌荧光定量PCR试剂盒中，荧光探针UP1的5′端标记有报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团TAMRA。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR进行，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号，报告基团所释放的荧光可以被定量检测仪内的荧光计检测，模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，所以荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。CT(Threshold Cycle)值是PCR过程中荧光量的积累超过基底荧光量的循环数。利用阳性梯度标准模板的CT值制成标准曲线，再根据待测样品的CT值可准确测出该样品的起始浓度。
本发明提供的稻曲病菌荧光定量PCR试剂盒，针对稻曲病菌基因组ITS区特异的靶序列设计探针和引物，通过优化反应体系(引物和探针浓度、Mg2+浓度、扩增程序等)的优化，采用定量检测系统(包括ABI Prism系统、PE Applied Bioasystems、Bio-Rad)，可用于各种来源稻曲病菌的定量检测。按照Ari M.Hietala et al的推算方法(Applied andEnvironmental Microbiology，2003，69(6)：4413-4420)，实时荧光PCR检测的稀释限点10fg质粒DNA/μl相当于0.3个细胞。
本发明的另一个方面提供了使用本发明的试剂盒对稻曲病菌进行检测的方法，该方法的实验步骤为：从待测样品提取DNA；将加入标准品及待测样品的荧光定量反应液上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；通过比较待测样品和标准品的循环域值，根据标准曲线计算出待测样品的起始DNA浓度。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1)特异性好、鉴定快速
引物和探针均包括稻曲病菌的特异性序列，检测特异性高。环境中，特别是稻田水中微生物种类繁多，稻曲病菌的分生孢子及其萌发产生的菌丝均没有特异性的形态特征，并且生长速度缓慢，本发明克服了显微观察和分离培养等常规植物病理学方法耗时以及结果具有不确定性的缺点(观察或分离到菌丝难以确定是否为稻曲病菌)。
2)准确定量、灵敏度高
与普通PCR检测相比，本发明可以准确定量，目标DNA在100ng-10fg/μl浓度范围内，都有很好的线性关系；同时检测具重复性好的特点，一组样品三次独立重复实验的Cp变异系数小于1.2％。虽然Nested PCR检测的灵敏性与荧光定量PCR相近，但是不能定量，并且检测所用时间明显长于荧光定量PCR。
3)实用性好、应用范围广
可以定量检测土壤、水稻生长季节空气和稻田中稻曲病菌，适用于稻曲病菌田间动态监测，同时可用于稻曲病菌在水稻植株的中的增殖速度和种子带菌的定量检测。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，下列实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护范围。应用实例中DNA提取采用的是试剂盒，实际应用中也可以采用CTAB等方法。
实施例1：水稻生长季节田间浮萍上稻曲病菌菌量的检测
在北京市昌平区中国农业科学院试验基地，选取两块稻田：一块为2004年稻曲病重发生田，另一块位于重病稻田下游的2004年之前一直种植大豆、2004年第一年种植水稻的田块，两块田种植的水稻品种均为稻曲病感病品种优质1号，水稻育苗和插秧期相同。2005年7月15日从上述两块稻田的水面取浮萍，将从田间取回的浮萍立即进行冻干处理。取冻干标样5mg，采用Epicentre公司的MasterPureTM DNA Purification Kit提取、纯化DNA。DNA溶解于20μl TE缓冲液，取1μl DNA溶液作模板，进行荧光定量PCR检测。
荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中10×PCR缓冲液2.5μl，10μmol/L正义引物UF1和反义引物UR1各1μl，20μmol/L荧光探针UP11μl，1mmol/LdNTP 2μl，25mmol/LMg2+2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl(自制)，模板1μl。模板包括标准品10倍梯度稀释液(25ng/μl、2ng/μl、200pg/μl、20pg/μl、200fg/μl)和待测样品DNA溶液。PCR采用两步法，扩增反应程序为先95℃10min，然后95℃15s、60℃1min为1个循环，共40个循环。
循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果(图2)、制作标准曲线(图3)，计算待测样品稻曲病菌DNA含量。结果表明标准品有极好的线性关系，相关系数为0.9985；待测样品有明显的荧光信号增加，并且具有很好的动力学曲线，反应体系中重病田和2004年种植大豆的稻田中稻曲病菌DNA量分别为47.5pg和14.1pg。
表1荧光定量PCR的CT值和样品的DNA含量
| Well | Detector | Task | CT | Std.Dev.CT | Quantity | DNA Quantity |
| D1 | fam | Standard | 8.49 | 6.056 | 1 | 1ng |
| D2 | fam | Standard | 11.03 | 6.056 | 1.00E-01 | 100pg |
| D3 | fam | Standard | 14.35 | 6.056 | 1.00E-02 | 10pg |
| D4 | fam | Standard | 17.59 | 6.056 | 1.00E-03 | 1pg |
| D5 | fam | Standard | 24.03 | 6.056 | 1.00E-05 | 10fg |
| D7 | fam | Unknown | 14 | 8.011 | 1.41E-02 | 14.1pg |
| D9 | fam | Unknown | 12.34 | 8.011 | 4.75E-02 | 47.5pg |
上述结果表明稻曲病菌在水稻的生长季节可以附着在水面的浮萍上，位于稻田下游、第一年种植水稻的田块在7月中旬浮萍也可以检测到稻曲病菌，但是该田块水面的浮萍数量显著少于重病田。通过显微镜观察，在豆田中未看到厚垣孢子，我们推测豆田中的稻曲病菌可能是上游重病田中的厚垣孢子萌发产生的菌丝或分生孢子随水流进入到豆田、并在豆田中进一步增殖。2005年10月调查两块地的发病情况，采用平行跳跃取样法，每块地取9点，每点取5穴，调查发病穴数、发病穗数，计算病穴率和病穗率。重病田的平均病穴率和病穗率分别为100％和44.02％；2004年种植大豆的田块平均病穴率和病穗率分别为95.56％和20.84％，因此我们推断适时清除水面的浮萍可能有效地降低田间的菌源，降低发病率。本试验表明采用荧光定量PCR检测田间稻曲病菌的数量和动态，将为深入研究该病的发生规律和防治提供有用的信息。
实施例2：水稻生殖生长期植株小穗内部稻曲病菌的检测
2004年8月初于水稻生殖生长期在沈阳东陵区汪家乡稻田取样，样本为破口期幼穗。对样本进行反复清洗，镜检确认样本表面无菌丝和孢子后，采用Epicentre公司的MasterPureTM DNA Purification Kit提取、纯化DNA。每个幼穗的DNA溶解于20μlTE缓冲液，取1μl DNA溶液作模板，采用引物对US3-3/US4-5(第一轮)和US1-3/US2-5(第二轮)对各样品进行Nested PCR(巢式PCR)检测，第二轮PCR以1μl第一轮PCR产物为模板。扩增产物经1.2％琼脂糖电泳检测。
选取琼脂糖电泳检测第一轮扩增后在琼脂糖凝胶上无可见扩增带、第二轮扩增有可见扩增带产生的样品进行荧光定量PCR检测。荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中10xPCR缓冲液2.5μl，10μmol/L正义引物UF1和反义引物UR1各1μl，20μmol/L荧光探针UP1 1μl，1mmol/L dNTP 2μl，25mmol/L Mg2+2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl(自制)，模板1μl。模板包括标准品10倍梯度稀释液(25ng/μl、2ng/μl、200pg/μl、20pg/μl、200fg/μl)和待测样品DNA溶液。PCR采用两步法，扩增反应程序为先95℃10min，然后95℃15s、60℃1min为1个循环，共40个循环。
循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果(图4)、制作标准曲线，计算待测样品稻曲病菌DNA含量，根据标准曲线计算出待测样品反应体系中稻曲病菌的DNA量为36.7fg，表明在水稻破口期稻曲病菌已侵入水稻植株，但是在植株中还未大量增殖。采用Nested PCR检测稻曲病菌从扩增到电泳检测需要将近5小时，而荧光定量PCR检测全程仅需要1.5小时即可完成，因此，与传统的PCR检测方法相比，使用该荧光定量PCR方法不仅可以对待测样品中稻曲病菌定量，而且可以明显缩短检测所需要的时间。
附图说明：
图1是引物对US1-3/US2-5(A)、US3-3/US4-5(B)和UF1/UR1(C)扩增稻曲病菌基因组DNA和含有稻曲病菌ITS区质粒DNA产物
CK1为水的阴性对照，CK2反应的模板为水稻DNA，1和2的模板为2个稻曲病菌菌株的基因组DNA，3和4的模板为阳性标准品质粒DNA。M为100bp Marker(鼎国生物技术有限公司)。
图2实例1荧光定量PCR扩增曲线
纵轴为Delta Rn；横轴为Cycle Number，
曲线a，b，c，d和e的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为1ng，100pg，10pg，1pg和10fg；曲线f为重病田的待测样品；曲线g为重病田下游田块的待测样品。
图3实例1荧光定量PCR扩增的标准曲线
纵轴为Ct，横轴为Log CO；标准误为0.998542
图4实例2荧光定量PCR扩增曲线
纵轴为Delta Rn；横轴为Cycle Number，
曲线a，b，c，d和e的模板为阳性标准品，反应体系中DNA含量分别为1ng，100pg，10pg，1pg和10fg；曲线f为待测样品。
Claims (3)
1、一种检测稻曲病菌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括：正义引物UF1、反义引物UR1、Taqman荧光探针、10×PCR buffer、1mmol/LdNTP、25mmol/LMg2+、自制的Taq DNA聚合酶组成，正义引物UF1序列为：5’-GAGGGCACCCGGAACCAG-3’，反义引物UR1序列为：5’-CACTCAGACATGCATTGGAAAACA-3’，扩增片段为77bp，荧光探针UP1序列为：5’FAM-CGCCCGCCGGAGGATACAACCAAA-TAMRA3’，探针5’端标记荧光发射基团FAM，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性由插入ITS区的pUCm-T载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释。
2、根据权利要求1所述的一种检测稻曲病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征是：荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中10×PCR buffer 2.5μl，浓度为10μmol/L的正义引物UF1和反义引物UR1各1μl，浓度为20μmol/L的荧光探针UP1 1μl，1mmol/LdNTP 2μl，25mmol/LMg2+2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液1μl，PCR采用两步法，扩增反应程序为先95℃ 10min，然后95℃ 15s、60℃ 1min为1个循环，共40个循环。
3、权利要求1所述的检测稻曲病菌的荧光定量PCR试剂盒，可以应用于对农田环境中，包括对土壤中越冬菌量以及稻田浮萍和水稻植株上稻曲病菌进行实时监测，以及检测水稻种子带菌、比较稻曲病菌不同菌株在不同水稻品种植株中的增殖速度。
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2005
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