JP2018535653A - ブラキナリア属内生菌及び関連する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、内生菌、特にブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物と一体化している内生菌、内生菌に感染した植物、内生菌によって生産された生成物、及び関連する方法に関する。

Description

本発明は、内生菌、内生菌に感染した植物、内生菌によって生産された生成物、及び関連する方法に関する。
微生物は、広範な産業分野で利用される可能性を有する新規な遺伝子及び化合物の貴重な源である。科学文献は、環境汚染除去における、並びに食品及び化粧品の生産におけるその使用に加えて、微生物が抗生物質、免疫抑制剤、抗癌剤、及びコレステロール降下薬の主要な源であると多く記載している。
生存植物の組織内に存在する、内生菌として知られている比較的調査が浅い微生物群は、社会、特に農業に対して重要な利益をもたらし得る新規な化合物及び遺伝子の特に多様な源となる。
内生菌はその宿主と相利共生関係を形成することが多く、その際、内生菌は、多くは防御化合物の生産を介して、宿主の適応度を増大させる。同時に、宿主植物は、保護された環境及び栄養という利益を内生菌に提供する。
生存植物の組織内に存在し得る細菌等の他の微生物もまた、この点について比較的調査されていない。植物に寄生する細菌は類似の利益をもたらす。
ブラキアリア属(Brachiaria)-ウロクロア属(Urochloa)種複合体は、牧草の科であるイネ科(Poaceae)の構成要素であり、代表的には熱帯地方全域、特にアフリカに分布している。内部転写スペーサー(ITS)核リボソームDNA配列のデータに基づく遺伝的多様性分析は、ウロクロア属とブラキアリア属との間の強力な親和性を示し、これは、これらの牧草属間の連続的漸次変化を示す形態学的及び解剖学的研究を裏付ける。一部のブラキアリア属-ウロクロア属種は、市販の品種として販売されている経済的に重要な熱帯飼料用牧草であり、これには、ブラキアリア・ブリザンタ(B.brizantha)、ブラキアリア・デクンベンス(B.decumbens)、ブラキアリア・ウミディコラ(B.humidicola)、及びルジグラス(B.ruziziensis)、並びに対応する種間及び種内ハイブリッドが含まれる。
ブラキアリア属-ウロクロア属植物の改良プログラムにおいて新規な内生菌及びその分布を同定及び特徴付けするための方法は、WO2012/174585で論じられており、その開示は、ここでその全体が本明細書に組み込まれる。内生真菌株が、ブラキアリア属-ウロクロア属種から単離された。これらのブラキアリア属真菌内生菌は遺伝的に多様であった。これらの内生菌の一部は広範囲の抗真菌活性を示し、斑点病の原因となるドレクスレラ属(Drechslera)種等の真菌病原体からブラキアリア属-ウロクロア属を保護する役割を有し得る。
ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の真菌内生菌についての、並びにブラキアリア属-ウロクロア属植物の改良プログラムにおいて新規な内生菌及びその分布を同定及び特徴付けするための方法についての情報及び知識は、依然として全体的に欠如している。
ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の細菌内生菌についての、並びにブラキアリア属-ウロクロア属の植物改良プログラムにおいて新規な細菌生物及びその分布を同定及び特徴付けするための方法についての情報及び知識もまた、全体的に欠如している。
更に、南米、アジア、及びオーストラリアの熱帯地方での牧草ベースの農業に広く使用されてはいるが、ブラキアリア属-ウロクロア属は、その使用及び遺伝的増強の両方を制約する多くの欠点を示す。
ブラキアリア属-ウロクロア属を含む飼料牧草はまた、窒素汚染における影響について、ここ数年認識されてきている。農業における近代的生産の主な懸案事項は、高レベルの窒素(N)汚染及び低効率のN利用である。脱窒によるNの損失により、環境汚染、並びに土壌N及び施用N(肥料として)の両方の非効率的な使用が生じている。
硝化は、土壌微生物集団の遍在的構成要素である2つの群の化学無機栄養細菌(ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種及びニトロバクター属(Nitrobacter)種)によって主に行われる。例えば、ニトロソモナス属種等の硝化土壌細菌は、アンモニウム(NH4 +)を硝酸塩(NO3 -)に変換する。硝酸塩はまた、亜酸化窒素(N2O)ガスに変換され得る。硝化の阻害は、土壌内のNをより長く維持し得、窒素利用効率(NUE)を向上させ得る。
ニトロソモナス・ユーロピア(Nitrosomonas europaea)の組換え株を使用する生物発光アッセイが、植物の根から放出される硝化阻害剤を検出するために開発されており、異なる作物及び牧草の生物学的硝化阻害(BNI)能力を判定及び比較することを可能にしている(Subbaraoら、2006)。
土壌硝化を抑制する阻害化合物を放出する植物の概念は、これまでに示唆されている。数名の研究者によって、ある特定の熱帯牧草地の土壌及び森林の土壌で硝化の速度が遅いことが観察されている。BNIは、ある特定の植物種が土壌硝化細菌に対する標的化された抑制効果を有する有機化合物をその根から放出する能力である(Subbaraoら、2006、2009)。
ブラキアラクトンは、ブラキアリア・ウミディコラの根から放出される主要な硝化阻害剤である(Subbaraoら、2009)。ブラキアラクトンは、フシコッカンと呼ばれるジテルペンの一群に属する。フシコッカンは、多種多様な植物、真菌、及び細菌から同定及び単離されている。ラキアラクトンは、ニトロソモナス属種に対する殺生物活性を示すことが示されている(Subbaraoら、2009)。Nはこうして植物に利用可能となり、牧草の性能が増大する。文献によって、この化合物が根環境のアンモニウムに応答して植物によって生産されることが示唆されている(Subbaraoら、2009)。
WO2012/174585
先行技術の困難性又は不備の1つ又は複数を克服する又は少なくとも軽減することが本発明の目的である。
一態様では、本発明は、内生菌株を単離、選択、及び/又は特徴付けするための方法であって、
ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物種から植物材料の試料を提供する工程、
前記試料をメタゲノム分析にかける工程、
各ブラキアリア属-ウロクロア属植物種における細菌及び/又は真菌の操作的分類単位(OTU)を同定する工程、
各試料種内に存在するOTUを比較して、核となる、補助的な、及び/又は固有のマイクロバイオームを同定する工程、及び
望ましい核となる、補助的な、又は固有のマイクロバイオームに相当する内生菌株を選択する工程
を含む、方法を提供する。
内生菌株は、植物、好ましくはブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物と密接に一体化している細菌又は真菌株を意味する。この文脈における「一体となった」は、細菌又は真菌が植物上、植物内、又は植物に近接して生存していることを意味する。例えば、この細菌又は真菌は、内生、例えば植物の内部組織内で生存するものであり得るか、又は着生、例えば植物上で外部的に成長するものであり得る。
試料を調製するために使用される植物材料は、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物から得られる。より具体的には、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物は、ブラキアリア・ブリザンタ(Brachiaria brizantha)、ブラキアリア・デクンベンス(Brachiaria decumbens)、ブラキアリア・ウミディコラ(Brachiaria humidicola)、ブラキアリア・ストロニフェラ(Brachiaria stolonifera)、ルジグラス(Brachiaria ruziziensis)、ウロクロア・ブリザンタ(Urochloa brizantha)、ウロクロア・デクンベンス(Urochloa decumbens)、ウロクロア・ウミディコラ(Urochloa humidicola)、ウロクロア・モサンビセンシス(Urochloa mosambicensis)、ブラキアリア・マルロシー(Brachiaria marlothii)、ブラキアリア・ニグロペダタ(Brachiaria nigropedata)、ウロクロア・ディクチオネウラ(Urochloa dictyoneura)、ウロクロア・オリゴトリカ(Urochloa oligotricha)、ウロクロア・パニコイデス(Urochloa panicoides)、ブラキアリア・オブツシフローラ(Brachiaria obtusiflora)、ブラキアリア・セリフォリア(Brachiaria serrifolia)、ウロクロア・アドベナ(Urochloa advena)、ウロクロア・アレクタ(Urochloa arrecta)、ウロクロア・ブラキュウラ(Urochloa brachyura)、ウロクロア・エミニー(Urochloa eminii)、ウロクロア・モリス(Urochloa mollis)、ウロクロア・キサントレウカ(Urochloa xantholeuca)、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ウロクロア・プランタギネア(Urochloa Plantaginea)、ウロクロア・プラチノタ(Urochloa platynota)、ウロクロア・キサントレウカ、ブラキアリア・ホロセリセア(Brachiaria holosericea)、ブラキアリア・レプタンス(Brachiaria reptans)、ブラキアリア・ミリフォルミス(Brachiaria milliformis)、及びブラキアリア・ディスタチア(Brachiaria distachya)、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される。
特に好ましい実施形態では、ブラキアリア属-ウロクロア属複合体の植物は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ルジグラス、及びウロクロア・モサンビセンシスからなる群から選択される。
好ましくは、植物材料の試料は、葉、茎、根、及び種子材料からなる群から選択される。更により好ましくは、葉、茎、及び根のタイプの試料が提供される。或いは、種子の試料が提供される。別の好ましい実施形態では、葉、茎、根、及び種子材料の試料が提供される。
本明細書において使用される「前記試料をメタゲノム分析にかけること」は、メタゲノム配列データを植物材料から得ることを意味する。より具体的には、植物試料から回収された遺伝物質を分析して、細菌及び/又は真菌の配列データを得る。
用語「遺伝物質の回収」は、植物材料の試料からDNAを含む遺伝物質を抽出することを含む。
植物試料から回収された遺伝物質は、植物材料の試料から遺伝物質を回収するプロセスの一部として、植物と緊密に一体化している内生株のDNA(細菌及び/又は真菌DNA等)を豊富化することができる。
したがって、好ましい実施形態では、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物種由来の植物材料の試料を提供する工程は、
植物材料を粉砕する工程、
粉砕された植物材料をアルコールで洗浄する工程、及び
核酸をアルコール洗浄液から抽出する工程
を含む。
本発明のこの態様では、好ましくは、植物材料は植物種子である。好ましくは、植物材料は粗く粉砕される。好ましくは、アルコールはエタノールであり、更に好ましくは100%エタノールである。好ましくは、粉砕された植物材料は複数回、例えば2回、アルコールで洗浄される。好ましくは、核酸はDNAである。
出願人は、驚くべきことに、植物の核酸、例えば植物種子の核酸の量を低減させること、及び/又は植物組織、例えば種子を粗く粉砕することによって内生株に由来する核酸を豊富化し、次いでこれをアルコール、好ましくはエタノール内で洗浄することが可能であることを見出した。出願人は理論に制限されることを望まないが、アルコールは、植物材料、特に種子の微生物構成要素を保存するべく作用すると考えられる。核酸、例えばDNAをアルコール、例えばエタノール洗浄液から抽出することによって、宿主植物の核酸の量が低減し、微生物の核酸が豊富化される。これによって、微生物構成要素を捕捉するために数多くの配列リードが生じること、又は宿主核酸と微生物核酸とを区別するために核酸、例えばDNAメチル化密度を使用すること等の1つ又は複数の先行技術方法の問題が克服されるか又は少なくとも軽減される。
好ましい実施形態では、細菌マイクロバイオーム及び/又は真菌マイクロバイオームをプロファイリングするためのユニバーサルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーを使用して、配列データを得ることができる。例えば、16S rDNA遺伝子、より具体的には16S rDNA遺伝子のV4領域に向けられたプライマーを、細菌マイクロバイオームのプロファイリングに使用することができる。例えば、rDNA遺伝子の内部転写スペーサー(ITS)領域、より具体的にはrDNA遺伝子のITS2領域に向けられたプライマーを、真菌マイクロバイオームのプロファイリングに使用することができる。
一実施形態では、細菌の配列データは、16S rDNA遺伝子のV4領域に向けられたユニバーサルプライマーを使用して得られ、真菌の配列データは、rDNA遺伝子のITS2領域に向けられたユニバーサルプライマーを使用して得られる。
メタゲノム配列データを組み合わせて、細菌及び/又は真菌の操作的分類単位(OTU)を得ることができる。好ましくは、メタゲノム配列データはクオリティートリミングされ得、次いでPANDAseq等の、配列のためのペアエンドアセンブラーを使用して対合されて、細菌及び/又は真菌のOTUが得られる。
OTUは、GreenGenes細菌データベース等の細菌データベース、及び/又はUNITE真菌データベース等の真菌データベースに対してアラインされて、分類を割り当てることができる。
OTUに関連する配列の数が、各試料につき計算することができる。
各試料種内に存在するOTUを比較することによって、核となる、補助的な、及び固有のマイクロバイオームが同定され得る。「マイクロバイオーム」は、細菌及び/又は真菌の集合的ゲノムを意味する。「核となるマイクロバイオーム」は、試験対象の全ての又はほぼ全てのブラキアリア属-ウロクロア属種にわたって見られるOTUを意味する。「補助的なマイクロバイオーム」は、試験対象のブラキアリア属-ウロクロア属種のサブセットにわたって見られるOTUを意味する。「固有のマイクロバイオーム」は、特異的なブラキアリア属-ウロクロア属種に関連するOTUを意味する。
望ましい核となる、補助的な、又は固有のマイクロバイオームを有する内生菌が次いで選択され得る。例えば、広範な宿主範囲を有する内生菌が、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物に形質を送達するための候補として選択され得る。例えば、狭い又は特異的な宿主範囲を有する内生菌は、目的の特異的形質のための候補として、例えば、内生菌が一体化している植物における水及び/若しくは栄養ストレスに対する向上した耐性、又は害虫及び/若しくは疾患に対する向上した耐性等の有利な特性を提供する化合物を生産するための候補として、選択され得る。好ましい実施形態では、有利な特性には、殺虫又は防虫活性が含まれる。更に好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、抗真菌活性が含まれる。特に好ましい実施形態では、化合物は、硝化阻害剤等の阻害化合物、例えば、ブラキアラクトン等のフシコッカンであり得る。
本発明の第2の態様では、本明細書において記載される、ボタンタケ属(Hypocrea)種/アクレモニウム属(Acremonium)種、アクレモニウム属種、ミクロスフェロプシス・アルンディニス(Microsphaeropsis arundis)、及びサロクラジウム属(Sarocladium)種/アクレモニウム属種からなる群から選択される、実質的に精製又は単離された内生菌が提供される。好ましくは、前記内生菌は、本明細書において先に記載した方法によって単離、選択、及び/又は特徴付けされる。
代表的な試料、すなわちボタンタケ属種/アクレモニウム属種2.15.A.2、アクレモニウム属種2.3.C.1、ミクロスフェロプシス・アルンディニス2.10.D.1、サロクラジウム属種/アクレモニウム属種2.12.B.1、サロクラジウム属種/アクレモニウム属種2.10.C.2、及びサロクラジウム属種/アクレモニウム属種2.11.B.1は、National Measurement Instituteに、2015年9月22日に、それぞれ受託番号V15/028236、V15/028237、V15/028238、V15/028239、V15/028240、V15/028241、及びV15/028242で寄託された。
「実質的に精製された」は、内生菌が他の生物を有さないことを意味する。この用語には、したがって、例えば、無菌培養物における内生菌が含まれる。好ましくは、内生菌は、少なくともおよそ90%の純度、更に好ましくは少なくともおよそ95%の純度、いっそう更に好ましくは少なくともおよそ98%の純度、いっそう更に好ましくは少なくともおよそ99%の純度である。好ましくは、内生菌は無菌培養内にある。
用語「単離された」は、内生菌がその一次環境(例えば、それが天然である場合には天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生存植物内に存在する天然の内生菌は単離されていないが、天然の系における共存材料の一部又は全てから分離された同一の内生菌は単離されている。
その天然の環境では、内生菌は植物内で相利共生的に生存し得る。或いは、内生菌は着生植物であり得、すなわち、植物に付着して又は植物上で成長し得る。内生菌は真菌内生菌又は細菌内生菌であり得る。
本発明の内生菌は、その天然の環境で、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物と一体化していてよい。より具体的には、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア・マルロシー、ブラキアリア・ニグロペダタ、ウロクロア・ディクチオネウラ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ブラキアリア・オブツシフローラ、ブラキアリア・セリフォリア、ウロクロア・アドベナ、ウロクロア・アレクタ、ウロクロア・ブラキュウラ、ウロクロア・エミニー、ウロクロア・モリス、ウロクロア・キサントレウカ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ウロクロア・プランタギネア、ウロクロア・プラチノタ、ウロクロア・キサントレウカ、ブラキアリア・ホロセリセア、ブラキアリア・レプタンス、ブラキアリア・ミリフォルミス、及びブラキアリア・ディスタチア、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される。
特に好ましい実施形態では、ブラキアリア属-ウロクロア属複合体の植物は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ルジグラス、及びウロクロア・モサンビセンシスからなる群から選択される。
この文脈での「と一体化している」は、内生菌が植物上、植物内、又は植物に近接して生存していることを意味する。例えば、内生菌は内生、例えば、植物の内部組織内で生存するものであり得るか、又は着生、例えば植物上で外部的に成長するものであり得る。
真菌は、成長のために有機炭素を使用する従属栄養生物、より具体的には岩屑を消費することによって栄養を得る腐生成物であり得る。
さらなる態様では、本発明は、本明細書において先に記載したような内生菌を接種された植物であって、前記内生菌に安定的に感染した無内生菌宿主植物を含む、植物を提供する。好ましくは、前記植物は、内生菌が天然に一体化していない植物である。
好ましい実施形態では、内生菌が一体化している植物は、害虫及び/又は疾患に対する耐性が、未接種の対照植物よりも向上している。好ましくは、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、殺虫又は防虫活性が含まれる。更に好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、抗真菌活性が含まれる。
好ましい実施形態では、内生菌又は内生菌が一体化している植物は、真菌が一体化している植物における、水及び/若しくは栄養ストレスに対する向上した耐性又は害虫及び/若しくは疾患に対する向上した耐性等の有利な特性を提供する、1つ又は複数の化合物を生産し得る。好ましい実施形態では、有利な特性には、殺虫又は防虫活性が含まれる。更に好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、抗真菌活性が含まれる。
特に好ましい実施形態では、内生菌又は内生菌が一体化している植物は、硝化阻害剤等の阻害化合物、例えば、ブラキアラクトン等のフシコッカンを生産し得る。
好ましい実施形態では、宿主植物は、本発明による2つ以上の内生菌株を接種され得る。
好ましくは、植物は、牧草種、好ましくは飼料、芝、若しくはバイオエネルギー牧草、又は穀物若しくは工芸作物牧草等の農作物である。
飼料、芝、又はバイオエネルギー牧草は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ブラキアリア・ディクチオネウラ(B. dictyoneura)、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドを含む、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体(パニックグラス)に属するもの、そして、ホソムギ(L. perenne)(ペレニアルライグラス)及びロリウム・アルンディナセウム(L. arundinaceum)(トールフェスク)、及びネズミムギ(L. multiflorum)(イタリアンライグラス)を含む、ドクムギ属(Lolium)及びウシノケグサ属(Festuca)に属するものであり得る。
穀物又は工芸作物牧草は、パンコムギ(T. aestivum)(小麦)を含むコムギ属(Triticum)に属するもの、オオムギ(H. vulgare)(大麦)を含むオオムギ属(Hordeum)に属するもの、トウモロコシ(Z. mays)(とうもろこし(maize又はcorn))を含むトウモロコシ属(Zea)に属するもの、イネ(O. sativa)(米)を含むイネ属(Oryza)に属するもの、サトウキビ(S. officinarum)(さとうきび)を含むサトウキビ属(Saccharum)に属するもの、モロコシ(S. bicolor)(もろこし)を含むモロコシ属(Sorghum)に属するもの、パニクム・ビルガツム(P. virgatum)(スイッチグラス)を含むキビ属(Panicum)に属するもの、並びに、ススキ属(Miscanthus)、スズメノヒエ属(Paspalum)、チカラシバ属(Pennisetum)、イチゴツナギ属(Poa)、スズメガヤ属(Eragrostis)、及びヌカボ属(Agrostis)に属するものであり得る。
好ましくは、植物は、接種、育種、交配、ハイブリダイゼーション、形質導入、トランスフェクション、形質転換、及び/又は遺伝子ターゲティング、並びにその組合せからなる群から選択される方法によって内生菌に感染されている。
内生菌に感染している植物は、公知の技術によって培養され得る。当業者であれば、培養対象の植物に応じて適切な培養条件を容易に決定することができる。
さらなる態様では、本発明は、本発明の、本発明の内生菌に安定的に感染している植物、植物種子、又は植物に由来する他の植物部分を提供する。好ましくは、内生菌が一体化している植物、植物種子、又は他の植物部分は、未接種の対照植物、植物種子、又は他の植物部分よりも、害虫及び/又は疾患に対する耐性が向上している。好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、殺虫又は防虫活性が含まれる。更に好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、抗真菌活性が含まれる。
特に好ましい実施形態では、内生菌又は内生菌が一体化している植物は、硝化阻害剤等の阻害化合物、例えば、ブラキアラクトン等のフシコッカンを生産し得る。
好ましくは、植物細胞、植物、植物種子、又は他の植物部分は、牧草、更に好ましくは、飼料、芝、バイオエネルギー、穀物、又は工芸作物牧草に由来する。
飼料、芝、又はバイオエネルギー牧草は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ブラキアリア・ディクチオネウラ、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッド、例えば、ルジグラス×ブラキアリア・ブリザンタの間、ルジグラス×ブラキアリア・デクンベンスの間、[ルジグラス×ブラキアリア・デクンベンス]×ブラキアリア・ブリザンタの間、[ルジグラス×ブラキアリア・ブリザンタ]×ブラキアリア・デクンベンスの間の種間ハイブリッドを含む、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体(パニックグラス)に属するもの、そして、ホソムギ(ペレニアルライグラス)及びロリウム・アルンディナセウム(トールフェスク)及びネズミムギ(イタリアンライグラス)を含む、ドクムギ属及びウシノケグサ属に属するものであり得る。
穀物又は工芸作物牧草は、パンコムギ(小麦)を含むコムギ属に属するもの、オオムギ(大麦)を含むオオムギ属に属するもの、トウモロコシ(とうもろこし(maize又はcorn))を含むトウモロコシ属に属するもの、イネ(米)を含むイネ属に属するもの、サトウキビ(さとうきび)を含むサトウキビ属に属するもの、モロコシ(もろこし)を含むモロコシ属に属するもの、パニクム・ビルガツム(スイッチグラス)を含むキビ属に属するもの、並びに、ススキ属、スズメノヒエ属、チカラシバ属、イチゴツナギ属、スズメガヤ属、及びヌカボ属に属するものであり得る。
「植物細胞」は、半透膜によって結合されプラスチドを含有する、あらゆる自己増殖細胞を意味する。このような細胞はまた、さらなる増殖が望ましい場合には、細胞壁が必要である。本明細書において使用される植物細胞には、限定はしないが、種子懸濁液培養物、茎、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子が含まれる。
さらなる態様では、本発明は、本明細書において先に記載した内生菌に安定的に感染した植物を得るための、前記内生菌の使用を提供する。好ましくは、内生菌が一体化している植物は、未接種の対照植物よりも害虫及び/又は疾患に対する耐性が向上している。好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、殺虫又は防虫活性が含まれる。更に好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、抗真菌活性が含まれる。
好ましい実施形態では、内生菌又は内生菌が一体化している植物は、真菌が一体化している植物における水及び/若しくは栄養ストレスに対する向上した耐性、又は害虫及び/若しくは疾患に対する向上した耐性等の有利な特性を提供する、1つ又は複数の化合物を生産し得る。好ましい実施形態では、有利な特性には、殺虫又は防虫活性が含まれる。更に好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、抗真菌活性が含まれる。
特に好ましい実施形態では、内生菌又は内生菌が一体化している植物は、硝化阻害剤等の阻害化合物、例えば、ブラキアラクトン等のフシコッカンを生産し得る。
別の好ましい実施形態では、内生菌が一体化している植物は、本明細書において先に記載した飼料、芝、バイオエネルギー牧草、穀物、又は工芸作物牧草である。
本発明のさらなる態様では、植物における害虫及び/又は疾患に対する耐性を増大させる方法が提供され、前記方法には、前記植物に本明細書において先に記載した内生菌を接種することが含まれる。好ましくは、内生菌が一体化している植物は、未接種の対照植物よりも害虫及び/又は疾患に対する耐性が向上している。好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、殺虫又は防虫活性が含まれる。更に好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、抗真菌活性が含まれる。更に別の好ましい実施形態では、内生菌が一体化している植物は、本明細書において先に記載した飼料、芝、バイオエネルギー牧草、穀物、又は工芸作物牧草である。
別の態様では、本発明は、フシコッカンを生産する方法であって、
ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物から内生菌を単離する工程、
前記内生菌を適切な培養培地内で成長させる工程、及び
フシコッカンを含む1つ又は複数の有機化合物を、内生菌細胞、培養培地、又は培養培地若しくは内生菌と関連する空間から回収する工程
を含む、方法を提供する。
好ましくは、内生菌は、本明細書において先に記載した内生菌である。
好ましくは、フシコッカンは、ブラキアラクトンとしても知られている式Iの化合物、又はその誘導体、異性体、及び/若しくは塩である。
好ましくは、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア・マルロシー、ブラキアリア・ニグロペダタ、ウロクロア・ディクチオネウラ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ブラキアリア・オブツシフローラ、ブラキアリア・セリフォリア、ウロクロア・アドベナ、ウロクロア・アレクタ、ウロクロア・ブラキュウラ、ウロクロア・エミニー、ウロクロア・モリス、ウロクロア・キサントレウカ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ウロクロア・プランタギネア、ウロクロア・プラチノタ、ウロクロア・キサントレウカ、ブラキアリア・ホロセリセア、ブラキアリア・レプタンス、ブラキアリア・ミリフォルミス、及びブラキアリア・ディスタチア、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される。
好ましくは、内生菌は、炭水化物源を含む培養培地で成長させられる。
炭水化物源は、ポテトデキストロース寒天、ポテトデキストロース培養液、若しくは半ポテトデキストロース寒天等の、デンプン/糖ベースの寒天若しくは培養液、又は、オートミール寒天若しくはオートミール培養液等の、穀草ベースの寒天若しくは培養液であり得る。他の炭水化物源には、内生菌寒天、20%ショ糖を添加したムラシゲスクーグ、半V8ジュース/半PDA、素寒天、及び酵母麦芽抽出物寒天が含まれ得る。
好ましい実施形態では、内生菌は、ポテトデキストロース又はオートミール、例えば、ポテトデキストロース寒天、半ポテトデキストロース寒天、オートミール寒天、ポテトデキストロース培養液、又はオートミール培養液を含む培養培地内で培養され得る。最も好ましくは、真菌は、オートミールを含む培養培地内で培養され得る。
内生菌は、好気性又は嫌気性条件下で培養され得る。
内生菌は、およそ1からおよそ100日、更に好ましくはおよそ1からおよそ50日、更に好ましくはおよそ1からおよそ10日の期間にわたって培養され得る。
好ましい実施形態では、内生菌は、バイオリアクター内で培養され得る。「バイオリアクター」は、本発明の真菌及び/又はその生成物を伴う化学的プロセスがその中で行われる、管のような、生物学的に活性な環境をサポートする装置又はシステムを意味する。化学的プロセスは、好気性又は嫌気性であり得る。バイオリアクターは、数ミリリットルから数立方メートル、例えば、およそ50ミリリットルからおよそ50000リットルのサイズ範囲の容積を有し得る。バイオリアクターは、バッチ培養、バッチ投入培養、かん流培養、又は連続培養、例えば、撹拌タンクバイオリアクター内での連続培養を介して操作され得る。バイオリアクター内で培養された内生菌は、懸濁又は固定され得る。
本方法は、フシコッカンを含む1つ又は複数の有機化合物を、内生菌細胞、培養培地、又は培養培地若しくは内生菌と関連する空間から回収する工程を含む。
例えば、有機化合物は、細胞内組織から、内生菌がその中に液体を分泌し得る培養培地から、又は内生菌がその中に蒸気を分泌し得る空間から回収され得る。
蒸気は、内生菌から直接、又は蒸気と液相との間を移行する分泌液体から生じ得る。
有機化合物を回収する工程は、細胞を培養培地から分離することによって、又は培養培地若しくは内生菌と関連する蒸気を捕捉することによって、好ましくは行われる。
好ましくは、有機化合物は次いで、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、分留、低温蒸留、膜分離、及び、圧力、真空、又は温度スイング吸着等の吸収クロマトグラフィーからなる群から選択される方法によって単離又は精製される。
「有機化合物」は、その分子が炭素元素を含有する化合物を意味する。
好ましい実施形態では、有機化合物は、揮発性炭化水素又は液体炭化水素等の炭化水素であり得る。最も好ましくは、有機化合物は、揮発性炭化水素であり得る。
「炭化水素」は、炭素元素及び水素元素を含む有機化合物を意味する。
この文脈での用語「揮発性の」は、標準的な実験室温度及び圧力で蒸発又は昇華し得る有機化合物を意味する。揮発性有機化合物には、高い蒸気圧、低い沸点、及び/又は低い分子量を有するものが含まれる。
本発明のさらなる態様では、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物内でフシコッカンを生産する方法が提供され、前記方法は、
ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物、及び内生菌、好ましくは本明細書において先に記載した内生菌を提供する工程、
前記植物に前記内生菌を感染させて共生植物を形成する工程、
共生植物を適切な培養培地内で成長させてフシコッカンを生産させる工程
を含む。
好ましくは、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア・マルロシー、ブラキアリア・ニグロペダタ、ウロクロア・ディクチオネウラ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ブラキアリア・オブツシフローラ、ブラキアリア・セリフォリア、ウロクロア・アドベナ、ウロクロア・アレクタ、ウロクロア・ブラキュウラ、ウロクロア・エミニー、ウロクロア・モリス、ウロクロア・キサントレウカ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ウロクロア・プランタギネア、ウロクロア・プラチノタ、ウロクロア・キサントレウカ、ブラキアリア・ホロセリセア、ブラキアリア・レプタンス、ブラキアリア・ミリフォルミス、及びブラキアリア・ディスタチア、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される。
好ましくは、植物は、接種、育種、交配、ハイブリダイゼーション、形質導入、トランスフェクション、形質転換、及び/又は遺伝子ターゲティング、並びにその組合せからなる群から選択される方法によって内生菌に感染されている。
内生菌に感染している植物は、公知の技術によって培養され得る。当業者であれば、培養対象の植物に応じて適切な培養条件を容易に決定することができる。
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法によって生産され、本発明の内生菌に安定的に感染している植物、植物種子、又は植物に由来する他の植物部分を提供する。好ましくは、内生菌が一体化している植物、植物種子、又は他の植物部分は、未接種の対照植物、植物種子、又は他の植物部分よりも、害虫及び/又は疾患に対する耐性が向上している。好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、殺虫又は防虫活性が含まれる。更に好ましい実施形態では、害虫及び/又は疾患に対する向上した耐性には、抗真菌活性が含まれる。
特に好ましい実施形態では、内生菌又は内生菌が一体化している植物は、硝化阻害剤等の阻害化合物、例えば、ブラキアラクトン等のフシコッカンを生産し得る。
好ましくは、植物細胞、植物、植物種子、又は他の植物部分は、牧草、更に好ましくは、飼料、芝、バイオエネルギー牧草、穀物、又は工芸作物牧草に由来する。
飼料、芝、又はバイオエネルギー牧草は、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ブラキアリア・ディクチオネウラ、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッド、例えば、ルジグラス×ブラキアリア・ブリザンタの間、ルジグラス×ブラキアリア・デクンベンスの間、[ルジグラス×ブラキアリア・デクンベンス]×ブラキアリア・ブリザンタの間、[ルジグラス×ブラキアリア・ブリザンタ]×ブラキアリア・デクンベンスの間の種間ハイブリッドを含む、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体(パニックグラス)に属するもの、そして、ホソムギ(ペレニアルライグラス)及びロリウム・アルンディナセウム(トールフェスク)及びネズミムギ(イタリアンライグラス)を含む、ドクムギ属及びウシノケグサ属に属するものであり得る。
穀物又は工芸作物牧草は、パンコムギ(小麦)を含むコムギ属に属するもの、オオムギ(大麦)を含むオオムギ属に属するもの、トウモロコシ(とうもろこし(maize又はcorn))を含むトウモロコシ属に属するもの、イネ(米)を含むイネ属に属するもの、サトウキビ(さとうきび)を含むサトウキビ属に属するもの、モロコシ(もろこし)を含むモロコシ属に属するもの、パニクム・ビルガツム(スイッチグラス)を含むキビ属に属するもの、並びに、ススキ属、スズメノヒエ属、チカラシバ属、イチゴツナギ属、スズメガヤ属、及びヌカボ属に属するものであり得る。
別の態様では、本発明は、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物に1つ又は複数の内生菌を接種する方法であって、
ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物の滅菌された種子を提供する工程、
種子を無菌条件下で発芽させて、微生物を実質的に有さない宿主植物を得る工程、
宿主植物に1つ又は複数の内生菌を接種する工程
を含む、方法を提供する。
出願人は理論に制限されることを望まないが、本発明の方法を無菌条件下で行うことによって、内生菌が微生物を実質的に有さない宿主植物内に確実に接種され、それによって、接種成功の頻度が容易に高まると考えられる。更に、宿主植物の確立を可能にするための、根成長促進培地等の異なる培地の、接種前の使用によっても、接種頻度が容易に高まると考えられる。無菌環境の使用もまた、汚染物質を伴わないマイクロバイオームの分析が可能になる。
例えば、接種頻度は、およそ25%からおよそ100%の間、更に好ましくはおよそ50%からおよそ100%の間、更に好ましくはおよそ75%からおよそ100%の間であり得る。接種頻度は、従来の方法より高くなり得る。
好ましくは、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物は、本明細書において先に記載した種のものである。
好ましくは、前記1つ又は複数の内生菌は、本明細書において先に記載した内生菌から選択される。1つ又は複数の内生菌は、細菌又は真菌又はその混合物であり得る。
好ましい実施形態では、種子を無菌条件下で発芽させて宿主植物を得る工程は、M3B等のシュート増殖培地及びMS+NAA等の根増殖培地上で発芽種子を成長させることを含み得る。好ましくは、発芽種子をシュート増殖培地上で成長させ、得られたシュートを単一の分げつ芽に割き、次いでそれを根増殖培地に移すことができる。単一の分げつ芽を、根増殖培地上でおよそ1からおよそ6週間、更に好ましくはおよそ2からおよそ3週間成長させて、根の成長を促進することができる。得られた小植物は再び、内生菌の接種のために単一の分げつ芽に割かれ得る。
好ましい実施形態では、宿主植物に1つ又は複数の内生菌を接種する工程は、第1シュートを露出させるための外部葉鞘の除去、シュート分裂組織における傷の形成、及び傷の中への接種を含み得る。
好ましい実施形態では、本方法は、接種後に小植物を無菌培地上で好ましくはおよそ1からおよそ6週間、更に好ましくはおよそ2からおよそ3週間の期間にわたり保持するさらなる工程を含み得る。
好ましい実施形態では、本方法は、こうして得られた接種された植物をさらなる成長のために例えば温室条件下で土壌又は類似の培地に移すさらなる工程を含み得る。
本発明をここで、添付の実施例及び図面を参照して更に完全に記載する。しかし、以下の記載は例示的なものにすぎず、上記の本発明の概論に対する制限として決して捉えられるべきではないことが理解される。
内部転写スペーサー(ITS)及び18Sコード領域のrDNA配列分析に基づく、ブラキアリア属種における内生菌単離体の発生を示す図である。ブラキアリア属内生菌単離体は遺伝的に多様であり、少なくとも10の異なる分類群に相当する。 ブラキアリア属-ウロクロア属受託種(左側)に由来する真菌内生菌単離体のITS領域の近隣結合分析を介して得られたbootstrap合意樹、並びに、ITS配列に基づく、5つのブラキアリア属-ウロクロア属種のマイクロバイオームにおける選択及び単離された培養可能な真菌内生菌株の存在/不存在の同定(右側)を示す図である(Bb-ブラキアリア・ブリザンタ、Bh-ブラキアリア・ウミディコラ、Bd-ブラキアリア・デクンベンス、Um-ウロクロア・モサンビセンシス、Br-ルジグラス)。 図２−１の続きである。 図２−２の続きである。 図2のbootstrap合意樹の拡大図である。 ブラキアラクトンを同定するLC(ESI)-MS質量スペクトルを示す図であり、これは、RT:8.91〜8.98分での抽出されたイオンクロマトグラムである。 図3のLC(ESI)-MS質量スペクトルのRT8.93分でのMS断片化ブラキアラクトン断片(333.2059、315.1964、271.2068)を示す図である。 ブラキアラクトンの構造、及び図4の断片化に関与する断片の構造を示す図である。 ブラキアリア属-ウロクロア属のための最適化された内生菌接種手順の連続的段階を示す図である。A.シュート増殖培地(M3B)上で無菌条件下で成長させた、微生物を有さないドナー小植物。B.単一の分げつ芽に割き、根増殖培地(MS+NAA)に移した、ドナーシュート。C.根の成長の促進のために2〜3週間成長させ、その後、小植物を単一の分げつ芽に割き、外部葉鞘を除去して第1シュートを露出させ、素寒天に移し、そしてシュート分裂組織全体にわたり小さな切り目内への接種を行った、単一の分げつ芽、D. 1/2MS培地上で2週間保持された接種済み小植物、E.土壌に移し、温室条件下で8週間成長させた後の小植物。 細菌及び真菌マイクロバイオームと一体化している種子をプロファイリングするための方法を記載するフローチャートを示す図である。添付の写真は、1つの受託種から得た50gの種子から細菌及び真菌DNAを豊富化させる方法の各段階を示す。A.粉砕前に種子を空気乾燥する。B. 100%エタノール洗浄液を回収する。上清は、内生マイクロバイオームと一体化している種子を含有する。C.エタノールの蒸発中のバイアル。D. 10の受託種(カラム1から10)のそれぞれから抽出されたDNAを分析して、真菌DNAの存在を判定する。E.抽出されたDNAを分析して、細菌DNAの存在を判定する。
ブラキアリア属-ウロクロア属種の内生微生物のプロフィール
5つのブラキアリア属-ウロクロア属種の内生菌マイクロバイオームを、メタゲノミクスを使用してプロファイルした。種には、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・ウミディコラ、ルジグラス、ブラキアリア・デクンベンス、及びウロクロア・モサンビセンシスが含まれた。種当たり全部で3つの植物をプロファイルした。各植物から3つの器官をプロファイルした(根、茎、及び葉)。植物当たり器官当たり全部で2つの複製物を調製した。植物材料(およそ100mg)を70%エタノールに30秒、その後4.2%NaOCl(漂白液)に2分浸すことによって表面滅菌し、次いで、無菌MilliQ水内で3から5回すすいで、滅菌剤を確実に完全に除去した。試料を48時間、-58℃及び0.014mBarで凍結乾燥した。DNAを、Qiagen DNeasy plantミニキットを製造者の指示に従って使用して抽出した。細菌マイクロバイオーム(16S rDNA遺伝子のV4領域、およそ350塩基対)をプロファイルするためのユニバーサルPCRプライマー515f及び806r、並びに真菌マイクロバイオーム(rDNA遺伝子のITS2領域、およそ400塩基対)のための58A2F及びITS4を、関連するIlluminaアダプターと共に使用して、メタゲノム分析で内生細菌及び真菌を評価した。ペアエンドライブラリーを準備し、対応するIlluminaユーザーガイドに従ってロードした。メタゲノム配列データをクオリティートリミングし、PANDSEQを使用して対合させて操作的分類単位(OTU)を得、これをGreenGenes細菌データベース及びUNITE真菌データベースに対してアラインして、分類を割り当てた(OTU:97%の配列同一性、e値<10e-110)。OTUを伴う配列の数を全試料にわたって計算し、パーセンテージとして正規化した。
ブラキアリア属-ウロクロア属にわたる総微生物多様性
全部で361の細菌の操作的分類単位(OTU)を、25の細菌門、56の綱、121の科、及び170の属(候補分類群を含む)を含む全ブラキアリア属-ウロクロア属種にわたって同定した(Table 1(表1))。この分析によって、核となるマイクロバイオーム(全ブラキアリア属-ウロクロア属種にわたって見られるOTU)及び固有のマイクロバイオーム(特定のブラキアリア属-ウロクロア属種に関連するOTU)、更に、ブラキアラクトンを生産することが知られているブラキアリア属-ウロクロア属種(ブラキアリア・ウミディコラ及びルジグラス)にのみ関連する細菌OTUが同定された(Table 1(表1))。この分析によって、これらのブラキアリア属-ウロクロア属種から単離された内生菌の存在の交差検証も提供された。
更に、5つの門、14の綱、32の科、及び44の属を含む、84の真菌OTUが同定された(Table 2(表2))。この分析によって、核となるマイクロバイオーム(全ブラキアリア属-ウロクロア属種にわたって見られるOTU)及び固有のマイクロバイオーム(特定のブラキアリア属-ウロクロア属種に関連するOTU)、更に、ブラキアラクトンを生産することが知られているブラキアリア属-ウロクロア属種(ブラキアリア・ウミディコラ及びルジグラス)にのみ関連する真菌OTUが同定された(Table 2(表2))。この分析によって、これらのブラキアリア属-ウロクロア属種から単離された内生菌の存在の交差検証も提供される。
ブラキアリア属-ウロクロア属の植物器官間の微生物多様性
微生物多様性は、ブラキアリア属-ウロクロア属種の根において最も大きく、359の細菌種(99.4%)及び83の真菌種(98.8%)であった(Table 1(表1)及びTable 2(表2))。茎及び葉における微生物多様性は根より有意に低く、5〜20の細菌又は真菌OTUであった。
ブラキアリア属-ウロクロア属種にわたる微生物多様性
核となるマイクロバイオームは、130の細菌OTU及び14の真菌OTUからなるものであった(Table 1(表1)、Table 2(表2)、及びTable 3(表3))。核となる細菌マイクロバイオームは多様な分類群を含有していたが、核となる真菌マイクロバイオームはフンタマカビ綱種を主に含有していた(8)。核となるマイクロバイオームに関連するOTUもまた、全ブラキアリア属-ウロクロア属種にわたって最も豊富なOTUであった。ブラキアリア属-ウロクロア属種に固有のOTUの数は、細菌では5から27の範囲、真菌では2から12の範囲であり、そのそれぞれの種であまり豊富ではないことが多かった。
ブラキアリア・ウミディコラ及びブラキアリア・デクンベンスと一体化している微生物種
ブラキアリア・ウミディコラと一体化している細菌及び真菌OTUの数は、それぞれ189及び48であった。ブラキアリア・ウミディコラは最も高い真菌多様性を有し、それは、あらゆる他のブラキアリア属-ウロクロア属種よりもおよそ15%高かった。逆に、ブラキアリア・ウミディコラは2番目に低い細菌多様性を有し、ブラキアリア・デクンベンス(最も高い細菌多様性)よりもおよそ31%低かった。全ての他のブラキアリア属-ウロクロア属種と同様に、最も大きな微生物多様性は根で観察され、一方、茎及び葉では非常に低い微生物多様性であった。
ブラキアリア・デクンベンスと一体化している細菌及び真菌OTUの数は、それぞれ276及び37であった。ブラキアリア・デクンベンスは最も高い細菌多様性を有し、それは、あらゆる他のブラキアリア属-ウロクロア属種よりもおよそ3から33%高かった。逆に、ブラキアリア・デクンベンスは2番目に低い真菌多様性を有し、ブラキアリア・ウミディコラよりもおよそ23%低かった。全ての他のブラキアリア属-ウロクロア属種と同様に、最も大きな微生物多様性は根で観察され、一方、茎及び葉では非常に低い微生物多様性であった。
ブラキアリア・ウミディコラ及びブラキアリア・デクンベンスの両方と一体化しているトップ5の真菌及び細菌OTUは、他のイネ科種(例えば、イネ、パンコムギ)、菌根(例えば、グロムス属種)、又は根圏細菌(リゾビウム目種)の内生菌を含む、内生菌として主に同定されているNCBIの単離体に対する配列相同性を示す。様々な農作物種の種子寄生病原体である真菌病原体フザリウム・プロリフェラタムもまた存在した(Table 4(表4)及びTable 5(表5))。
ブラキアラクトンを生産するブラキアリア属-ウロクロア属種と一体化している微生物多様性
全部で45の細菌OTU及び29の真菌OTUが、ブラキアラクトンを生産することが見出されているブラキアリア属-ウロクロア属種であるブラキアリア・ウミディコラ及び/又はルジグラスにおいてのみ同定された(Table 1(表1)及びTable 2(表2))。ブラキアラクトンを生産するブラキアリア属-ウロクロア属種と一体化しているOTUは、様々な多様な細菌及び真菌分類群に相当する。
ブラキアリア属マイクロバイオームのメタゲノム分析によって、ブラキアリア属-ウロクロア属牧草の真菌内生菌の宿主範囲を判定する
11のブラキアリア属-ウロクロア属種に由来する全部で97の真菌内生菌単離体を、23の国から得た281の受託種の世界的研究において同定した。内部転写スペーサーITSの配列をさらなる特徴付けに使用した。内部転写スペーサーITS1及びITS2と5.8Sサブユニットとの両方を含む核リボソームDNAの全領域を、プライマーITS5及びITS4を使用してPCR増幅した(Whiteら、1990)。精製されたPCR増幅産物を、Sanger配列決定技術を使用して配列決定した。単離された継代培養された内生菌を次いで、ITS配列同一性に基づいてグループ分けした。内部転写スペーサー(ITS)及び18Sコード領域に基づくリボソームDNA(rDNA)配列分析は、ブラキアリア属内生菌単離体が遺伝的に多様であることを示し、これは少なくとも10の異なる分類群に相当する(図1)。ブラキアラクトンを生産することが示されているブラキアリア・ウミディコラ及びルジグラス種は、高レベルの真菌内生菌多様性及び豊富度を示す(図1)。
配列データをBLASTN分析において使用して、NCBIデータベースにおけるマッチを同定した。発見されたブラキアリア属内生菌は、遺伝的に新規である。各単離体ITS配列と公的に利用可能なデータベースにおける配列との比較では、>90%同一性を有する真菌株は同定されなかった。系統分析によって、異なるITSクラスターの単離体が多様な属に属することが確認された。いくつかの受託種で、単一の植物から単離された複数の内生菌が、異なるrDNA特異的クラスターに属し、このことは、同一植物において複数の真菌内生菌種が共存していることを示唆する(Table 6(表6))。
選択され、単離され、培養可能な真菌内生菌株のためのrDNA-ITS領域配列を使用して、5つのブラキアリア属-ウロクロア属種(Bb-ブラキアリア・ブリザンタ、Bh-ブラキアリア・ウミディコラ、Bd-ブラキアリア・デクンベンス、Um-ウロクロア・モサンビセンシス、Ur-ウロクロア・ルジエンシス(U. ruziensis))のマイクロバイオームにおけるその存在/不存在を同定した(図2〜図2A)。全部で27の単離体がメタゲノム分析においてOTUに対する配列相同性を有し(>10e-145)、その内生生態的地位が更に確認された。単離体は、アクレモニウム属種、サロクラジウム・ストリクツム、ボタンタケ属種、ミクロスフェロプシス・アルンディニス、未培養の真菌種、及びプセウドギムノアスクス種に対する配列相同性を有していた。宿主種にわたるITSの存在で観察されたパターンは、ITS Groupの類似性の範囲内である。例えば、ITS5(例えば、2.15.A.2)及びITS1は単一のITS群を形成し(群のサブクラスター化内ではない)、ブラキアリア属-ウロクロア属において遍在的に存在すると考えられる。逆に、ITS7は、同定された3つのITS7サブクラスターに関連する宿主の存在/不存在のパターンを示す[内生菌単離体2.3.C.1(クラスター1)、2.10.C.2(クラスター2)、2.12.B.1、及び2.11.B.1(クラスター3)に代表される]。ITS6群は遺伝的に多様であり、3つの異なるクラスターを有する。内生菌単離体2.2.A.1は、試験した5つの宿主種の1つのみで検出され、一方、2.10.D.1は広範な宿主範囲を示す。ITS2群内生菌は、2つの異なる宿主プロファイルを示す。内生菌12.1.B及び9.2.Bは広範な宿主範囲を示し、試験した5つの宿主種のそれぞれにおいて存在する。逆に、1.1.Aは試験した5つの宿主種の1つのみで検出され、狭い宿主範囲を示す。同一の分類群の推定上の亜群の間の宿主コロニー形成の変動は、宿主-内生菌の共進化及び特殊化の指標となり得る。
ブラキアラクトンは微生物由来である
制御環境において維持されているブラキアリア属-ウロクロア属牧草-内生菌一体物の成熟植物を、代謝プロファイリング分析にかけた。3つのブラキアリア属-ウロクロア属種(ブラキアリア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ルジグラス)のそれぞれの4つの個々の植物(生物学的複製物)を、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を使用して、ブラキアラクトンの存在について分析した。凍結乾燥した疑似茎試料を、80%メタノール抽出手順を使用して、LC-MS分析のために調製した。化合物ブラキアラクトンを、ブラキアリア属-内生菌一体物(ブラキアリア・ウミディコラ、ルジグラス)の根組織において同定した(図3から図5、Table 7(表7))。ブラキアラクトンの存在を、MSを介して確認した(RT8.93分で333.2059の質量対電荷比[m/z]でイオン抽出した)。ブラキアラクトンは、ブラキアリア・デクンベンス-内生菌一体物又はウロクロア・モサンビセンシス-内生菌一体物では検出されなかった(Table 7(表7))。
ブラキアリア属内生菌をブラキアリア属-ウロクロア属に接種するための最適化された方法
商業的に関連のあるブラキアリア属-ウロクロア属の生殖質を含む宿主パネルを確立して、遺伝的に新規で非常に多様な内生菌単離体を単一の宿主遺伝子型に接種することを可能にした。微生物を有さない宿主植物に内生菌を無菌条件で接種するための最適化された方法を開発し、接種の成功頻度を高めることを容易にした(Table 8(表8))。rDNA配列で規定されたクレードのうち4つに相当する4つの真菌内生菌を、ブラキアリア属-ウロクロア属宿主パネルへの接種及び特徴付けのための候補として同定した。
滅菌したブラキアリア属種子を無菌条件下で発芽させて、接種に使用する宿主植物から微生物を除去する。微生物を有さないドナー小植物を、シュート増殖培地(M3B)上で無菌条件下で成長させる。ドナーシュートを単一の分げつ芽に割き、根増殖培地(MS+NAA)に移す。単一の分げつ芽を2〜3週間成長させて根の成長を促進し、小植物を次いで再び、単一の分げつ芽に割き、外部葉鞘を除去して第1シュートを露出させる。無傷の根を有する第1シュートを、内生菌菌糸体の接種のために素寒天に移す。内生菌の接種では、シュート分裂組織全体にわたって小さな切り目を入れ、内生菌を傷に接種する。接種後、小植物を1/2MS培地上で2週間維持する。これを次いで土壌に移し、温室条件下で8週間成長させ、その後、株特異的SSRマーカーの診断セットを使用して内生菌の存在について試験する(図6)。
内生菌の接種頻度を、各内生菌単離体についての単純配列反復(SSR)マーカーの診断(すなわち、各内生菌についての各SSR遺伝子座での特異的対立遺伝子サイズ)セットを使用して、接種のおよそ6ヶ月後に、各候補内生菌について判定した。
接種の成功は、リボソームDNA配列が規定されたクレードのそれぞれに由来する代表的な内生菌で達成された(Table 8(表8))。異なるITS群に相当する内生菌単離体間の変動が観察された。ITS5(2.15.A.2)>ITS7(2.10.C.2)>ITS2(12.1.B)>ITS1(5.1.B)。異種間比較もまた観察した。内生菌単離体2.15.A.2(58から83%)及び2.10.C.2(38%から83%)は、中程度に適合性の12.1.B(8から76%)及び狭い宿主適合性の5.1.B(0から7%)と比較して、広い種適合性を示した。予想通り、各内生菌株は、それが元々単離された種で最も高い接種頻度を示す。
宿主の接種能力の変動もまた観察した。ウロクロア・モサンビセンシスは、非常に高い接種成功頻度(60%)で、広範な真菌内生菌と安定な一体物を形成する。ウロクロア・モサンビセンシスが複数の非常に多様な真菌内生菌と一体物を形成することにも留意されたい(図1、Table 6(表6))。ブラキアリア属で同定された7つのITS群の6つに相当する内生菌株がこの種から単離された(図1)。ブラキアリア・ウミディコラは、非常に高い接種成功頻度(41%)で、広範な真菌内生菌と安定な一体物を形成する。ウロクロア・モサンビセンシスでは、この種は、同定された7つのITS群の4つを有する、様々な複数の内生菌を天然に有する(図1)。
ブラキアリア属-ウロクロア属種子マイクロバイオームのメタゲノム分析
植物マイクロバイオーム研究における大きな挑戦は、植物マイクロバイオームの内生菌構成要素を分析するためのものであり、DNAを植物組織から抽出することが必要である。抽出されたDNAにおける高割合の植物DNA:微生物DNA(細菌では約20:1、真菌では約1:1)の存在は、下流の配列分析に影響する。以前の研究では、これを対処した1つの方法は、数多くの配列リードを得て、標的数のマイクロバイオームリードを達成することである。
この実施例では、DNAを植物種子から抽出する時にマイクロバイオーム(細菌及び真菌DNAの両方)を豊富化するための方法が開発された。この方法は植物種子への適用に限定されず、葉、茎、及び/又は根植物材料を含む、あらゆる目的種のあらゆる植物組織に適用することができる。
種子と一体化している内生微生物は、分子育種シナリオにおいて利用され得るために興味深く、それによって、微生物及び宿主植物は、目的の特定の形質について共選択される。更に、根及び種子マイクロバイオームの両方における内生微生物の存在は特に興味深く、それは、植物全体に分散する、種子と一体化している微生物が、害虫及び疾患耐性又はブラキアラクトンの生産を介する生物学的硝化阻害(BNI)等の性能形質の増強に関連し得るためである。
宿主種子のコロニー形成における変動は、宿主-内生菌の共進化及び特殊化の指標となり得る。
単離及び精製されると、内生菌種子マイクロバイオームの個々の構成要素は、分子マーカーの開発、分類学上の同定、及びゲノム系統学的分析のために、ゲノム配列決定及び特徴付けされ得る。選択されたマイクロバイオーム構成要素生物はまた、単独で及び組み合わせて表現型評価をされて、増強した生産形質、例えばBNIを様々な商業的に重要なブラキアリア属種に付与する微生物が同定され得る。持続可能な農業及び環境のために、広範な作物種にわたるブラキアリア属マイクロバイオームの生物学的特性を更に利用する可能性が存在する。
種子のマイクロバイオーム分析において細菌及び真菌DNAを豊富化するための方法論
ブラキアリア属種子におけるマイクロバイオーム(細菌及び真菌DNA)構成要素を豊富化するための方法が開発された(図7)。この実施例では植物種子に使用されたが、この方法は、あらゆる目的種のあらゆる植物組織にも適用することができる。植物組織に応じて、当業者であれば、マイクロバイオームの豊富化を最適化するための方法にわずかな変化があってよいことが理解され、例えば、植物材料の粉砕量は、例えば、植物材料の性質に応じて細かい粉砕から粗い粉砕まで変化し得る。
10の選択された受託種(Table 9(表9))のそれぞれの種子50グラムを、30分、振とうしながら表面滅菌した(5%[w/v]NaHCl及びTween 20)。種子試料を次いで8から10回、無菌MilliQ水ですすいで、滅菌剤を確実に完全に除去した。種子を、無菌のフィルター紙上で、無菌条件下で一晩乾燥させた。乾燥した種子を、ジェノグラインダー(SPEX SamplePrep 2010 Geno/GrinderR、Metuchen、USA)を使用して部分的に粉砕した。粉砕された種子を次いで無水エタノールで、連続振とうしながら12時間にわたり2回洗浄した。洗浄後、試料を静置し、種子と一体化している内生マイクロバイオームを含有する上清を回収した。上清を次いで、無菌条件下で完全に蒸発させた。DNAを、Qiagen DNeasy plantミニキットを製造者の指示に従って使用して、最終粗精物(エタノールの蒸発後に残ったもの)から抽出した。
同時に、DNAをまた、Qiagen DNeasy plantミニキットを製造者の指示に従って使用して、表面滅菌された種子(各受託種から10の種子)から抽出した。細菌及び真菌を、細菌マイクロバイオーム(16S rDNA遺伝子のV4領域、およそ350塩基対)をプロファイルするためのユニバーサルPCRプライマー515f(Wang & Qian、2009)及び806r(McBainら、2003)、並びに真菌マイクロバイオーム(rDNA遺伝子のITS2領域、およそ400塩基対)のための58A2F(Martin & Rygiewicz、2005)及びITS4(Whiteら、1990)を、関連するIlluminaアダプターと共に使用して、メタゲノム分析で評価した。リボソームRNA遺伝子アンプリコンを調製し、対応するユーザーガイドに従ってMiSeq(Illumina)で配列決定した。
ブラキアリア属牧草の、種子と一体化している内生マイクロバイオームを同定するための、メタゲノム分析
4つの選択されたブラキアリア属-ウロクロア属種の内生(細菌及び真菌)種子マイクロバイオームを、特定の種及び/又は形質、例えば害虫及び疾患耐性、又はブラキアラクトンの生産を介する生物学的硝化阻害(BNI)に関連する微生物を同定する目的で、メタゲノムを使用してプロファイルした。
調べたブラキアリア属種には、生物学的硝化阻害(BNI)化合物を生産することがこれまでに記載されている3つの菌、すなわちブラキアリア・ウミディコラ、ルジグラス、ブラキアリア・デクンベンス、及びBNI化合物を生産しないブラキアリア・ブリザンタが含まれた(Table 9(表9))。
データを次いで、以下の、ブラキアリア属の、種子と一体化している内生マイクロバイオームを同定するために分析する:
- ブラキアラクトンの生産に関連するマイクロバイオーム
〇ブラキアリア・ウミディコラにおけるBNI形質と特異的なもの
〇BN形質に関して一般的なもの(すなわち、ブラキアリア・ウミディコラ、ルジグラス、及びブラキアリア・デクンベンスに共通のもの)
- ブラキアリア・ウミディコラ、ルジグラス、ブラキアリア・デクンベンス、又はブラキアリア・ブリザンタに固有のマイクロバイオーム
- 研究対象の全ブラキアリア属種に共通のマイクロバイオーム
様々な変更、修正、及び/又は追加が、本明細書において概説される本発明の趣旨から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
本明細書において用いる場合、文脈によって別段のことが要求される場合を除き、用語「含む(comprise)」及びその用語の変型、例えば「含む(comprising)」、「含む(comprises)」、及び「含まれる(comprised)」は、限定を意図したものでは全くなく、又は、さらなる添加物、構成要素、整数、若しくは工程を排除することを意図したものではない。
本明細書におけるあらゆる先行技術への参照は、この先行技術がオーストラリア若しくはあらゆる他の管轄区域における一般常識の一部を形成すること、又はこの先行技術が当業者に明らかであると確認される、理解される、及び/若しくは考えられると合理的に予想され得ることの承認又は何らかの形態の示唆ではなく、またそれとして捉えられるべきではない。
V15/028236
V15/028237
V15/028238
V15/028239
V15/028240
V15/028241
V15/028242
(参考文献)

Claims (44)

  1. 内生菌株を単離、選択、及び/又は特徴付けするための方法であって、
    ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物種から植物材料の試料を提供する工程、
    前記試料をメタゲノム分析にかける工程、
    各ブラキアリア属-ウロクロア属植物種における細菌及び/又は真菌の操作的分類単位(OTU)を同定する工程、
    各試料種内に存在するOTUを比較して、核となる、補助的な、及び/又は固有のマイクロバイオームを同定する工程、及び
    望ましい核となる、補助的な、又は固有のマイクロバイオームに相当する内生菌株を選択する工程
    を含む、方法。
  2. ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物種が、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア・マルロシー、ブラキアリア・ニグロペダタ、ウロクロア・ディクチオネウラ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ブラキアリア・オブツシフローラ、ブラキアリア・セリフォリア、ウロクロア・アドベナ、ウロクロア・アレクタ、ウロクロア・ブラキュウラ、ウロクロア・エミニー、ウロクロア・モリス、ウロクロア・キサントレウカ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ウロクロア・プランタギネア、ウロクロア・プラチノタ、ウロクロア・キサントレウカ、ブラキアリア・ホロセリセア、ブラキアリア・レプタンス、ブラキアリア・ミリフォルミス、ブラキアリア・ディスタチア、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  3. ブラキアリア属-ウロクロア属複合体の植物種が、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ルジグラス、及びウロクロア・モサンビセンシスからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
  4. 植物材料の試料が、葉、茎、及び根材料からなる群の1つ又は複数から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 植物材料の試料が種子材料である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  6. ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物種由来の植物材料の試料を提供する工程が、
    植物材料を粉砕する工程、
    粉砕された植物材料をアルコールで洗浄する工程、及び
    核酸をアルコール洗浄液から抽出する工程
    を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 植物材料の試料の遺伝物質を回収及び分析して、細菌及び/又は真菌の配列データを得る工程を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 配列データが、16S rDNA遺伝子のV4領域及びrDNA遺伝子のITS2領域のいずれか又は両方に向けられたユニバーサルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーを使用して得られる、請求項7に記載の方法。
  9. 望ましい核となる、補助的な、又は固有のマイクロバイオームに相当する選択された内生菌株が、内生菌が一体化している植物における有利な特性を提供するものである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 内生菌が一体化している植物における有利な特性が、水及び/若しくは栄養ストレスに対する向上した耐性、又は害虫及び/若しくは疾患に対する向上した耐性である、請求項9に記載の方法。
  11. 内生菌が一体化している植物における有利な特性がフシコッカン化合物の生産である、請求項9に記載の方法。
  12. フシコッカン化合物がブラキアラクトンである、請求項11に記載の方法。
  13. 請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって単離、選択、及び/又は特徴付けされた、実質的に精製又は単離された内生菌。
  14. National Measurement Instituteにそれぞれ受託番号V15/028237、V15/028238、V15/028239、V15/028240、V15/028241、及びV15/028242で寄託された、ボタンタケ属種/アクレモニウム属種2.15.A.2、アクレモニウム属種2.3.C.1、ミクロスフェロプシス・アルンディニス2.10.D.1、サロクラジウム属種/アクレモニウム属種2.12.B.1、サロクラジウム属種/アクレモニウム属種2.10.C.2、及びサロクラジウム属種/アクレモニウム属種2.11.B.1からなる群から選択される、実質的に精製又は単離された内生菌。
  15. 請求項13又は14に記載の1つ又は複数の内生菌を接種された植物であって、請求項13又は14に記載の1つ又は複数の内生菌に安定的に感染した無内生菌宿主植物を含む、接種された植物。
  16. 未接種の対照植物と比較して有利な特性を有し、前記有利な特性が、水及び/若しくは栄養ストレスに対する向上した耐性、又は害虫及び/若しくは疾患に対する向上した耐性である、請求項15に記載の接種された植物。
  17. 未接種の対照植物と比較して有利な特性を有し、前記有利な特性がフシコッカン化合物の生産である、請求項15に記載の接種された植物。
  18. フシコッカン化合物がブラキアラクトンである、請求項17に記載の接種された植物。
  19. 植物が牧草種植物である、請求項15から18のいずれか一項に記載の接種された植物。
  20. 牧草種植物が、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ブラキアリア・ディクチオネウラ、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッド、並びにドクムギ属、ウシノケグサ属、コムギ属、オオムギ属、モロコシ属、トウモロコシ属、イネ属、サトウキビ属、スズメノヒエ属、ススキ属、キビ属、チカラシバ属、イチゴツナギ属、スズメガヤ属、及びヌカボ属に属するものからなる群から選択される、請求項19に記載の接種された植物。
  21. 請求項13又は14に記載の内生菌に感染した植物であって、接種、育種、交配、ハイブリダイゼーション、形質導入、トランスフェクション、形質転換、及び/又は遺伝子ターゲティング、並びにその組合せからなる群から選択される方法によって感染されている、植物。
  22. 請求項15又は21に記載の植物に由来する植物、植物種子、又は他の植物部分。
  23. 請求項13又は14に記載の内生菌に安定的に感染した植物を得るための、請求項13又は14に記載の内生菌の使用。
  24. 植物に請求項13又は14に記載の内生菌を接種する工程を含む、植物における害虫及び/又は疾患に対する耐性を増大させる方法。
  25. フシコッカンを生産する方法であって、
    ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物から内生菌を単離する工程、
    前記内生菌を適切な培養培地内で成長させる工程、及び
    フシコッカンを含む1つ又は複数の有機化合物を、内生菌細胞、培養培地、又は培養培地若しくは内生菌と関連する空間から回収する工程
    を含む、方法。
  26. 内生菌が請求項13又は14に記載の内生菌である、請求項25に記載の方法。
  27. フシコッカンがブラキアラクトンである、請求項25又は26に記載の方法。
  28. ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物が、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア・マルロシー、ブラキアリア・ニグロペダタ、ウロクロア・ディクチオネウラ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ブラキアリア・オブツシフローラ、ブラキアリア・セリフォリア、ウロクロア・アドベナ、ウロクロア・アレクタ、ウロクロア・ブラキュウラ、ウロクロア・エミニー、ウロクロア・モリス、ウロクロア・キサントレウカ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ウロクロア・プランタギネア、ウロクロア・プラチノタ、ウロクロア・キサントレウカ、ブラキアリア・ホロセリセア、ブラキアリア・レプタンス、ブラキアリア・ミリフォルミス、ブラキアリア・ディスタチア、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される、請求項25から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 請求項25から28のいずれか一項に記載の方法によって生産されたフシコッカン。
  30. ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物内でフシコッカンを生産する方法であって、
    ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物、及び内生菌を提供する工程、
    前記植物に前記内生菌を感染させて共生植物を形成する工程、並びに
    共生植物を適切な培養培地内で成長させてフシコッカンを生産させる工程
    を含む、方法。
  31. 内生菌が請求項13又は14に記載の内生菌である、請求項30に記載の方法。
  32. フシコッカンがブラキアラクトンである、請求項30又は31に記載の方法。
  33. ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物が、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア・マルロシー、ブラキアリア・ニグロペダタ、ウロクロア・ディクチオネウラ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ブラキアリア・オブツシフローラ、ブラキアリア・セリフォリア、ウロクロア・アドベナ、ウロクロア・アレクタ、ウロクロア・ブラキュウラ、ウロクロア・エミニー、ウロクロア・モリス、ウロクロア・キサントレウカ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ウロクロア・プランタギネア、ウロクロア・プラチノタ、ウロクロア・キサントレウカ、ブラキアリア・ホロセリセア、ブラキアリア・レプタンス、ブラキアリア・ミリフォルミス、ブラキアリア・ディスタチア、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される、請求項30から32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 請求項30から33のいずれか一項に記載の方法によって生産されたフシコッカン。
  35. ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物に1つ又は複数の内生菌を接種する方法であって、
    ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物の滅菌された種子を提供する工程、
    種子を無菌条件下で発芽させて、微生物を実質的に有さない宿主植物を得る工程、及び
    宿主植物に1つ又は複数の内生菌を接種する工程
    を含む、方法。
  36. 内生菌が請求項13又は14に記載の内生菌である、請求項35に記載の方法。
  37. ブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の植物が、ブラキアリア・ブリザンタ、ブラキアリア・デクンベンス、ブラキアリア・ウミディコラ、ブラキアリア・ストロニフェラ、ルジグラス、ウロクロア・ブリザンタ、ウロクロア・デクンベンス、ウロクロア・ウミディコラ、ウロクロア・モサンビセンシス、ブラキアリア・マルロシー、ブラキアリア・ニグロペダタ、ウロクロア・ディクチオネウラ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ブラキアリア・オブツシフローラ、ブラキアリア・セリフォリア、ウロクロア・アドベナ、ウロクロア・アレクタ、ウロクロア・ブラキュウラ、ウロクロア・エミニー、ウロクロア・モリス、ウロクロア・キサントレウカ、ウロクロア・オリゴトリカ、ウロクロア・パニコイデス、ウロクロア・プランタギネア、ウロクロア・プラチノタ、ウロクロア・キサントレウカ、ブラキアリア・ホロセリセア、ブラキアリア・レプタンス、ブラキアリア・ミリフォルミス、ブラキアリア・ディスタチア、並びにブラキアリア属-ウロクロア属種複合体の種間及び種内ハイブリッドからなる群から選択される、請求項35又は36に記載の方法。
  38. 接種頻度がおよそ75%からおよそ100%の間である、請求項35から37のいずれか一項に記載の方法。
  39. 種子を無菌条件下で発芽させて宿主植物を得る工程が、シュート増殖培地及び根増殖培地上で発芽種子を成長させる工程を含む、請求項35から38のいずれか一項に記載の方法。
  40. シュート増殖培地上で成長したシュートを単一の分げつ芽に割く工程、及びそれを根増殖培地に移す工程を更に含む、請求項39に記載の方法。
  41. 単一の分げつ芽を、根増殖培地上でおよそ1からおよそ6週間成長させて、根の成長を促進する工程を更に含む、請求項40に記載の方法。
  42. 宿主植物に1つ又は複数の内生菌を接種する工程が、第1シュートを露出させるための外部葉鞘の除去、シュート分裂組織における傷の形成、及び傷の中への接種を含む、請求項35から41のいずれか一項に記載の方法。
  43. 接種後に小植物を無菌培地上でおよそ1からおよそ6週間の期間にわたり保持する工程を更に含む、請求項35から42のいずれか一項に記載の方法。
  44. 接種された植物をさらなる成長のために土壌又は類似の培地に移す工程を更に含む、請求項35から43のいずれか一項に記載の方法。
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