BR112018005863B1 - Método para isolamento, seleção e/ou caracterização de uma linhagem endofítica - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA ISOLAMENTO, SELEÇÃO E/OU CARACTERIZAÇÃO DE UMA LINHAGEM ENDOFÍTICA. A presente invenção refere-se a endófitos, em particular endófitos associados com plantas do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa, plantas infectadas com endófitos, produtos produzidos pelos endófitos e métodos relacionados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a endófitos, plantas infectadas com endófitos, produtos produzidos pelos endófitos e métodos relacionados.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Os micróbios representam uma fonte incalculável de novos genes e compostos que têm o potencial de utilização em uma gama de setores industriais. A literatura científica fornece inúmeros relatos de micróbios sendo a principal fonte de antibióticos, imunossupressores, agentes anticâncer e fármacos de diminuição do colesterol, em adição ao seu uso em descontaminação ambiental e na produção de alimento e cosméticos.
[003] Um grupo relativamente inexplorado de micróbios conhecidos como endófitos, que reside nos tecidos de plantas vivas, oferece uma fonte particularmente diversa de novos compostos e genes que podem prover benefícios importantes para a sociedade e, em particular, agricultura.
[004] Os endófitos frequentemente formam relações mutualísticas com seus hospedeiros, com o endófito conferindo conveniência aumentada para o hospedeiro, frequentemente através da produção de compostos de defesa. Ao mesmo tempo, a planta hospedeira oferece os benefícios de um ambiente protegido e alimento para o endófito.
[005] Outros micróbios, tais como bactérias que podem residir nos tecidos de plantas vivas, são também relativamente inexplorados neste cenário. Bactérias de origem em planta oferecem benefícios similares.
[006] O complexo de espécies Brachiaria-Urochloa é um com ponente da família de gramíneas Poaceae, com representantes distribuídos em regiões tropicais, particularmente na África. Análise de diversidade genética com base em dados de sequência de DNA ribossomal nuclear de espaçador transcrito interno (ITS) indica uma forte afinidade entre Urochloa e Brachiaria, apoiando estudos morfológicos e anatômicos que mostram uma gradação contínua entre esses gêneros de gramíneas. Algumas espécies Brachiaria-Urochloa são gramíneas forrageiras tropicais economicamente significantes que foram liberadas como cultivares comerciais e incluem B. brizantha, B. decumbens, B. humidicola e B. ruziziensis, bem como híbridos interespecíficos e intraespecíficos correspondentes.
[007] Métodos para a identificação e caracterização de novos endófitos e seu desenvolvimento em programas de aperfeiçoamento de planta Brachiaria-Urochloa foram discutidos no WO2012/174585, cujo relatório descritivo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Cepas de fungos endofíticos foram isoladas de espécies Brachiaria-Urochloa. Esses endófitos fúngicos de brachiaria eram geneticamente diversos. Alguns desses endófitos exibiram atividade antifúngica de amplo espectro e podem desempenhar um papel em proteção de Brachiaria-Urochloa de patógenos fúngicos, tal como Drechslera spp., que causa manchas em folha.
[008] Permanece uma falta geral de informação e conhecimento dos endófitos fúngicos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa bem como de métodos para a identificação e caracterização de novos endófitos e seu emprego em programas de melhoramento de planta Brachiaria-Urochloa.
[009] Há também uma falta geral de informação e conhecimento dos endófitos bacterianos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa bem como de métodos para a identificação e caracterização de novos organismos bacterianos e seu emprego em programas de melhoramento de planta Brachiaria-Urochloa.
[010] Ainda, embora amplamente usada para agricultura baseada em pasto em regiões tropicais da América do Sul, Ásia e Austrália,Brachiaria-Urochloa exibe vários inconvenientes que restringem ambos se uso e melhoramento genético.
[011] Gramíneas forrageiras, incluindo Brachiaria-Urochloa, foram também reconhecidas nos últimos anos para implicações em poluição de nitrogênio. Uma questão principal de produção moderna na agricultura é o alto nível de poluição de nitrogênio (N) e baixa eficiência de utilização de N. Perdas de N da desnitrificação resulta em poluição ambiental e uso ineficiente de ambos N do solo e N aplicado (como fertilizante).
[012] Nitrificação é realizada principalmente por dois grupos de bactérias quimiolitotróficas (Nitrosomas sp. e Nitrobacter spp.), componentes ubíquos da população microbiana do solo. Por exemplo, bactérias do solo que realizam nitrificação, tal como Nitrosomonas spp., convertem amônio (NH4+) em nitrato (NO3-). O nitrato pode ser também convertido em gás de óxido nitroso (N2O). Inibição de nitrificação pode manter N no solo por mais tempo e melhorar a eficiência de uso de nitrogênio (NUE).
[013] Um ensaio de bioluminescência usando uma linhagem recombinante de Nitrosomonas europaea foi desenvolvido para detectar inibidores de nitrificação liberados de raízes de planta, tornando possível determinar e comparar a capacidade de inibição de nitrificação biológica (BNI) de culturas e pastos diferentes (Subbarao e outros, 2006).
[014] O conceito de plantas liberando compostos inibidores que suprimem nitrificação do solo foi sugerido anteriormente. Vários pesquisadores observaram uma taxa baixa de nitrificação em solos de certos solos de pastagem e floresta tropicais. BNI é a habilidade de certas espécies de planta em liberar compostos orgânicos de suas raízes que têm um efeito supressivo direcionado sobre bactérias de nitrificação do solo (Subbarao e outros, 2006-2009).
[015] A braquialactona é o principal inibidor de nitrificação liberado de raízes de B. humidicola (Subbarao e outros, 2009). A braquialactona pertence a um grupo de diterpenos chamados Fusicocanos. Os fusicocanos foram identificados e isolados de uma gama diversa de plantas, fungos e bactérias. A braquialactona foi mostrada exibir atividade biocida contra Nitrosomonas spp. (Subbarao e outros, 2009). N está então disponível para planta, aumentando o desempenho do pasto. A literatura sugeriu que este composto é produzido pela planta em resposta a amônio no ambiente da raiz (Subbarao e outros, 2009).
[016] É um objetivo da presente invenção superar, ou pelo menos aliviar, uma ou mais das dificuldades ou deficiências associadas com a técnica anterior.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[017] Em um aspecto, a presente invenção provê um método para isolamento, seleção e/ou caracterização de uma linhagem de endófito, o dito método incluindo:
[018] provisão de amostras de material de planta de espécies de planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa;
[019] submissão das ditas amostras à análise metagenômica;
[020] identificação de unidades taxonômicas operacionais bacterianas e/ou fúngicas (OTUs) em cada espécie de planta Brachiaria- Urochloa;
[021] comparação das OTUs presentes em cada espécie de amostra para identificar microbiomas de núcleo, suplementares e/ou únicos; e
[022] seleção de linhagens de endófito representando um micro- bioma de núcleo, suplementar ou único desejado.
[023] Por uma linhagem de endófito quer dizer uma linhagem bacteriana ou fúngica que é intimamente associada com uma planta, preferivelmente uma planta do complexo de espécies Brachiaria- Urochloa. Por ‘associado com’ neste contexto quer dizer que as bactérias ou fungos vivem sobre, na ou em proximidade grande com a planta. Por exemplo, ela pode ser endofítica, por exemplo, vivendo dentro dos tecidos internos da planta, ou epifítica, por exemplo, crescendo externamente sobre a planta.
[024] O material de planta usado para preparar as amostras é de uma planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa. Mais particularmente, a planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa é selecionada do grupo consistindo em Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humi- dicola, Urochloa mosambicensis, Brachiaria marlothii, Brachiaria nigro- pedata, Urochloa dictyoneura, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Brachiaria obtusiflora, Brachiaria serrifolia, Urochloa advena, Urochloa arrecta, Urochloa brachyura, Urochloa eminii, Urochloa mollis, Urochloa xantholeuca, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Urochloa plantaginea, Urochloa platynota, Urochloa xantholeuca, Brachiaria holosericea, Brachiaria reptans, Brachiaria milliformis e Brachiaria distachya, bem como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa.
[025] Em uma modalidade particularmente preferida, a planta do complexo Brachiaria-Urochloa é selecionada do grupo consistindo em Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria ruziziensis e Urochloa mosambicensis.
[026] Preferivelmente, as amostras de material de planta são selecionadas do grupo consistindo em material de folha, caule, raiz e semente. Ainda mais preferivelmente, amostras de tipos de folha, caule e raiz são providas. Alternativamente, amostras de semente são providas. Em uma outra modalidade preferida, amostras de material de folha, caule, raiz e semente são providas.
[027] Ao ‘submeter as ditas amostras à análise metagenômica’ como aqui usado quer dizer que dados de sequência metagenômica são gerados a partir do material de planta. Mais particularmente, material genético recuperado das amostras de planta é analisado para produzir dados de sequência bacteriana e/ou fúngica.
[028] O termo ‘recuperação de material genético’ inclui a extração de material genético, incluindo DNA, da amostra de material de planta.
[029] O material genético recuperado das amostras de planta pode ser enriquecido em DNA de linhagens endofíticas (tal como DNA bacteriano e/ou fúngico) intimamente associadas com a planta, como parte do processo de recuperação do material genético a partir da amostra de material de planta.
[030] Desta maneira, em uma modalidade preferida, a etapa de provisão de amostras de material de planta a partir de espécies de planta do complexo de espécie Brachiaria-Urochloa inclui as etapas de:
[031] moagem do material de planta;
[032] lavagem do material de planta triturado com álcool; e
[033] extração de ácido nucleico da lavagem com álcool.
[034] Neste aspecto da invenção, preferivelmente o material de planta é semente de planta. Preferivelmente o material de planta é moído grosseiramente. Preferivelmente o álcool é etanol, mais preferivelmente etanol 100%. Preferivelmente o material de planta moído é lavado múltiplas vezes, por exemplo, duas vezes com álcool. Preferivelmente o ácido nucleico é DNA.
[035] As requerentes constataram surpreendentemente que é possível reduzir a quantidade de ácido nucleico na planta, por exemplo, ácido nucleico da semente da planta e/ou enriquecer em ácido nucleico de linhagens endofíticas moendo grosseiramente o tecido da planta, por exemplo, semente, e então lavando este em álcool, preferivelmente etanol. Embora as requerentes não desejem ser limitadas pela teoria, é pensado que o álcool aja para preservar o componente micróbio do material de planta, particularmente semente. Extração de ácido nucleico, por exemplo, DNA de lavagens de álcool, por exemplo, etanol, reduz a quantidade de ácido nucleico na planta hospedeira e enriquece em ácido nucleico do micróbio. Isto supera ou pelo menos alivia o problema de um ou mais métodos da técnica anterior, incluindo aqueles que geram números grandes de leituras de sequência para capturar o componente microbiano ou usa diferenças em ácido nucleico, por exemplo, densidade de metilação de DNA, para distinguir entre ácido nucleico de hospedeiro e microbiano.
[036] Em uma modalidade preferida, iniciadores de reação em cadeia da polimerase (PCR) universais para traçado de perfil microbioma bacteriano e/ou microbioma fúngico podem ser usados para gerar os dados de sequência. Por exemplo, iniciadores direcionados ao gene de rDNA 16S, mais particularmente a região V4 do gene de rDNA 16S, podem ser usados para traçado de perfil de microbioma bacteriano. Por exemplo, iniciadores direcionados à região de espaçador transcrito interno (ITS) de genes de rDNA, mais particularmente a região ITS2 de genes de rDNA, podem ser usados para traçado de perfil de microbioma fúngico.
[037] Em uma modalidade, dados de sequência bacteriana são produzidos usando iniciadores universais direcionados à região V4 do gene de rDNA 16S e os dados de sequência fúngica são produzidos usando iniciadores universais direcionados à região ITS2 dos genes de rDNA.
[038] Dados de sequência metagenômicos podem ser agrupados para criar as unidades taxonômicas operacionais (OTUs) bacterianas e/ou fúngicas. Preferivelmente, os dados de sequência metagenômicos podem ser equilibrados em qualidade e então emparelhados usando um dispositivo para agrupamento de extremidade emparelhada para sequências, tal como PANDAseq, para criar as OTUs bacterianas e/ou fúngicas.
[039] As OTUs podem ser alinhadas contra um banco de dados bacteriano, tal como o banco de dados GreenGenes e/ou um banco de dados fúngico, tal como o banco de dados fúngico UNITE, para designar taxonomia.
[040] O número de sequências associadas com OTUs pode ser calculado para cada amostra.
[041] Ao comparar as OTUs presentes em cada espécie de amostra, microbiomas de núcleo, suplementares e únicos podem ser identificados. Por um ‘microbioma’ quer dizer os genomas coletivos das bactérias e/ou fungos. Por um ‘microbioma de núcleo’ quer dizer OTUs que são encontradas em todas ou substancialmente todas as espécies Brachiaria-Urochloa testadas. Por um ‘microbioma suplementar’ quer dizer OTUs que são encontradas em um subconjunto das espécies Brachiaria-Urochloa testadas. Por um ‘microbioma único’ quer dizer OTUs associadas com espécies Brachiaria-Urochloa específicas.
[042] Endófitos tendo um microbioma de núcleo, suplementar ou único desejado podem então ser selecionados. Por exemplo, endófitos com uma gama de hospedeiro ampla podem ser selecionados como candidatos para fornecimento de características a plantas do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa. Por exemplo, endófitos com uma gama de hospedeiro estreita ou específica podem ser selecionados como candidatos para características de interesse específicas, por exemplo, para produção de compostos que proveem propriedades benéficas tal como tolerância aperfeiçoada à água e/ou estresse de nutriente ou resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças na planta com a qual o endófito está associado. Em uma modalidade preferida, as propriedades benéficas incluem atividade inseticida ou repelente de inseto. Em uma modalidade preferida adicional, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica. Em uma modalidade particularmente preferida o composto pode ser um composto inibidor, tal como um inibidor de nitrificação, por exemplo, um fusicocano, tal como braquialactona.
[043] Em um segundo aspecto da presente invenção é provido um endófito substancialmente purificado ou isolado selecionado do grupo consistindo em Hypocrea sp./Acremonium sp., Acremonium sp., Microsphaeropsis arundis e Sarocladium sp./Acremonium sp., como descrito aqui. Preferivelmente o dito endófito é isolado, selecionado e/ou caracterizado por um método como descrito aqui anteriormente.
[044] Amostras representativas, a saber Hypocrea sp./Acremonium sp. 2.15.A.2, Acremonium sp. 2.3.C.1, Microsphaeropsis arundis 2.10.D.1, Sarocladium sp./Acremonium sp. 2.12.B.1, Sarocladium sp./Acremonium sp. 2.10.C.2 e Sarocladium sp./Acremonium sp. 2.11.B.1, foram depositadas no The National Measurement Institute em 22 de setembro de 2015 com números de acesso V15/028236, V15/028237, V15/028238, V15/028239, V15/028240, V15/028241 e V15/028242, respectivamente.
[045] Por ‘substancialmente purificado’ quer dizer que o endófito é livre de outros organismos. O termo inclui então, por exemplo, um endófito em cultura axênica. Preferivelmente, o endófito é pelo menos aproximadamente 90% puro, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 98% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 99% puro. Preferivelmente o endófito é uma cultura axênica.
[046] O termo ‘isolado’ significa que o endófito é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele for de ocorrência natural). Por exemplo, um endófito de ocorrência natural presente em uma planta viva não é isolado, mas o mesmo endófito separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural é isolado.
[047] Em seu ambiente natural, o endófito pode viver mutua- listicamente dentro de uma planta. Alternativamente, o endófito pode ter um epífito, isto é, cresce preso a ou sobre uma planta. O endófito pode ser um endófito fúngico ou um endófito bacteriano.
[048] O endófito da presente invenção pode, em seu ambiente natural, estar associado com uma planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa. Mais particularmente a planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa é selecionada do grupo consistindo em Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis, Brachiaria marlothii, Brachiaria nigropedata, Urochloa dictyoneura, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Brachiaria obtusiflora, Brachiaria serrifolia, Urochloa advena, Urochloa arrecta, Urochloa brachyura, Urochloa eminii, Urochloa mollis, Urochloa xantholeuca, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Urochloa plantaginea, Urochloa platynota, Urochloa xantholeuca, Brachiaria holosericea, Brachiaria reptans, Brachiaria milliformis e Brachiaria distachya, bem como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa.
[049] Em uma modalidade particularmente preferida, a planta do complexo Brachiaria-Urochloa é selecionada do grupo consistindo em Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria ruziziensis e Urochloa mosambicensis.
[050] Por ‘associado com’ neste contexto quer dizer que o endófito vive sobre, na ou em proximidade grande com a planta. Por exemplo, ele pode ser endofítico, por exemplo, vivendo dentro dos tecidos internos da planta, ou epifítico, por exemplo, crescendo externamente sobre a planta.
[051] O fungo pode ser um heterótrofo que usa carbono orgânico para crescimento, mais particularmente um saprótrofo que obtém nutrientes ao consumir detritos.
[052] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma planta inoculada com um endófito como descrito aqui anteriormente, a dita planta compreendendo uma planta hospedeira livre de endófito estavelmente infectada com o dito endófito. Preferivelmente, a dita planta é uma planta com a qual o endófito não está associado naturalmente.
[053] Em uma modalidade preferida, a planta com a qual o endófito está associado tem resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças em relação a uma planta controle não inoculada. Preferivelmente, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade inseticida ou repelente de inseto. Em uma modalidade preferida adicional, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.
[054] Em uma modalidade preferida, o endófito ou planta com a qual o endófito está associado pode produzir um ou mais compostos que proveem propriedades benéficas tal como tolerância aperfeiçoada à água e/ou estresse de nutriente ou resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças na planta com a qual o fungo está associado. Em uma modalidade preferida, as propriedades benéficas incluem atividade inseticida ou repelente de inseto. Em uma modalidade preferida adicional, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.
[055] Em uma modalidade particularmente preferida, o endófito ou planta com a qual o endófito está associado pode produzir um composto inibidor, tal como um inibidor de nitrificação, por exemplo, fusicocano tal como braquialactona.
[056] Em uma modalidade preferida, a planta hospedeira pode ser inoculada com mais de uma linhagem de endófito de acordo com a presente invenção.
[057] Preferivelmente, a planta é uma planta agrícola tal como uma espécie gramínea, preferivelmente gramíneas de forragem, relva ou bioenergia ou uma gramínea de cultura de grão ou cultura industrial.
[058] A gramínea de forragem, relva ou bioenergia pode ser aquelas pertencentes ao complexo de espécies Brachiaria-Urochloa (gramíneas panic) incluindo Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, B. dictyoneura, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis bem como híbridos interespecíficos ou intraespecíficos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa, e aqueles pertencentes aos gêneros Lolium e Festuca, incluindo L. perene (azevém perene) e L. arundinaceum (festuca alta) e L. multiflorum (azevém Italiana).
[059] As gramíneas de cultura de grão e cultura industrial podem ser aquelas pertencentes ao gênero Triticum, incluindo T. aestivum (trigo), aquelas pertencentes ao gênero Hordeum, incluindo H. vulgare (cevada), aquelas pertencentes ao gênero Zea, incluindo Z. mays (milho), aquelas pertencentes ao gênero Oryza, incluindo O. sativa (arroz), aquelas pertencentes ao gênero Saccharum incluindo S. officinarum (cana-de-açúcar), aquelas pertencentes ao gênero Sorghum incluindo S. bicolor (sorgo), aquelas pertencentes ao gênero Panicum, incluindo P. virgatum (grama de pradaria) e aquelas pertencentes aos gêneros Miscanthus, Paspalum, Pennisetum, Poa, Eragrostis e Agrostis.
[060] Preferivelmente, a planta é infectada com o endófito através de um método selecionado do grupo consistindo em inoculação por reprodução, cruzamento, hibridização, transdução, transfecção, transformação e/ou direcionamento de gene; e combinações dos mesmos.
[061] As plantas infectadas com endófito podem ser cultivadas através de técnicas conhecidas. O versado na técnica pode prontamente determinar condições de cultura apropriadas dependendo da planta a ser cultivada.
[062] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma planta, semente de planta ou outra parte de planta derivada de uma planta da presente invenção e estavelmente infectada com um endófito da presente invenção. Preferivelmente, a planta, semente de planta ou outra parte de planta com a qual o endófito está associado tem resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças em relação a uma planta, semente de planta ou outra parte de planta controle não inoculada. Em uma modalidade preferida, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade inseticida ou repelente de inseto. Em uma modalidade preferida adicional, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.
[063] Em uma modalidade particularmente preferida, endófito ou planta com a qual o endófito está associado pode produzir um composto inibidor, tal como um inibidor de nitrificação, por exemplo, um fusicocano tal como braquialactona.
[064] Preferivelmente, a célula de planta, planta, semente de planta ou outra parte de planta é de uma gramínea, mais preferivelmente uma gramínea de forragem, relva, bioenergia, cultura de grão ou cultura industrial.
[065] As gramíneas de forragem, relva ou bioenergia podem ser aquelas pertencentes ao complexo de espécies Brachiaria-Urochloa (gramíneas panic), incluindo Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, B. dictyoneura, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis bem como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa, tais como híbridos interespecíficos entre Brachiaria ruziziensis x Brachiaria brizantha, Brachiaria ruziziensis x Brachiaria decumbens, [Brachiaria ruziziensis x Brachiaria decumbens] x Brachiaria brizantha, [Brachiaria ruziziensis x Brachiaria brizantha] x Brachiaria decumbens e aquelas pertencentes aos gêneros Lolium e Festuca, incluindo L. perene (azevém perene) e L. arundinaceum (festuca alta) e L. multiflorum (azevém Italiana).
[066] As gramíneas de cultura de grão ou cultura industrial podem ser aquelas pertencentes ao gênero Triticum, incluindo T. aestivum (trigo), aquelas pertencentes ao gênero Hordeum, incluindo H. vulgare (cevada), aquelas pertencentes ao gênero Zea, incluindo Z. mays (milho), aquelas pertencentes ao gênero Oryza, incluindo O. sativa (arroz), aquelas pertencentes ao gênero Saccharum incluindo S. officinarum (cana-de-açúcar), aquelas pertencentes ao gênero Sorghum incluindo S. bicolor (sorgo), aquelas pertencentes ao gênero Panicum, incluindo P. virgatum (grama de pradarias) e aquelas pertencentes aos gêneros Miscanthus, Paspalum, Pennisetum, Poa, Eragrostis e Agrostis.
[067] Por ‘célula de planta’ quer dizer qualquer célula de autopro- pagação ligada por uma membrana semipermeável e contendo plastídeo. Tal célula também necessitaria uma parede celular se propagação adicional for desejada. Célula de planta, como aqui usado, inclui, sem limitação, culturas em suspensão de semente, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos.
[068] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uso de um endófito como aqui anteriormente descrito para produzir uma planta estavelmente infectada com o dito endófito. Preferivelmente, a planta com a qual o endófito é associado tem resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças em relação a uma planta controle não inoculada. Em uma modalidade preferida, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade inseticida ou repelente de inseto. Em uma modalidade preferida adicional, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.
[069] Em uma modalidade preferida, o endófito ou planta com a qual o endófito está associado pode produzir um ou mais compostos que proveem propriedades benéficas tal como tolerância aperfeiçoada à água e/ou estresse de nutriente ou resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças na planta com a qual o fungo está associado. Em uma modalidade preferida, as propriedades benéficas incluem atividade inseticida ou repelente de inseto. Em uma modalidade preferida adicional, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.
[070] Em uma modalidade particularmente preferida, o endófito ou planta com a qual o endófito está associado pode produzir um composto de inibição, tal como um inibidor de nitrificação, por exemplo, um fusicocano, tal como braquialactona.
[071] Em uma outra modalidade preferida, a planta com a qual o endófito está associado é uma gramínea de forragem, relva, bioenergia, cultura de grão ou cultura industrial como aqui anteriormente descrito.
[072] Em um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método de aumento da resistência a pestes e/ou doenças em uma planta, o dito método incluindo inoculação da dita planta com um endófito como aqui anteriormente descrito. Preferivelmente, a planta com a qual o endófito está associado tem resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças em relação a uma planta controle não inoculada. Em uma modalidade preferida, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade inseticida ou repelente de inseto. Em uma modalidade preferida adicional, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.
[073] Em ainda uma outra modalidade preferida, a planta com a qual o endófito está associado é uma gramínea de forragem, relva, bioenergia, cultura de grão ou cultura industrial como aqui anteriormente descrito.
[074] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de produção de um fusicocano, o dito método incluindo
[075] isolamento de um endófito de uma planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa;
[076] cultivo do dito endófito em um meio de cultura adequado; e
[077] recuperação de um ou mais compostos orgânicos incluindo o fusicocano a partir de células de endófito, do meio de cultura ou de espaço aéreo associado com o meio de cultura ou endófito.
[078] Preferivelmente o endófito é um endófito como aqui anteriormente descrito.
[079] Preferivelmente, o fusicocano é composto de fórmula I:
[080] de outro modo conhecido como braquialactona, ou um derivado, um isômero e/ou um sal do mesmo.
[081] Preferivelmente, a planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa é selecionada do grupo consistindo em Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera,Brachiaria ruziziensis, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens,Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis, Brachiaria marlothii, Brachiaria nigropedata, Urochloa dictyoneura, Urochloa oligotricha,Urochloa panicoides, Brachiaria obtusiflora, Brachiaria serrifolia, Urochloa advena, Urochloa arrecta, Urochloa brachyura, Urochloa eminii, Urochloa mollis, Urochloa xantholeuca, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Urochloa plantaginea, Urochloa platynota, Urochloa xantholeuca, Brachiaria holosericea, Brachiaria reptans, Brachiaria milliformis e Brachiaria distachya, bem como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa.
[082] Preferivelmente o endófito é cultivado em um meio de cultura incluindo uma fonte de carboidratos.
[083] A fonte de carboidratos pode ser uma ágar ou caldo à base de amido/açúcar tal como ágar de dextrose de batata, caldo de dextrose de batata ou ágar metade de dextrose de batata ou um ágar ou caldo baseado em cereal tal como ágar de farinha de aveia ou caldo de farinha de aveia. Outras fontes de carboidratos podem incluir ágar de endófito, Murashige e Skoog com sacarose 20%, metade suco V8/metade PDA, ágar de água e ágar de extrato de malte de levedura.
[084] Em uma modalidade preferida, o endófito pode ser cultivado em um meio de cultura incluindo dextrose de batata ou farinha de aveia, por exemplo, ágar de dextrose de batata, ágar metade de dextrose de batata, ágar de farinha de aveia, caldo de dextrose de batata ou caldo de farinha de aveia. Mais preferivelmente, o fungo pode ser cultivado em um meio de cultura incluindo farinha de aveia.
[085] O endófito pode ser cultivado sob condições aeróbicas ou anaeróbicas.
[086] O endófito pode ser cultivado por um período de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 dias, mais preferivelmente de a partir de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 dias, mais preferivelmente de a partir de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 dias.
[087] Em uma modalidade preferida, o endófito pode ser cultivado em um biorreator. Por um ‘biorreator’ quer dizer um dispositivo ou sistema que apoia um ambiente biologicamente ativo, tal como um recipiente no qual é realizado um processo químico envolvendo fungos das presente invenção e/ou produtos dos mesmos. O processo químico pode ser aeróbico ou anaeróbico. O biorreator pode ter um volume variando em tamanho de mililitros a metros cúbicos, por exemplo, de a partir de aproximadamente 50 mililitros a aproximadamente 50.000 litros. O biorreator pode ser operado através de cultura em batelada, cultura em batelada alimentada, cultura de perfusão ou cultura contínua, por exemplo, cultura contínua em um biorreator de tanque agitado. Endófitos cultivados no biorreator podem ser suspensos ou imobilizados.
[088] O método inclui a etapa de recuperação de um ou mais compostos orgânicos incluindo o fusicocano de células de endófito, do meio de cultura ou do espaço aéreo associado com o meio de cultura ou endófito.
[089] Por exemplo, o(s) composto(s) orgânico(s) pode(m) ser recuperado(s) de tecidos intracelulares, do meio de cultura no qual o endófito pode secretar líquidos ou do espaço aéreo no qual o endófito pode secretar vapores.
[090] Vapores podem se originar diretamente do endófito ou dos líquidos secretados que transitam entre fases de vapor e líquida.
[091] A etapa de recuperação do(s) composto(s) orgânico(s) é preferivelmente feita separando as células do meio de cultura ou capturando vapores associados com o meio de cultura ou endófito.
[092] Preferivelmente o(s) composto(s) orgânico(s) é então isolado ou purificado através de um método selecionado do grupo consistindo em cromatografia gasosa, cromatografia líquida, destilação fracional, destilação criogênica, separação de membrana e cromatografia de absorção, tal como adsorção por oscilação de pressão, vácuo ou temperatura.
[093] Por ‘composto orgânico’ quer dizer um composto química, cuja molécula contém o elemento carbono.
[094] Em uma modalidade preferida, o composto orgânico pode ser um hidrocarboneto tal como um hidrocarboneto volátil ou um hidrocarboneto líquido. Mais preferivelmente, o composto orgânico pode ser um hidrocarboneto volátil.
[095] Por ‘hidrocarboneto’ quer dizer um composto orgânico com preendendo os elementos carbono e hidrogênio.
[096] O termo ‘volátil’ neste contexto quer dizer um composto orgânico que pode evaporar ou sublimar em temperatura e pressão de laboratório padrão. Compostos orgânicos voláteis incluem aqueles com uma pressão de vapor alta, ponto de ebulição baixo e/ou peso molecular baixo.
[097] Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um método de produção de um fusicocano em uma planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa, o dito método incluindo:
[098] provisão de uma planta do complexo de espécies Brachiaria- Urochloa; e
[099] um endófito, preferivelmente um endófito como aqui anteriormente descrito;
[0100] infecção da dita planta com o dito endófito para formar uma simbiota;
[0101] cultivo da simbiota em um meio de cultura adequado, de maneira que o fusicocano é produzido.
[0102] Preferivelmente, a planta do complexo de espécies Brachiaria- Urochloa é selecionada do grupo consistindo em Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera,Brachiaria ruziziensis, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis, Brachiaria marlothii, Brachiaria nigropedata, Urochloa dictyoneura, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Brachiaria obtusiflora, Brachiaria serrifolia, Urochloa advena, Urochloa arrecta, Urochloa brachyura, Urochloa eminii, Urochloa mollis, Urochloa xantholeuca, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Urochloa plantaginea, Urochloa platynota, Urochloa xantholeuca, Brachiaria holosericea, Brachiaria reptans, Brachiaria milliformis e Brachiaria distachya, bem como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa.
[0103] Preferivelmente, a planta é infectada com o endófito através de um método selecionado do grupo consistindo em inoculação, reprodução, cruzamento, hibridização, transdução, transfecção, transformação e/ou direcionamento de gene; e combinações dos mesmos.
[0104] As plantas infectadas com endófito podem ser cultivadas através de técnicas conhecidas. O versado na técnica pode prontamente determinar condições de cultura apropriadas dependendo da planta a ser cultivada.
[0105] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma planta, semente de planta ou outra parte de planta derivada de uma planta produzida através do método da presente invenção e estavel- mente infectada com um endófito da presente invenção. Preferivelmente, a planta, semente de planta ou outra parte de planta com a qual o endófito está associado tem resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças em relação a uma planta, semente de planta ou outra parte de planta controle não inoculada. Em uma modalidade preferida, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade inseticida ou repelente de inseto. Em uma modalidade preferida adicional, a resistência aperfeiçoada a pestes e/ou doenças inclui atividade antifúngica.
[0106] Em uma modalidade particularmente preferida, o endófito ou planta com a qual o endófito está associado pode produzir um composto inibidor, tal como um inibidor de nitrificação, por exemplo, um fusicocano tal como braquialactona.
[0107] Preferivelmente, a célula de planta, planta, semente de planta ou outra parte de planta é de uma gramínea, mais preferivelmente uma gramínea de forragem, relva, bioenergia, cultura de grão ou cultura industrial.
[0108] As gramíneas de forragem, relva ou bioenergia podem ser aquelas pertencentes ao complexo de espécies Brachiaria-Urochloa (gramíneas panic), incluindo Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, B. dictyoneura, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis bem como híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa, tais como híbridos interespecíficos entre Brachiaria ruziziensis x Brachiaria brizantha, Brachiaria ruziziensis x Brachiaria decumbens, [Brachiaria ruziziensis x Brachiaria decumbens] x Brachiaria brizantha, [Brachiaria ruziziensis x Brachiaria brizantha] x Brachiaria decumbens e aquelas pertencentes aos gêneros Lolium e Festuca, incluindo L. perene (azevém perene) e L. arundinaceum (festuca alta) e L. multiflorum (azevém Italiana).
[0109] A gramínea de cultura de grão ou cultura industrial pode ser aquelas pertencentes aos gêneros Triticum, incluindo T. aestivum (trigo), aquelas pertencentes ao gênero Hordeum, incluindo H. vulgare (cevada), aquelas pertencentes ao gênero Zea, incluindo Z. mays (milho), aquelas pertencentes ao gênero Oryza, incluindo O. sativa (arroz), aquelas pertencentes ao gênero Saccharum incluindo S. officinarum (cana-de- açúcar), aquelas pertencentes ao gênero Sorghum incluindo S. bicolor (sorgo), aquelas pertencentes ao gênero Panicum, incluindo P. virgatum (grama de pradarias) e aquelas pertencentes aos gêneros Miscanthus, Paspalum, Pennisetum, Poa, Eragrostis e Agrostis.
[0110] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de inoculação de uma planta do complexo de espécies Brachiaria- Urochloa com um ou mais endófitos, o dito método incluindo
[0111] provisão de semente da planta esterilizada do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa;
[0112] germinação da semente sob condições assépticas para produzir plantas hospedeiras que são substancialmente livres de organismos microbianos;
[0113] inoculação das plantas hospedeiras com um ou mais endó- fitos.
[0114] Embora a Requerente não deseje ser limitada pela teoria, é acreditado que condução do método da presente invenção sob condições assépticas assegure que os endófitos sejam inoculados nas plantas hospedeiras que são substancialmente livres de organismos microbianos, desta maneira facilitando uma frequência alta de inoculação bem sucedida. Ainda, é pensado que o uso de meios diferentes antes da inoculação para permitir que a planta hospedeira se estabeleça, tais como meios de promoção de crescimento da raiz, também facilite frequência de inoculação alta. O uso de um ambiente estéril também permite análise do microbioma sem contaminação.
[0115] Por exemplo, a frequência de inoculação pode ser entre aproximadamente 25% e aproximadamente 100%, mais preferivelmente entre 50% e aproximadamente 100%, ainda mais preferivelmente entre aproximadamente 75% e aproximadamente 100%. A frequência de inoculação pode ser maior do que métodos convencionais.
[0116] Preferivelmente, a planta do complexo de espécies Brachiaria- Urochloa é de uma espécie como aqui anteriormente descrito.
[0117] Preferivelmente os ditos um ou mais endófitos são selecio nados dos endófitos como aqui anteriormente descrito. O um ou mais endófitos podem ser bacterianos ou fúngicos ou uma mistura dos mesmos. Em uma modalidade preferida, a etapa de germinação da semente sob condições assépticas para produzir plantas hospedeiras pode incluir cultivo da semente germinada em meio de multiplicação de broto tal como M3B e meio de multiplicação de raiz tal como MS+NAA. Preferivelmente, a semente germinada pode ser cultivada em meio de multiplicação de broto, separando os brotos resultantes em perfilhos únicos e então transferindo-os para meio de multiplicação de raiz. Os perfilhos únicos podem ser cultivados no meio de multiplicação de raiz por aproximadamente 1 a aproximadamente 6 semanas, mais preferivelmente aproximadamente 2 a aproximadamente 3 semanas, para promover crescimento da raiz. As plântulas resultantes podem novamente ser separadas em perfilhos únicos para inoculação de endófito.
[0118] Em uma modalidade preferida, a etapa de inoculação das plantas hospedeiras com um ou mais endófitos pode incluir remoção da bainha externa para revelar início do broto, criação de uma ferida no meristema do broto e inoculação na ferida.
[0119] Em uma modalidade preferida, o método pode incluir a etapa adicional de retenção das plântulas em meios estéreis seguindo inoculação, preferivelmente por um período de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 semanas, mais preferivelmente aproximadamente 2 a aproximadamente 3 semanas.
[0120] Em uma modalidade preferida, o método pode incluir a etapa adicional de transferência das plantas inoculadas então produzidas para solo ou meio similar para crescimento adicional, por exemplo, sob condições de estufa.
[0121] A presente invenção será agora descrita mais integralmente com referência aos Exemplos e desenhos acompanhantes. Deve ser compreendido, no entanto, que a descrição que segue é ilustrativa apenas e não deve ser de modo algum considerada uma restrição na generalidade da invenção descrita acima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS
[0122] A Figura 1 mostra a incidência de isolatos de endófito em espécies brachiaria com base em análise de sequência de rDNA do espaçador transcrito interno (ITS) e regiões de codificação 18S. Isolatos de endófito Brachiaria são geneticamente diversos, representando pelo menos 10 grupos taxonômicos distintos.
[0123] A Figura 2 mostra uma árvore de consenso de bootstrap gerada através de análise de união de vizinho da região ITS de isolatos de endófito fúngico derivados de acessos de Brachiaria-Urochloa (lado esquerdo) e a identificação da presença/ausência de linhagens de endófito fúngico isoladas e culturáveis selecionadas nos microbiomas de 5 espécies de Brachiaria-Urochloa (lado direito) (Bb- B. brizantha; Bh - B. humidicola; Bd - B. decumbens; Um - U. mosambicensis; Br - B. ruziziensis) com base na sequência de ITS.
[0124] A Figura 2A é uma árvore de consenso de bootstrap aumentada da Figura 2.
[0125] A Figura 3 mostra um espectro de massa LC(ESI)-MS identificando braquialactona, exibindo cromatograma de íon extraído em RT: 8,91-8,98 minutos.
[0126] A Figura 4 mostra fragmentos de braquialactona de frag mentação MS (333.2059, 315.1964, 271.2068) em RT 8,93 minutos dos espectros de massa LC(ESI)-MS da Figura 3.
[0127] A Figura 5 mostra a estrutura de braquialactona e as estru turas dos fragmentos responsáveis pela fragmentação da Figura 4.
[0128] A Figura 6 mostra estágios consecutivos de um procedimento de inoculação de endófito otimizado para Brachiaria-Urochloa. A. Plântulas doadores livres de micróbio cultivadas em meios de multiplicação de raiz (M3B) sob condições estéreis; B. Brotos doadores separados em perfilhos únicos e transferidos para meios de multiplicação de raiz (MS+NAA); C. Perfilhos únicos cultivados por 2-3 semanas para promover crescimento de raiz antes de separação dos perfilhos em perfilhos únicos, remoção da bainha externa para revelar início do broto, transferência para ágar de água e inoculação em um corte pequeno que é feito através do meristema do broto; D. Plântulas inoculadas retidas em meio MS % por 2 semanas; E. Plântulas após transferência para o solo e cultivo sob condições de estufa por 8 semanas.
[0129] A Figura 7 mostra um fluxograma descrevendo um método para traçado de perfil de microbiomas bacteriano e fúngico associados com semente. As fotografias acompanhantes mostram cada estágio do método de enriquecimento para DNA bacteriano e fúngico de 50 g de semente de um acesso. A. Secagem ao ar das sementes antes da moagem; B. Coleta da lavagem de etanol 100%. O sobrenadante contém o microbioma endofítico associado à semente; C. Frascos durante evaporação de etanol; D. Análise de DNA extraído de cada um dos 10 Acessos (colunas 1 a 10) para determinar presença de DNA fúngico. E. Análise de DNA extraído para determinar presença de DNA bacteriano.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES Exemplo 1 - Perfil microbiano endofítico de espécies Brachiaria- Urochloa
[0130] Os microbiomas endofíticos de cinco espécies de Brachiaria- Urochloa tiveram perfil traçado usando metagenômica. As espécies incluíam B. brizantha, B. humidicola, B. ruziziensis, B. decumbens e U. mosambicensis. Um total de três plantas teve o perfil traçado por espécie. Três órgãos tiveram o perfil traçado de cada planta (raízes, caule e folhas). Um total de duas réplicas foi preparado por órgão, por planta. Material de planta (aproximadamente 100 mg) foi esterilizado na superfície embebendo em etanol 70% por 30 segundos, seguido por NaOCl 4,2% (alvejante) por 2 minutos e então enxaguado três a cinco vezes em água MilliQ estéril para assegurar que o esterilizante tivesse sido completamente removido. As amostras foram secas por congelamento por 48 horas a -58° C e 0,014 mBar. DNA foi extraído usando o Qiagen DNeasy plant mini kit de acordo com as instruções do fabricante. Bactérias e fungos endofíticos foram avaliados nas análises metagenômicas usando os iniciadores de PCR universais 515f e 806r para traçado de perfil do microbioma bacteriano (região V4 do gene de rDNA 16S, aprox. 350 pares de base) e 58A2F e ITS4 para o microbioma fúngico (região ITS2 dos genes rDNA, aprox. 400 pares de base), com adaptadores Illumina. Pares e bibliotecas foram preparados e carregados de acordo com o guia de usuário Illumina correspondente. Dados de sequência metagenômicos foram ordenados por qualidade e postos em pares usando PANDSEQ para criar unidades taxonômicas operacionais (OTU), que foram alinhadas contra o banco de dados GreenGenes e o banco de dados fúngico UNITE para atribuir taxonomia (OTU: identidade de sequência de 97%, valor de e < 10e-110). O número de sequências associadas com OTUs foi calculado em todas as amostras e normalizado como uma porcentagem.
Diversidade Microbiana Total nas Brachiaria-Urochloa
[0131] Um total de 361 unidades taxonômicas operacionais (OTUs) bacterianas foi identificado em todas as espécies de Brachiaria-Urochloa, compreendendo 25 Filos bacterianos, 56 Classes, 121 Famílias e 170 Gêneros (incluindo grupos taxonômicos candidatos) (Tabela 1). As análises identificaram microbioma de núcleo (OTUs encontradas em todas as espécies Brachiaria-Urochloa) e o microbioma único (OTUs associadas com espécies Brachiaria-Urochloa específicas), junto com OTUs bacterianas apenas associadas com espécies Brachiaria-Urochloa conhecidas produzir braquialactona (B. humidicola e B. ruziziensis) (Tabela 1). As análises também proveram validação cruzada da presença de endófitos isolados dessas espécies Brachiaria-Urochloa.
[0132] Ainda, 84 OTUs fúngicas foram identificadas, compreendendo 5 Filos, 14 Classes, 32 Famílias e 44 Gêneros (Tabela 2). As análises identificaram o microbioma de núcleo (OTUs encontradas em todas as espécies Brachiaria-Urochloa) e o microbioma único (OTUs associadas com espécies Brachiaria-Urochloa específicas), junto com OTUs fúngicas apenas associadas com espécies Brachiaria-Urochloa conhecidas produzir braquialactona (B. humidicola e B. ruziziensis) (Tabela 2). As análises também proveram validação cruzada da presença de endófitos isolados dessas espécies Brachiaria-Urochloa.Tabela 1: OTUs bacterianas endofíticas encontradas dentro de folhas, raiz e caule de cinco espécies Brachiaria-Urochloa (361 OTUs), incluindo identificação do microbioma de núcleo, do microbioma único e OTUs bacterianas apenas associadas com espécies Brachiaria-Urochloa conhecidas produzir braquialactona (Braq - B. humidicola e B. ruziziensis). Exemplos da diversidade microbiana bacteriana em espécies Brachiaria-Urochloa são representados dentro de B. humidicola (Bh) e B. decumbens (Bd). Tabela 2: OTUs fúngicas endofíticas encontradas dentro das folhas, raiz e caule de cinco espécies Brachiaria-Urochloa (84 OTUs), incluindo identificação do microbioma de núcleo, do microbioma único e OTUs fúngicas apenas associadas com espécies Brachiaria-Urochloa conhecidas produzir braquialactona (Braq - B. humidicola e B. ruzi- ziensis). Exemplos da diversidade microbiana bacteriana em espécies Brachiaria-Urochloa são representados dentro de B. humidicola (Bh) e B. decumbens (Bd).
Diversidade microbiana entre órgãos de planta e Brachiaria-Urochloa
[0133] A diversidade microbiana foi maior nas raízes de espécies Brachiaria-Urochloa representando 359 espécies bacterianas (99,4%) e 83 espécies fúngicas (98,8%) (Tabelas 1 e 2). A diversidade microbiana no caule e na folha foi significantemente menor do que nas raízes, sendo responsável por 5-20 OTUs bacterianas ou fúngicas.
Diversidade microbiana em espécies Brachiaria-Urochloa
[0134] O microbioma do núcleo consistia em 130 OTUs bacterianas e 14 OTUs fúngicas (Tabelas 1, 2 e 3). O microbioma bacteriano de núcleo continha uma disposição diversa de táxons, enquanto o microbioma fúngico de núcleo continha predominantemente espécies Sordariomycetes (8). As OTUs associadas com o microbioma de núcleo foram também as OTUs mais abundantes em todas as espécies Brachiaria-Urochloa. O número de OTUs únicas para espécies Brachiaria-Urochloa variou de 5 a 27 para bactérias e 2 a 12 para fungos, e foram predominantemente encontradas em baixa abundância em suas respectivas espécies.Tabela 3: o microbioma de núcleo e único associado com espécies Brachiaria-Urochloa
Espécies microbianas associadas com B. humidicola e B. decumbens
[0135] O número de OTUs bacterianas e fúngicas associadas com B.humidicola foi 189 e 48, respectivamente. B. humidicola tinha a diversidade fúngica mais alta, aproximadamente 15% maior do que qualquer outra espécie Brachiaria-Urochloa. Por outro lado, B. humidicola tinha a segunda mais baixa diversidade bacteriana, aproximadamente 31% menor do que B. decumbens (diversidade bacteriana mais alta). Como com todas as outras espécies Brachiaria-Urochloa a diversidade microbiana mais alta foi observada nas raízes, enquanto houve diversidade microbiana muito baixa nos caules e folhas.
[0136] O número de OTUs bacterianas e fúngicas associadas com B. decumbens foi 276 e 37, respectivamente. B. decumbens tinha a diversidade bacteriana mais alta, aproximadamente 3 a 33% maior do que qualquer outra espécie Brachiaria-Urochloa. Por outro lado, B. decumbens tinha a segunda diversidade fúngica mais baixa, aproximadamente 23% menor do que B. humidicola. Como com todas as outras espécies Brachiaria-Urochloa, a maior diversidade microbiana foi observada nas raízes, enquanto houve diversidade microbiana muito baixa nos caules e folhas.
[0137] As cinco melhores OTUs fúngicas e bacterianas associadas com ambas B. humidicola e B. decumbens mostram homologia de sequência com isolatos de NCBI que foram predominantemente identificados como endófitos, incluindo endófitos de outra espécie Poaceae (por exemplo, Oryzae sativa, Triticum aestivum), mycorrhizae (por exemplo, espécie Glomus) ou rhizobacteria (espécie Rhizobiales). O patógeno fúngico Fusarium proliferatum estava também presente, o qual é um patógeno de origem na semente de uma gama de espécies de cultura agrícola (Tabelas 4 e 5).Tabela 4: exemplos das OTUs fúngicas mais abundantes associadas com espécies Brachiaria-Urochloa e seu melhor Blastn NCBI correspondente (número de acesso, valor de E, fonte de isolamento e origem endofítica - E+/-) Tabela 5. Exemplos das OTUs bacterianas mais abundantes associadas com espécies Brachiaria e seu melhor Blastn NCBI correspondente (número de acesso, valor de e, fonte de isolamento e origem endofítica - E+/-)
Diversidade microbiana associada com espécies Brachiaria-Urochloa produzindo braquialactona
[0138] Um total de 45 OTUs bacterianas e 29 fúngicas foi identificado apenas nas espécies Brachiaria-Urochloa verificadas produzir braquialactona, B. humidicola e/ou B. ruziziensis (Tabelas 1 e 2). As OTUs associadas com espécies produzindo braquialactona representam uma gama de táxons bacterianos e fúngicos diversos.
Exemplo 2 - Análise de metagenoma do microbioma de brachiaria determina a gama de hospedeiro de endófitos fúngicos de gramíneas Brachiaria-Urochloa
[0139] Um total de 97 de isolatos de endófito fúngico derivados de 11 espécies Brachiaria-Urochloa foi identificado em um estudo global de 281 acessos de 23 países. A sequência de espaçador transcrito interno ITS foi usada para caracterização adicional. A região inteira de DNA ribossomal nuclear que compreende ambos os espaçadores transcritos internos ITS1 e ITS2 e a subunidade 5.8S foi amplificada por PCR usando iniciadores ITS5 e ITS4 (White e outros, 1990). Produtos de amplificação de PCR purificados foram sequenciados usando tecnologia de sequenciamento Sanger. Endófitos subcultivados isolados foram então agrupados com base em sua identidade de sequência de ITS. Análise de sequência de DNA ribossomal (rDNA) com base no espaçador transcrito interno (ITS) e regiões de codificação de 18S mostra que isolatos de endófito de brachiaria são geneticamente diversos, representando pelo menos 10 grupos taxonômicos distintos (Figura 1). Espécies B. humidicola e B. ruziziensis, mostradas produzir braquialactona, exibem níveis altos de diversidade e riqueza de endófito fúngico (Figura 1).
[0140] Os dados de sequência foram usados em análise BLASTN para identificar correspondências no banco de dados NCBI. Endófitos de brachiaria encontrados são geneticamente novos. Comparação de cada sequência de ITS de isolatos com aquelas em bancos de dados publicamente disponíveis não identificou quaisquer linhagens fúngicas com >90% de identidade. Análise filogenética confirmou que isolatos de agrupamentos de ITS diferentes pertenciam a gêneros diversos. Em vários acessos, endófitos múltiplos isolados de uma planta única pertenciam a agrupamentos específicos de rDNA diferentes, sugerindo co-existência de múltiplas espécies de endófito fúngico na mesma planta (Tabela 6).Tabela 6: sumário de endófitos fúngicos isolados de 11 espécies de Brachiaria-Urochloa
[0141] A sequência de região rDNA-ITS para linhagens de endófito fúngico isoladas e culturáveis foi usada para identificar sua presença/ ausência nos microbiomas de 5 espécies Brachiaria-Urochloa (Bb - B. brizantha; Bh - B. humidicola; Bd - B. decumbens, Um - U. mosam- bicensis; Ur - U. ruziziensis (Figuras 2-2A). Um total de 27 isolatos tinha homologia de sequência (>10e-145) com OTUs na análise metage- nômica, validando mais seu nicho ecológico endofítico. Os isolatos tinham homologia de sequência com Acremonium sp., Sarocladium strictum, Hypocrea sp., Microsphaeropsis arundinis, uma fungal sp não cultivada e Pseudogymnoascus sp. O padrão observado para a presença de ITS em todas as espécies hospedeiras segue similaridade de Grupo de ITS no interior. Por exemplo, ITS5 (por exemplo, 2.15.A.2) e ITS1 formam grupos ITS simples (nenhum subagrupamento de grupo no interior) e parece estar presente ubiquamente em Brachiaria-Urochloa. Em contraste, ITS7 mostra padrões de presença/ausência no hospedeiro que estão relacionados com os três subagrupamentos de ITS7 identificados [representados por isolatos de endófito 2,3.C.1 (agrupamento 1), 2.10.C.2 (agrupamento 2), 2.12.B.1 e 2.11.B.1 (agrupamento 3)]. O grupo ITS6 é geneticamente diverso, com três agrupamentos distintos. Isolato de endófito 2.2.A.1 foi detectado em apenas 1 de 5 espécies hospedeiras testadas, enquanto 2.10.D.1 mostra uma gama de hospedeiro ampla. Os endófitos do Grupo ITS2 exibiram dois perfis de hospedeiro diferentes. Os endófitos 12.1.B e 9.2.B mostram uma gama de hospedeiro ampla, estando presentes em cada uma das 5 espécies de hospedeiro testadas. Em contraste, 1.1.A mostra uma gama de hospedeiro estreita, como foi detectado em apenas 1 de 5 espécies hospedeiras testadas. Variação em sua colonização entre subgrupos putativos do mesmo grupo taxonômico pode ser um indicador de co- evolução e especialização de hospedeiro-endófito.
Exemplo 3 - Braquialactona é microbiana em origem
[0142] Plantas maduras de associações de gramínea-endófito Brachiaria-Urochloa que tinham sido mantidas em um ambiente controlado foram submetidas à análise de traçado de perfil metabólico. Quatro plantas individuais (réplicas biológicas) de cada uma das três espécies de Brachiaria-Urochloa (B. humidicola, U. mosambicensis, B. ruziziensis) foram analisadas quanto à presença de braquialactona usando espectrometria de cromatografia líquida-massa (LC-MS). Amostras de pseudocaule secas por congelamento foram preparadas para análise de LC-MS usando um procedimento de extração com metanol 80%. O composto braquialactona foi identificado nos tecidos da raiz de associações de brachiaria-endófito (B. humidicola, B. ruziziensis) (Figuras 3 a 5; Tabela 7). A presença de braquialactona foi confirmada através de MS (íons extraídos na razão de massa para carga [m/z] de 333,2059 em RT 8,93 minutos). Braquialactona não foi detectada em associações de B. decumbens-endófito ou associações de U. mosambi- ciensis-endófito (Tabela 7). Tabela 7. Detecção de braquialactona em Brachiaria-Urochloa. Amostras de associações de B. humidicola-endófito e B. ruziziensis-endófito mostram presença de braquialactona
Exemplo 4 - Um método otimizado para inoculação de endófitos de brachiaria em Brachiaria-Urochloa
[0143] Um painel de hospedeiro compreendendo germoplasma de Brachiaria-Urochloa comercialmente relevante foi estabelecido para permitir inoculação de isolatos de endófito geneticamente novos e altamente diversos em um genótipo de hospedeiro único. Um método otimizado para inoculação de endófito em plantas hospedeiras livres de organismos microbianos em condições axênicas foi desenvolvido, facilitando uma frequência alta de inoculação bem sucedida (Tabela 8). Quatro endófitos fúngicos representando quatro das clades definidas por sequência de rDNA foram identificados como candidatos para inoculação e caracterização no painel de hospedeiro de Brachiaria-Urochloa.
[0144] Sementes de brachiaria esterilizadas são germinadas sob condições assépticas para remover organismos microbianos das plantas hospedeiras a serem usadas para inoculação. Plântulas doadoras livres de micróbio são cultivadas em meios de multiplicação de broto (M3B) sob condições estéreis. Brotos doadores são separados em perfilhos únicos e transferidos para meios de multiplicação de broto (MS+NAA). Perfilhos únicos são cultivados por 2-3 semanas para promover crescimento da raiz, as plântulas são então novamente separadas em perfilhos únicos e a bainha externa é removida para revelar o início do broto. Os inícios do bruto com raízes intactas são transferidos para ágar de água para inoculação de micélios de endófito. Para inoculação de endófito, um corte pequeno é feito no meristema do broto e endófito é inoculado na ferida. Seguindo inoculação, as plântulas são retidas em meios MS % por 2 semanas. Elas são então transferidas para solo e cultivadas sob condições de estufa por 8 semanas antes do teste quanto à presença de endófito usando um conjunto de diagnóstico de marcadores SSR específicos de linhagem (Figura 6).
[0145] Frequência de inoculação de endófito foi determinada para cada endófito candidato, aproximadamente 6 meses após inoculação, usando um conjunto de diagnóstico (isto é, tamanhos de alelo específicos em cada loci de SSR para cada endófito) de marcadores de repetição de sequência simples (SSR) para cada isolato de endófito.
[0146] Inoculação bem sucedida foi obtida para endófitos representativos de cada uma das clades definidas por sequência de DNA ribossomal (Tabela 8). Variação entre isolatos de endófito representando grupos de ITS diferentes foi observada. ITS5 (2.15.A.2) > ITS7 (2.10.C.2) > ITS2 (12.1.B) > ITS1 (5.1.B). Compatibilidade entre espécies cruzadas também foi observada. Isolatos de endófito 2.15.A.2 (58 a 83%) e 2.10.C.2 (38% a 83%) exibiram compatibilidade entre espécies ampla comparado com 12.1.B moderadamente compatível (8 a 76%) e compatibilidade de hospedeiro estreita de 5.1.B (0 a 7%). Como seria esperado, cada linhagem de endófito mostra frequência de inoculação mais alta para as espécies das quais ela foi originalmente isolada.Tabela 8: sumário de frequências de inoculação (%). Dados apresentados aqui são para associações de endófito Brachiaria-Urochloa estáveis identificadas 3 a 6 meses após inoculação. Um conjunto de diagnóstico de marcadores SSR específicos para endófitos de Brachiaria-Urochloa é usado para testar a presença e identidade de endófitos in planta. É mostrada aqui a porcentagem de plantas positivas para endófito identificadas a partir do número total de plantas coletadas. Médias de planta hospedeira e endófito são mostradas nas colunas destacadas em cinza. As espécies Brachiaria-Urochloa das quais o endófito foi isolado são destacadas em cinza claro.
[0147] Variação em habilidade de inoculação do hospedeiro foi também observada. U. mosambicensis forma associações estáveis com uma ampla gama de endófitos fúngicos em uma frequência muito alta de inoculação bem sucedida (60%). Também importante é que U. mosambicensis forma associações com endófitos fúngicos altamente diversos, múltiplos (Figura 1; Tabela 6). Linhagens de endófito representando 6 dos 7 grupos de ITS identificados em brachiaria foram isoladas dessas espécies (Figura 1). B. humidicola forma associações estáveis com uma gama ampla de endófitos fúngicos em uma frequência alta de inoculação bem sucedida (41%). Como para U. mosambicensis, esta espécie carrega naturalmente uma diversidade de endófitos múltiplos, com 4 e 7 grupos ITS identificados (Figura 1).
Exemplo 5 - Análise metagenômica do micróbio de semente de Brachiaria-Urochloa
[0148] Um desafio significante em estudos de micróbio de planta é que a fim de analisar o componente endofítico de um microbioma de planta, é necessário extrair DNA de tecidos de planta. A presença de uma alta proporção de DNA de planta:DNA de micróbio (na ordem de 20:1 para bactérias e 1:1 para fungos) em DNA extraído afeta análise de sequência a jusante. Em estudos anteriores, uma maneira de lidar com isso é gerar números grandes de leituras de sequência para obter um número alvo de leituras de microbioma.
[0149] Neste exemplo, foi desenvolvido um método para enriquecer o microbioma (ambos DNA bacteriano e fúngico) quando extraindo DNA de semente de planta. O método não é limitado em aplicação à semente de planta e pode ser aplicado a qualquer tecido de planta de qualquer espécie de interesse, incluindo material de planta de folha, tronco e/ou raiz.
[0150] Micróbios endofíticos associados à semente são de interesse uma vez que eles podem ser explorados em um cenário de reprodução molecular com o que o micróbio e planta hospedeira são co-selecionados para uma característica de interesse particular. Ainda, a presença de micróbios endofíticos em ambos microbiomas de raiz e semente é de interesse particular uma vez que micróbios associados à semente que são distribuídos pela planta podem ser associados com característica de desempenho aperfeiçoadas, tal como resistência à peste e doença ou inibição de nitrificação biológica (BNI) através da produção de braquialactona.
[0151] Variação em colonização de semente hospedeira pode ser um indicador de co-evolução e especialização de hospedeiro-endófito.
[0152] Uma vez isolados e purificados, componentes individuais do microbioma de semente endofítica podem ser sequenciados no genoma e caracterizados para desenvolvimento de marcador molecular, identificação taxonômica e análises filogenômicas. Organismos componentes de microbioma selecionados podem ser também fenotipicamente avaliados sozinhos e em combinação para identificar micróbios que conferem características de produção aperfeiçoadas, por exemplo, BNI, para uma gama de espécies brachiaria comercialmente significantes. Há um potencial em explorar mais as propriedades biológicas do microbioma de brachiaria em uma gama ampla de espécies de cultura para o benefício de agricultura sustentável e do ambiente.
Exemplo 6 - Metodologia para enriquecimento de DNA bacteriano e fúngico em análise de microbioma de semente
[0153] Foi desenvolvido um método para enriquecimento do componente de microbioma (DNA bacteriano e fúngico) em semente de brachiaria (Figura 7). Embora usado para semente de planta neste exemplo, o método pode ser também aplicado a qualquer tecido de planta de qualquer espécie de interesse. Dependendo do tecido da planta, o versado na técnica compreenderia que mudanças pequenas podem ser feitas no método para otimizar o enriquecimento do micro- bioma, por exemplo, a quantidade de moagem do material de planta pode ser variada, por exemplo, de finamente moído a moído grosseiramente, dependendo da natureza do material de planta.
[0154] Cinquenta gramas de semente de cada um dos dez acessos selecionados (Tabela 9) foram esterilizados na superfície (NaHCl 5% [p/v] e Tween 20) por 30 min com agitação. Amostras de semente foram então enxaguadas oito a dez vezes em água MilliQ estéril para assegurar que o esterilizante tivesse sido completamente removido. As sementes foram secas em papel filtro estéril sob condições assépticas de um dia para o outro. As sementes secas foram parcialmente moídas usando um genogrinder (SPEX SamplePrep 2010 Geno/GrinderR, Metuchen, USA). Sementes noídas foram então lavadas duas vezes por 12 horas com etanol absoluto e agitação contínua. Seguindo as lavagens, as amostras foram deixadas sedimentar e o sobrenadante comtendo o microbioma endofítico associado à semente coletado. O sobrenadante foi então completamente evaporado sob condições estéreis. DNA foi extraído do produto bruto final (que ficou seguindo evaporação de etanol) usando o Qiagen DNeasy plant mini kit de acordo com as instruções do fabricante.
[0155] Simultaneamente, DNA foi também extraído das sementes esterilizadas na superfície (10 sementes de cada acesso) usando o Qiagen DNeasy plant mini kit de acordo com as instruções do fabricante. Bactérias e fungos foram avaliados nas análises metagenômicas usando os iniciadores de PCR universais 515f (Wang & Qian, 2009) e 806r (McBain e outros, 2003) para traçado de perfil do microbioma bacteriano (região V4 do gene de rDNA 16S, aprox. 350 pares de base) e 58A2F (Martin & Rygiewicz, 2005) e ITS4 (White e outros, 1990) para o microbioma fúngico (região ITS2 dos genes de rDNA, aprox.. 400 pares de base), com adaptadores Illumina associados. Amplicons de gene de RNA ribossomal foram preparados e sequenciados no MiSeq (Illumina) de acordo com o guia de usuário correspondente.Tabela 9: espécies Brachiaria usadas neste exemplo*Composto BNI: compostos de inibição de nitrificação biológica, por exemplo, braquialactona
Exemplo 7 - Análise metagenômica para identificar o microbioma endofítico associado à semente de gramíneas Brachiaria
[0156] Os microbiomas de semente endofíticos (bacterianos e fúngicos) de quatro espécies Brachiaria-Urochloa tiveram o perfil traçado usando metagenômica com o objetivo de identificar micróbios associados com uma espécie e/ou característica particular, tal como resistência à peste e doença, ou inibição de nitrificação biológica (BNI) através da produção de braquialactona.
[0157] Espécies Brachiaria examinadas incluíam as espécies - B. humidicola, B. ruziziensis, B. decumbens - anteriormente documentadas para produzir compostos de inibição de nitrificação biológica (BNI) e B. brizantha que não produz compostos BNI (Tabela 9).
[0158] Os dados são então analisados para identificar o microbioma endofítico associado à semente de brachiaria: • associado com a produção de braquialactona o especificamente com a característica de BNI em B. humidicola o em geral com a característica de BNI (isto é, comum à B. humidicola, B. ruziziensis e B. decumbens) • único para B. humidicola, B. ruziziensis, B. decumbens ou B. brizantha • em comum com todas as espécies Brachiaria estudadas
[0159] Deve ser compreendido que várias alterações, modificações e/ou adições podem ser feitas sem se afastar do espírito da presente invenção como mostrado aqui.
[0160] Como aqui usado, exceto onde o contexto exigir de outro modo, o termo "compreendem" e variações do termo tais como "compreendendo", "compreende" e "compreendido" não pretendem ser de modo algum limitantes ou excluir aditivos, componentes, inteiros ou etapas adicionais.
[0161] Referência a qualquer técnica anterior no relatório não é, e não deve ser considerada, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão que esta técnica anterior faça parte do conhecimento geral comum na Austrália e qualquer outra jurisdição ou que esta técnica anterior pudesse ser razoavelmente esperada ser determinada, compreendida e/ou considerada como relevante por um versado na técnica. Referências 1. de Boer, A. H., & de Vries-van Leeuwen, I. J. "Fusicoccanes: diterpenes with surprising biological functions", Trends in Plant Science, 2012, 17(6), 360-368. 2. Subbarao, D. V. e outros, "A bioluminescence assay to detect nitrification inhibitors released from plant roots: a case study with Brachiaria humidicola", Plant Soil, 2006, 288, 101-112. 3. Subbarao, G. V. e outros, "Evidence for biological nitrification inhibition in Brachiaria pastures", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(41), 17302-17307. 4. White, T. J. e outros, "Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics", In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, pp. 315-322, Academic Press. 5. Martin KJ, Rygiewicz PT (2005) Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiology 5: 28. 6. McBain AJ, Bartolo RG, Catrenich CE, Charbonneau D, Ledder RG, Rickard AH, Symmons SA, Gilbert P (2003) Microbial characterization of biofilms in domestic drains and the establishment of stable biofilm microcosms. Applied and Environmental Microbiology 69: 177-185. 7. Wang Y, Qian P-Y (2009) Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PloS one 4: e7401

Claims (10)

1. Método para isolamento, seleção e/ou caracterização de uma linhagem endofítica, caracterizado pelo fato de que inclui: prover amostras de material de planta de espécies de planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa; submeter as ditas amostras à análise metagenômica; identificar unidades taxonômicas operacionais bacterianas e/ou fúngicas (OTUs) em cada espécie de planta Brachiaria-Urochloa; comparar as presentes OTUs em cada espécie de amostra para identificar um microbioma núcleo, suplementar e/ou único; e selecionar linhagens endofíticas representando um microbioma núcleo, suplementar ou único desejado.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a espécie de planta do complexo de espécie Brachiaria- Urochloa é selecionada do grupo consistindo em: Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria stolonifera, Brachiaria ruziziensis, Urochloa brizantha, Urochloa decumbens, Urochloa humidicola, Urochloa mosambicensis, Brachiaria marlothii, Brachiaria nigropedata, Urochloa dictyoneura, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Brachiaria obtusiflora, Brachiaria serrifolia, Urochloa advena, Urochloa arrecta, Urochloa brachyura, Urochloa eminii, Urochloa mollis, Urochloa xantholeuca, Urochloa oligotricha, Urochloa panicoides, Urochloa plantaginea, Urochloa platynota,Urochloa xantholeuca, Brachiaria holosericea, Brachiaria reptans, Brachiaria milliformis, Brachiaria distachya e híbridos interespecíficos e intraespecíficos do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa, preferivelmente Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, Brachiaria humidicola, Brachiaria ruziziensis e Urochloa mosambicensis.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as amostras de material de planta são selecionadas de um ou mais do grupo consistindo em folha, caule, raiz e material de semente, preferivelmente material de semente.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de provisão de amostras de material de planta de espécies de planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa inclui as etapas de:triturar o material de planta;lavar o material de planta triturado com álcool; e extrair ácido nucleico da lavagem com álcool.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os dados de sequência gerados pela análise metagenômica são produzidos usando iniciadores de reação em cadeia da polimerase (PCR) universal direcionados a uma ou ambas a região V4 do gene de rDNA 16S e a região ITS2 de genes de rDNA.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as linhagens endofíticas selecionadas representando um microbioma de núcleo, suplementar ou único desejado são aquelas que proveem propriedades benéficas na planta com a qual o endófito está associado, e em que as propriedades benéficas na planta com a qual o endófito está associado é a produção de um composto fusicocano.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o composto fusicocano é braquialactona.
8. Método de produção de um fusicocano, caracterizado pelo fato de que compreende:isolar um endófito de uma planta do complexo de espécies Brachiaria-Urochloa;cultivar o dito endófito em um meio de cultura adequado; e recuperar um ou mais compostos orgânicos incluindo o fusicocano a partir de células endofíticas, a partir do meio de cultura ou a partir de espaço de ar associado com o meio de cultura ou endófito.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o endófito é um endófito purificado ou isolado selecionado do grupo consistindo em Hypocrea sp./Acremonium sp. 2.15.A.2, Acremonium sp. 2.3.C.1, Microsphaeropsis arundis 2.10.D.1, Sarocladium sp./Acremonium sp. 2.12.B.1, Sarocladium sp./Acremonium sp. 2.10.C.2 e Sarocladium sp./Acremonium sp. 2.11.B.1, conforme depositado no National Measurement Institute com números de acesso V15/028237, V15/028238, V15/028239, V15/028240, V15/028241 e V15/028242, respectivamente, em que o endófito purificado ou isolado é pelo menos 98% livre de outros organismos.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o fusicocano é braquialactona.
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