CN108291264A - 臂形草属内生菌及相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及内生菌、特别是与臂形草属‑尾稃草属种复合体的植物相关联的内生菌，用所述内生菌侵染的植物，由所述内生菌产生的产物和相关方法。

Description

臂形草属内生菌及相关方法
技术领域
本发明涉及内生菌(endophyte)、用所述内生菌侵染的植物、由所述内生菌产生的产物和相关方法。
背景技术
微生物代表新的基因和化合物的宝贵资源，这些基因和化合物有可能用于一系列工业领域中。除了在环境净化以及食品和化妆品生产中的用途之外，科学文献还提供了作为抗生素、免疫抑制剂、抗癌剂和降胆固醇药的主要来源的大量的微生物。
相对于未开发的被称为内生菌的微生物群——其存在于活植物的组织中——为新化合物和基因提供了特别多样的来源，所述新化合物和基因可为社会、特别是农业提供重要益处。
内生菌通常与其宿主形成互惠关系，其中内生菌通常通过产生防御化合物而使宿主更加健康。同时，宿主植物为内生菌提供受保护的环境和营养的益处。
其他微生物，例如可存在于活植物的组织中的细菌，在这种情况下也是相对未开发的。植物传播的细菌提供类似益处。
臂形草属(Brachiaria)-尾稃草属(Urochloa)物种复合体是禾本科(Poaceae)的一个组成部分，其中代表物分布在整个热带地区，特别是非洲。基于内部转录间隔区(ITS)核核糖体DNA序列数据的遗传多样性分析表明尾稃草属和臂形草属之间具有强的亲和力，这支持了证明这些禾本科属之间的连续过渡的形态学和解剖学研究。一些臂形草属-尾稃草属种为在经济学上具有重要意义的热带牧草，其已被出售为商业栽培种并且包括珊状臂形草(B.brizantha)、俯仰臂形草(B.decumbens)、湿生臂形草(B.humidicola)和刚果臂形草(B.ruziziensis)，以及相应的种间和种内杂种。
WO2012/174585中讨论了鉴定和表征新的内生菌的方法及其在臂形草属-尾稃草属植物改良方案中的应用，其全部公开内容均纳入本文中。从臂形草属-尾稃草属种中分离出内生真菌菌株。这些臂形草属真菌内生菌具有遗传多样性。这些内生菌中的一些表现出广谱抗真菌活性，并且可以在保护臂形草属-尾稃草属免受引起叶斑病的真菌病原体(如内脐蠕孢属(Drechslera spp.))的侵袭中发挥作用。
仍然普遍缺乏臂形草属-尾稃草属种复合体的真菌内生菌的信息和知识，以及鉴定和表征新的内生菌的方法及其在臂形草属-尾稃草属植物改良方案中的应用。
还普遍缺乏臂形草属-尾稃草属种复合体的细菌内生菌的信息和知识，以及鉴定和表征新的细菌生物体的方法及其在臂形草属-尾稃草属植物改良方案中的应用。
此外，尽管被广泛地用于南美洲、亚洲和澳大利亚的热带地区的牧场型农业，但是臂形草属-尾稃草属具有许多缺点，所述缺点限制了其用途和遗传增强。
近年来，包括臂形草属-尾稃草属在内的牧草也被认为牵涉到氮污染。现代农业生产的主要问题是高的氮(N)污染水平和低的氮利用效率。反硝化引起的N损失导致环境污染以及土壤N和施用N(作为肥料)的低效使用。
硝化作用主要由两组化学无机营养细菌群(亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.)和硝化杆菌属(Nitrobacter spp))——土壤微生物种群的普遍存在的组成部分——进行。例如，硝化土壤细菌如亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas spp)将铵(NH4 +)转化成硝酸盐(NO3 -)。硝酸盐还可以转化为一氧化二氮(N2O)气体。抑制硝化作用可将N保持在土壤中更长时间并提高氮使用效率(NUE)。
已经开发了使用欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)重组菌株的生物发光测定法来检测从植物根部释放的硝化抑制剂，从而使得可以确定和比较不同作物和牧草的生物硝化抑制(BNI)能力(Subbarao et al.，2006)。
先前已经提出了释放抑制土壤硝化的抑制性化合物的植物的概念。一些研究人员已经观察到某些热带草原的土壤和森林土壤的硝化速率较慢。BNI是某些植物物种从其根部释放有机化合物的能力，所述有机化合物对土壤硝化细菌具有靶向抑制作用(Subbaraoet al.，20062009)。
臂形草内酯(brachialactone)是从湿生臂形草根部释放的主要硝化抑制剂(Subbarao et al.，2009)。臂形草内酯属于被称为富司烷(Fusicoccane)的二萜类。从各种植物、真菌和细菌中，已经鉴定和分离出富司烷。臂形草内酯也已显示出具有对抗亚硝化单胞菌属的杀生物活性(Subbarao et al.，2009)。然后N可被植物利用，从而提高牧草性能。文献表明，该化合物是由植物响应于根环境中铵而产生的(Subbarao et al.，2009)。
本发明的目的是克服或至少减轻与现有技术相关的一个或多个困难或不足。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种分离、选择和/或表征内生菌菌株的方法，所述方法包括：
提供来自臂形草属-尾稃草属种复合体植物物种中的植物材料的样品；
对所述样品进行宏基因组分析；
鉴定每个臂形草属-尾稃草属植物物种中的细菌和/或真菌操作分类单位(operational taxonomic unit)(OTU)；
比较每个样品物种中存在的OTU以鉴定核心、增补和/或独特微生物组；以及
选择代表所期望的核心、增补或独特微生物组的内生菌菌株。
内生菌菌株意指与植物(优选臂形草属-尾稃草属种复合体的植物)密切相关的细菌或真菌菌株。在本文中，“与……相关”意指细菌或真菌存活在植物上、植物中或其附近。例如，它可以是内生的，例如存活在植物的内部组织内，或附生的，例如在植物外部生长。
用于制备样品的植物材料选自臂形草属-尾稃草属种复合体的植物。更具体而言，所述臂形草属-尾稃草属种复合体的植物选自珊状臂形草(Brachiaria brizantha)、俯仰臂形草(Brachiaria decumbens)、湿生臂形草(Brachiaria humidicola)、细弱臂形草(Brachiaria stolonifera)、刚果臂形草(Brachiaria ruziziensis)、珊状尾稃草(Urochloa brizantha)、俯仰尾稃草(Urochloa decumbens)、湿生尾稃草(Urochloahumidicola)、莫桑比克尾稃草(Urochloa mosambicensis)、马氏臂形草(Brachiariamarlothii)、Brachiaria nigropedata、网脉尾稃草(Urochloa dictyoneura)、毛柄尾稃草(Urochloa oligotricha)、类黍尾稃草(Urochloa panicoides)、宽花臂形草(Brachiariaobtusiflora)、Brachiaria serrifolia、背圆尾稃草(Urochloa advena)、直立尾稃草(Urochloa arrecta)、短尾尾稃草(Urochloa brachyura)、类杜茎尾稃草(Urochloaeminii)、毛尾稃草(Urochloa mollis)、黄白尾稃草(Urochloa xantholeuca)、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、车前叶臂形草(Urochloa plantaginea)、厚背尾稃草(Urochloaplatynota)、黄白尾稃草、丝毛臂形草(Brachiaria holosericea)、匍匐臂形草(Brachiaria reptans)、锐头臂形草(Brachiaria milliformis)和四生臂形草(Brachiaria distachya)，以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种。
在一个特别优选的实施方案中，臂形草属-尾稃草属复合体的植物选自珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、刚果臂形草和莫桑比克尾稃草。
优选地，植物材料样品选自叶、茎、根和种子材料。甚至更优选地，提供叶、茎和根类型的样品。或者，提供种子样品。在另一个优选的实施方案中，提供叶、茎、根和种子材料样品。
如本文所使用的“对所述样品进行宏基因组分析”意指由植物材料产生宏基因组序列数据。更具体而言，分析从植物样品中回收的遗传物质以产生细菌和/或真菌序列数据。
术语“回收遗传物质”包括从植物材料样品中提取遗传物质，包括DNA。
从植物样品中回收的遗传物质可以富含与植物密切相关的内生菌株的DNA(如细菌和/或真菌DNA)，其作为由植物材料样品回收遗传物质的过程的一部分。
因此，在一个优选的实施方案中，提供来自臂形草属-尾稃草属种复合体的植物物种中的植物材料样品的步骤包括以下步骤：
研磨植物材料；
用醇洗涤研磨的植物材料；以及
从醇洗涤物中提取核酸。
在本发明的这个方面中，优选地，植物材料为植物种子。优选地，植物材料进行了粗磨。优选地，所述醇为乙醇，更优选100％乙醇。优选地，将研磨的植物材料用醇洗涤多次，例如两次。优选地，所述核酸为DNA。
申请人出乎意料地发现可以通过粗磨植物组织(例如种子)，然后在醇(优选乙醇)中洗涤而减少植物核酸(例如植物种子核酸)的量和/或富集内生菌株的核酸。虽然申请人不希望受缚于理论，但是仍然认为醇的作用是保存植物材料(特别是种子)的微生物组分。在从醇(例如乙醇)中提取核酸(例如DNA)时，洗涤减少了宿主植物核酸的量并富集了微生物的核酸。这克服或至少减轻一种或多种现有技术方法的问题，包括为捕获核酸中的微生物组分或用途差异而产生大量序列读段的那些方法，例如为区分宿主和微生物核酸而产生DNA甲基化密度的方法。
在一个优选的实施方案中，用于剖析细菌微生物组和/或真菌微生物组的通用聚合酶链反应(PCR)引物可用于产生序列数据。例如，针对16S rDNA基因(更具体而言16SrDNA基因的V4区)的引物可以用于剖析细菌微生物组。例如，针对rDNA基因的内部转录间隔(ITS)区(更具体而言rDNA基因的ITS2区)的引物可用于剖析真菌微生物组。
在一个实施方案中，使用针对16S rDNA基因的V4区的通用引物产生细菌序列数据，使用针对rDNA基因的ITS2区的通用引物产生真菌序列数据。
可以汇编(assemble)宏基因组序列数据以创建细菌和/或真菌的操作分类单位(OTU)。优选地，可以对宏基因组序列数据进行质量修整(quality trimmed)，然后使用用于序列的配对末端汇编程序(如PANDAseq)进行配对，以创建细菌和/或真菌OTU。
可将OTU与细菌数据库(如GreenGenes细菌数据库)和/或真菌数据库(如UNITE真菌数据库)进行比对以指定分类。
对于每个样品，可计算与OTU相关的序列的数量。
通过比较每个样品物种中存在的OTU，可以鉴定核心、增补和独特微生物组。“微生物组”意指细菌和/或真菌的集体基因组。“核心微生物组”意指存在于全部或基本上全部的所测试的臂形草属-尾稃草属种中的OTU。“增补微生物组”意指存在于所测试的臂形草属-尾稃草属种的亚类中的OTU。“独特微生物组”意指与特定臂形草属-尾稃草属种相关的OTU。
然后可以选择具有期望的核心、增补或独特微生物组的内生菌。例如，可以选择具有宽的宿主范围的内生菌作为用于将性状递送到臂形草属-尾稃草属种复合体植物中的候选物。例如，可以选择具有窄的或特定宿主范围的内生菌作为用于特定的目的性状的候选物，例如用于产生提供有益特性的化合物的候选物，所述有益特性为例如在与所述内生菌相关的植物中提高的对水和/或养分胁迫的耐受性或提高的对害虫和/或病害的抗性。在一个优选的实施方案中，所述有益特性包括杀虫或驱虫活性。在另一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括抗真菌活性。在一个特别优选的实施方案中，所述化合物可以是抑制性化合物，如硝化抑制剂，例如富司烷，如臂形草内酯。
在本发明的第二方面，提供选自如本文所述的肉座菌属的种(Hypocrea sp.)/支顶孢属的种(Acremonium sp.)、支顶孢属的种、芦竹小球壳孢(Microsphaeropsisarundis)、和帚枝霉属的种(Sarocladium sp.)/支顶孢属的种的基本上纯化或分离的内生菌。优选地，通过如上所述的方法分离、选择和/或表征所述内生菌。
代表性样品，即肉座菌属的种/支顶孢属的种2.15.A.2、支顶孢属的种2.3.C.1、芦竹小球壳孢2.10.D.1、帚枝霉属的种/支顶孢属的种2.12.B.1、帚枝霉属的种/支顶孢属的种2.10.C.2、和帚枝霉属的种/支顶孢属的种2.11.B.1于2015年9月22日保存在国家度量学会(The National Measurement Institute)，登记号分别为V15/028236、V15/028237、V15/028238、V15/028239、V15/028240、V15/028241和V15/028242。
“基本上纯化”意指内生菌不含其他生物体。因此，该术语包括例如无菌培养物中的内生菌。优选地，内生菌为至少约90％纯，更优选至少约95％纯，甚至更优选至少约98％纯，甚至更优选至少约99％纯。优选地，所述内生菌在无菌培养物中。
术语“分离”意指将内生菌从其原始环境(例如，如果其天然存在，则为自然环境)中移出。例如，存在于活的植物中的天然存在的内生菌是未被分离的，但是与天然系统中的一些或全部共存材料分开的相同内生菌是分离的。
在其自然环境中，内生菌可以在植物内互惠生存(mutualistically)。或者，内生菌可以是附生菌，即附着于植物或在植物上生长。内生菌可以是真菌内生菌或细菌内生菌。
本发明的内生菌在其天然环境中可以与臂形草属-尾稃草属种复合体的植物相关。更具体而言，臂形草属-尾稃草属种复合体的植物选自珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草、马氏臂形草、Brachiaria nigropedata、网脉尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、宽花臂形草、Brachiaria serrifolia、背圆尾稃草、直立尾稃草、短尾尾稃草、类杜茎尾稃草、毛尾稃草、黄白尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、车前叶臂形草、厚背尾稃草、黄白尾稃草、丝毛臂形草、匍匐臂形草、锐头臂形草和四生臂形草，以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种。
在一个特别优选的实施方案中，臂形草属-尾稃草属复合体的植物选自珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、刚果臂形草和莫桑比克尾稃草。
在本文中，“与...相关”意指内生菌存活于植物上、植物中或植物附近。例如，它可以是内生的，例如存活在植物的内部组织内，或附生的，例如在植物外部生长。
真菌可以是使用有机碳进行生长的异养生物，更具体而言是通过消耗腐质而获得养分的腐食性生物(saprotroph)。
另一方面，本发明提供用如上所述的内生菌接种的植物，所述植物包括用所述内生菌稳定侵染的不含内生菌的宿主植物。优选地，所述植物为与内生菌并非天然相关的植物。
在一个优选的实施方案中，相对于未接种的对照植物，与内生菌相关的植物具有提高的对害虫和/或病害的抗性。优选地，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括杀虫或驱虫活性。在另一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括抗真菌活性。
在一个优选的实施方案中，内生菌或与内生菌相关的植物可以产生一种或多种化合物，所述化合物提供有益特性，如在与真菌相关的植物中的提高的对水和/或养分胁迫的耐受性或提高的对害虫和/或病害的抗性。在一个优选的实施方案中，所述有益特性包括杀虫或驱虫活性。在另一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括抗真菌活性。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌或与内生菌相关的植物可以产生抑制性化合物，如硝化抑制剂，例如富司烷，如臂形草内酯。
在一个优选的实施方案中，所述宿主植物可以被接种多于一种本发明的内生菌菌株。
优选地，所述植物为农业植物，如禾本科物种，优选牧草、草皮草或生物能源草，或谷物作物草或工业作物草。
牧草、草皮草或生物能源草可以是属于臂形草属-尾稃草属种复合体的那些(短叶黍(panic grass))，包括珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、网脉臂形草(B.dictyoneura)、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种；以及属于黑麦草属(Lolium)和羊茅属(Festuca)的那些，包括黑麦草(L.perenne)(多年生黑麦草)、高羊茅(L.arundinaceum)(高羊茅)和多花黑麦草(L.multiflorum)(意大利黑麦草)。
谷物作物草或工业作物草可以是属于小麦属(Triticum)的那些，包括小麦(T.aestivum)(小麦)；属于大麦属(Hordeum)的那些，包括大麦(H.vulgare)(大麦)；属于玉蜀黍属(Zea)的那些，包括玉米(Z.mays)(玉蜀黍或玉米)；属于稻属(Oryza)的那些，包括稻(O.sativa)(稻)；属于甘蔗属(Saccharum)的那些，包括甘蔗(S.officinarum)(甘蔗)；属于高粱属(Sorghum)的那些，包括高粱(S.bicolor)(高粱)；属于黍属(Panicum)的那些，包括柳枝稷(P.virgatum)(柳枝稷)；以及属于芒属(Miscanthus)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、画眉草属(Eragrostis)和剪股颖属(Agrostis)的那些。
优选地，所述植物通过选自以下的方法被内生菌侵染：接种、育种、杂交(crossing)、杂交(hybridization)、转导、转染、转化和/或基因靶向；以及它们的组合。
内生菌侵染的植物可以通过已知技术进行培养。本领域技术人员可以根据待培养的植物容易地确定合适的培养条件。
另一方面，本发明提供植物、植物种子或其他植物部分，其源自本发明的植物并用本发明的内生菌稳定侵染。优选地，相对于未接种的对照植物、植物种子或其他植物部分，与内生菌相关的植物、植物种子或其他植物部分具有提高的对害虫和/或病害的抗性。在一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括杀虫或驱虫活性。在另一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括抗真菌活性。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌或与内生菌相关的植物可以产生抑制性化合物，如硝化抑制剂，例如富司烷，如臂形草内酯。
优选地，植物细胞、植物、植物种子或其他植物部分来自禾本科，更优选牧草、草皮草、生物能源草、谷物作物草或工业作物草。
牧草、草皮草或生物能源草可以是属于臂形草属-尾稃草属种复合体的那些(短叶黍(panic grass))，包括珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、网脉臂形草、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种，如，刚果臂形草×珊状臂形草、刚果臂形草×俯仰臂形草、[刚果臂形草×俯仰臂形草]×珊状臂形草、[刚果臂形草×珊状臂形草]×俯仰臂形草之间的种间杂种；以及属于黑麦草属(Lolium)和羊茅属(Festuca)的那些，包括黑麦草(L.perenne)(多年生黑麦草)和高羊茅(L.arundinaceum)(高羊茅)和多花黑麦草(L.multiflorum)(意大利黑麦草)。
谷物作物草或工业作物草可以是属于小麦属(Triticum)的那些，包括小麦(T.aestivum)(小麦)；属于大麦属(Hordeum)的那些，包括大麦(H.vulgare)(大麦)；属于玉蜀黍属(Zea)的那些，包括玉米(Z.mays)(玉蜀黍或玉米)；属于稻属(Oryza)的那些，包括稻(O.sativa)(稻)；属于甘蔗属(Saccharum)的那些，包括甘蔗(S.officinarum)(甘蔗)；属于高粱属(Sorghum)的那些，包括高粱(S.bicolor)(高粱)；属于黍属(Panicum)的那些，包括柳枝稷(P.virgatum)(柳枝稷)；以及属于芒属(Miscanthus)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、画眉草属(Eragrostis)和剪股颖属(Agrostis)的那些。
“植物细胞”意指以半透膜为界并含有质体的任何自增殖细胞。如果需要进一步增殖，这种细胞还需要细胞壁。如本文所使用的，植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
另一方面，本发明提供如上所述的内生菌用于产生用所述内生菌稳定侵染的植物的用途。优选地，相对于未接种的对照植物，与内生菌相关的植物具有提高的对害虫和/或病害的抗性。在一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括杀虫或驱虫活性。在另一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括抗真菌活性。
在一个优选的实施方案中，内生菌或与内生菌相关的植物可以产生一种或多种化合物，所述化合物提供有益特性，如在与真菌相关的植物中的提高的对水和/或养分胁迫的耐受性或提高的对害虫和/或病害的抗性。在一个优选的实施方案中，所述有益特性包括杀虫或驱虫活性。在另一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害抗性包括抗真菌活性。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌或与内生菌相关的植物可以产生抑制性化合物，如硝化抑制剂，例如富司烷，如臂形草内酯。
在另一个优选的实施方案中，与内生菌相关的植物为如上所述的牧草、草皮草、生物能源草、谷物作物草或工业作物草。
在本发明的另一方面，提供一种在植物中增加对抗害虫和/或病害的抗性的方法，所述方法包括用如上所述的内生菌接种所述植物。优选地，相对于未接种的对照植物，与内生菌相关的植物具有提高的对害虫和/或病害的抗性。在一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括杀虫或驱虫活性。在另一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括抗真菌活性。在又一个优选的实施方案中，所述与内生菌相关的植物为如上所述的牧草、草皮草、生物能源草、谷物作物草或工业作物草。
另一方面，本发明提供一种产生富司烷的方法，所述方法包括：
从臂形草属-尾稃草属种复合体的植物中分离内生菌；
使所述内生菌在合适的培养基中生长；以及
从内生菌细胞中、从培养基中或从与培养基或内生菌相关的空气空间(airspace)中回收一种或多种有机化合物，包括富司烷。
优选地，所述内生菌为如上所述的内生菌。
优选地，富司烷为式I的化合物：
也称为臂形草内酯，或其衍生物、异构体和/或盐。
优选地，臂形草属-尾稃草属种复合体的植物选自珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草、马氏臂形草、Brachiaria nigropedata、网脉尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、宽花臂形草、Brachiaria serrifolia、背圆尾稃草、直立尾稃草、短尾尾稃草、类杜茎尾稃草、毛尾稃草、黄白尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、车前叶臂形草、厚背尾稃草、黄白尾稃草、丝毛臂形草、匍匐臂形草、锐头臂形草和四生臂形草，以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种。
优选地，在包含碳水化合物来源的培养基中培养内生菌。
碳水化合物的来源可以是淀粉/糖基琼脂或肉汤，如马铃薯葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖肉汤或半马铃薯葡萄糖琼脂；或谷物基琼脂或肉汤，如燕麦粉琼脂或燕麦粉肉汤。碳水化合物的其他来源可以包括内生菌琼脂、含20％蔗糖的Murashige和Skoog、半V8汁/半PDA、水琼脂和酵母麦芽提取物琼脂。
在一个优选的实施方案中，内生菌可以在包含马铃薯葡萄糖或燕麦粉的培养基中培养，例如马铃薯葡萄糖琼脂、半马铃薯葡萄糖琼脂、燕麦粉琼脂、马铃薯葡萄糖肉汤或燕麦粉肉汤。最优选地，真菌可以在包含燕麦粉的培养基中培养。
内生菌可以在需氧或厌氧条件下培养。
内生菌可以培养约1至约100天，更优选约1至约50天，更优选约1至约10天。
在一个优选的实施方案中，内生菌可以在生物反应器中培养。“生物反应器”意指支持生物活性环境的装置或系统，例如在其中进行涉及本发明的真菌和/或其产物的化学过程的容器。所述化学过程可以是需氧或厌氧的。生物反应器可以具有尺寸为数毫升至数立方米的体积，例如约50毫升至约50,000升。生物反应器可以通过分批培养、分批补料培养、灌注培养或连续培养进行操作，例如在搅拌罐式生物反应器中连续培养。在生物反应器中培养的内生菌可以被悬浮或固定。
所述方法包括从内生菌细胞中、从培养基中或从与培养基或内生菌相关的空气空间中回收一种或多种有机化合物(包括富司烷)的步骤。
例如，有机化合物可从细胞内组织中、从内生菌可向其中分泌液体的培养基中或从内生菌可向其中分泌蒸气的空气空间中回收。
蒸气可直接由内生菌产生或由在蒸气和液相之间转换的分泌液体产生。
回收有机化合物的步骤优选地是通过从培养基中分离细胞或捕获与培养基或内生菌相关的蒸气来进行。
然后优选地，通过选自以下的方法分离或纯化有机化合物：气相色谱法、液相色谱法、分馏、低温蒸馏、膜分离和吸收色谱法，如压力、真空或变温吸附。
“有机化合物”意指化学化合物，其分子含有元素碳。
在一个优选的实施方案中，有机化合物可以是烃，如挥发性烃或液态烃。最优选地，有机化合物可以是挥发性烃。
“烃”意指包含元素碳和氢的有机化合物。
在本文中，术语“挥发性”意指可以在标准实验室温度和压力下蒸发或升华的有机化合物。挥发性有机化合物包括具有高蒸气压、低沸点和/或低分子量的那些。
在本发明的另一方面，提供一种在臂形草属-尾稃草属种复合体的植物中产生富司烷的方法，所述方法包括：
提供臂形草属-尾稃草属种复合体的植物；和
内生菌，优选如上所述的内生菌；
用所述内生菌侵染所述植物以形成共生体；
在合适的培养基中培养共生体，使得产生富司烷。
优选地，臂形草属-尾稃草属种复合体的植物选自珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草、马氏臂形草、Brachiaria nigropedata、网脉尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、宽花臂形草、Brachiaria serrifolia、背圆尾稃草、直立尾稃草、短尾尾稃草、类杜茎尾稃草、毛尾稃草、黄白尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、车前叶臂形草、厚背尾稃草、黄白尾稃草、丝毛臂形草、匍匐臂形草、锐头臂形草和四生臂形草，以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种。
优选地，植物是通过选自以下的方法被内生菌侵染：接种、育种、杂交(crossing)、杂交(hybridization)、转导、转染、转化和/或基因靶向；以及它们的组合。
内生菌侵染的植物可以通过已知技术进行培养。本领域技术人员可以根据待培养的植物容易地确定合适的培养条件。
另一方面，本发明提供植物、植物种子或其他植物部分，其源自通过本发明的方法产生并用本发明的内生菌稳定侵染的植物。优选地，相对于未接种的对照植物、植物种子或其他植物部分，与内生菌相关的植物、植物种子或其他植物部分具有提高的对害虫和/或病害的抗性。在一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括杀虫或驱虫活性。在另一个优选的实施方案中，所述提高的对害虫和/或病害的抗性包括抗真菌活性。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌或与内生菌相关的植物可以产生抑制性化合物，如硝化抑制剂，例如富司烷，如臂形草内酯。
优选地，植物细胞、植物、植物种子或其他植物部分选自禾本科，更优选牧草、草皮草、生物能源草、谷物作物草或工业作物草。
牧草、草皮草或生物能源草可以是属于臂形草属-尾稃草属种复合体的那些(短叶黍(panic grass))，包括珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、网脉臂形草、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种，如刚果臂形草×珊状臂形草、刚果臂形草×俯仰臂形草、[刚果臂形草×俯仰臂形草]×珊状臂形草、[刚果臂形草×珊状臂形草]×俯仰臂形草之间的种间杂种；以及属于黑麦草属(Lolium)和羊茅属(Festuca)的那些，包括黑麦草(L.perenne)(多年生黑麦草)和高羊茅(L.arundinaceum)(高羊茅)和多花黑麦草(L.multiflorum)(意大利黑麦草)。
谷物作物草或工业作物草可以是属于小麦属(Triticum)的那些，包括小麦(T.aestivum)(小麦)；属于大麦属(Hordeum)的那些，包括大麦(H.vulgare)(大麦)；属于玉蜀黍属(Zea)的那些，包括玉米(Z.mays)(玉蜀黍或玉米)；属于稻属(Oryza)的那些，包括稻(O.sativa)(稻)；属于甘蔗属(Saccharum)的那些，包括甘蔗(S.officinarum)(甘蔗)；属于高粱属(Sorghum)的那些，包括高粱(S.bicolor)(高粱)；属于黍属(Panicum)的那些，包括柳枝稷(P.virgatum)(柳枝稷)；以及属于芒属(Miscanthus)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、画眉草属(Eragrostis)和剪股颖属(Agrostis)的那些。
另一方面，本发明提供一种用一种或多种内生菌接种臂形草属-尾稃草属种复合体的植物的方法，所述方法包括
提供臂形草属-尾稃草属种复合体的植物的灭菌的种子；
使种子在无菌条件下发芽以产生基本上不含微生物生物体的宿主植物；
用一种或多种内生菌接种宿主植物。
虽然申请人不希望受到理论的限制，但认为在无菌条件下进行本发明的方法能够确保将内生菌接种到基本上不含微生物生物体的宿主植物中，从而有助于高频率的成功接种。此外，认为在接种之前使用不同的培养基以建立宿主植物，如根生长促进培养基，也有助于高的接种频率。使用无菌环境还可以分析微生物组而不受污染。
例如，接种频率可以在约25％与约100％之间，更优选在约50％与约100％之间，甚至更优选在约75％与约100％之间。接种频率可高于传统方法。
优选地，臂形草属-尾稃草属种复合体的植物为如上所述的物种的植物。
优选地，所述一种或多种内生菌选自如上所述的内生菌。一种或多种内生菌可以是细菌内生菌或真菌内生菌或其混合物。在一个优选的实施方案中，使种子在无菌条件下发芽以产生宿主植物的步骤可以包括在芽增殖培养基(如M3B)和根繁殖培养基(如MS+NAA)上培养发芽的种子。优选地，可以在芽增殖培养基上培养发芽的种子，将所得芽分成单个分蘖，然后将它们转移到根繁殖培养基。可将单个分蘖在根繁殖培养基上培养约1至约6周，更优选约2至约3周，以促进根生长。可再次将所得到的小植株分成单个分蘖以进行内生菌接种。
在一个优选的实施方案中，用一种或多种内生菌接种宿主植物的步骤可以包括除去外鞘以露出芽头(shoot initial)，在芽分生组织中产生创伤并接种到创伤中。
在一个优选的实施方案中，所述方法可以包括另一个步骤：在接种后使小植株保持在无菌培养基上，优选地持续约1至约6周、更优选约2至约3周。
在一个优选的实施方案中，所述方法可以包括又一步骤：将由此产生的接种植物转移到土壤或类似的培养基中以进一步生长，例如在温室条件下。
现在将参照所附实施例和附图对本发明进行更充分地描述。然而，应当理解的是，下面的描述仅仅是说明性的，不应被认为是以任何方式对上述本发明的一般性进行限制。
附图说明
图1示出基于内部转录间隔区(ITS)和18S编码区的rDNA序列分析，内生菌分离株在臂形草属种中的发生率。臂形草属内生菌分离株具有遗传多样性，代表至少10个不同的分类组。
图2示出通过对源自臂形草属-尾稃草属种质的真菌内生菌分离株的ITS区域进行邻位相连分析而产生的自举一致树(bootstrap consensus tree)(左手侧)，以及基于ITS序列所进行的在5种臂形草属-尾稃草属种的微生物组中，对于经选择的分离且可培养的真菌内生菌菌株存在与否的鉴定(右手侧)(Bb-珊状臂形草；Bh-湿生臂形草；Bd-俯仰臂形草；Um-莫桑比克尾稃草(U.mosambicensis)；Br-刚果臂形草)。
图2A是图2的自举一致树的放大图。
图3示出鉴定臂形草内酯的LC(ESI)-MS质谱图，在提取的离子色谱图中于RT下：8.91-8.98分钟所示。
图4示出在图3的LC(ESI)-MS质谱图中室温下8.93分钟时的MS断裂臂形草内酯片段(333.2059、315.1964、271.2068)。
图5示出臂形草内酯的结构和对应于图4中断裂的片段的结构。
图6示出优化的针对臂形草属-尾稃草属的内生菌接种方法中的连续阶段。A.在无菌条件下，在芽增殖培养基(M3B)上培养不含微生物的供体小植株；B.将供体芽分成单个分蘖并转移到根繁殖培养基(MS+NAA)；C.单个分蘖生长2-3周以促进根生长，然后将小植株分成单个分蘖，除去外鞘以露出芽头，转移到水琼脂上，并接种到沿芽分生组织制备小切口中；D.在1/2MS培养基上保持2周的接种的小植株；E.被转移至土壤后，并在温室条件下生长8周后的小植株。
图7示出了描述剖析种子相关的细菌和真菌微生物组的方法的流程图。所附照片示出从一个种质的50g种子中富集细菌和真菌DNA的方法中的每一个阶段。A.在研磨之前用空气干燥种子；B.收集100％乙醇洗涤物。上清液含有种子相关的内生微生物组；C.乙醇蒸发过程中的小瓶；D.对于从10份种质(第1至10列)的每一个中所提取的DNA进行分析，以确定真菌DNA的存在。E.分析提取的DNA以确定细菌DNA的存在。
具体实施方式
实施例1-臂形草属-尾稃草属种的内生微生物分布
使用宏基因组学剖析五种臂形草属-尾稃草属种的内生微生物组。物种包括珊状臂形草、湿生臂形草、刚果臂形草、俯仰臂形草和莫桑比克尾稃草。每个物种共剖析三株植物。从每株植物剖析三个器官(根、茎和叶)。每株植物每个器官共制备两个重复样品。植物材料(约100mg)通过以下方式进行表面灭菌：在70％乙醇中浸泡30秒，随后用4.2％NaOCl(漂白剂)浸泡2分钟，然后在无菌MilliQ水中漂洗三至五次以确保完全除去灭菌剂。将样品在-58℃和0.014mBar下冷冻干燥48小时。根据制造商的说明书使用Qiagen DNeasy植物小型试剂盒提取DNA。在宏基因组学分析中，使用用于剖析细菌微生物组(16S rDNA基因的V4区，约350个碱基对)的通用PCR引物515f和806r和用于真菌微生物组(rDNA基因的ITS2区，约400个碱基对)的58A2F和ITS4，以及相关的Illumina接头(adapter)来评估内生细菌和真菌。根据相应的Illumina用户指南准备和加载配对末端文库。将宏基因组序列数据进行质量修整(quality trimmed)并使用PANDSEQ配对以创建操作分类单位(OTU)，将其与GreenGenes细菌数据库和UNITE真菌数据库进行比对以指定分类(OTU：97％序列同一性，e-值<10e-110)。计算所有样本的与OTU相关的序列数量，并将其归一化，以百分比表示。
臂形草属-尾稃草属的总微生物多样性
在所有臂形草属-尾稃草属种中共鉴定出361个细菌操作分类单位(OTU)，包括25个细菌门，56个纲，121个科和170个属(包括候选分类组)(表1)。该分析鉴定了核心微生物组(存在于所有臂形草属-尾稃草属种中的OTU)和独特微生物组(与特定臂形草属-尾稃草属种相关的OTU)，以及仅与已知的产生臂形草内酯的臂形草属-尾稃草属种(湿生臂形草和刚果臂形草)相关的细菌OTU(表1)。该分析还为从这些臂形草属-尾稃草属种中分离的内生菌的存在提供交叉验证。
另外，鉴定了84个真菌OTU，包括5个门，14个纲，32个科和44个属(表2)。该分析鉴定了核心微生物组(存在于所有臂形草属-尾稃草属种中发现的OTU)和独特微生物组(与特定臂形草属-尾稃草属种相关的OTU)，以及仅与已知的产生臂形草内酯的臂形草属-尾稃草属种(湿生臂形草和刚果臂形草)相关的真菌OTU(表2)。该分析还为从这些臂形草属-尾稃草属种中分离的内生菌的存在提供交叉验证。
表1：存在于五种臂形草属-尾稃草属种的叶、根和茎内的内生细菌OTU(361个OTU)，包括识别核心微生物组、独特微生物组和仅与已知的产生臂形草内酯的臂形草属-尾稃草属种(Brach-湿生臂形草和刚果臂形草)相关的细菌OTU。臂形草属-尾稃草属种中的细菌微生物多样性的实例在湿生臂形草(Bh)和俯仰臂形草(Bd)内表示。
表2：存在于五种臂形草属-尾稃草属种的叶、根和茎内的内生真菌OTU(84个OTU)，包括识别核心微生物组、独特微生物组和仅与已知的产生臂形草内酯的臂形草属-尾稃草属种(Brach-湿生臂形草和刚果臂形草)相关的真菌OTU。臂形草属种中的真菌微生物多样性的实例在湿生臂形草(Bh)和俯仰臂形草(Bd)内表示。
臂形草属-尾稃草属的植物器官间的微生物多样性
臂形草属-尾稃草属种的根中的微生物多样性最高，占359种细菌物种(99.4％)和83种真菌物种(98.8％)(表1和表2)。茎和叶中的微生物多样性显著低于根中的，占5-20个细菌或真菌OTU。
臂形草属-尾稃草属种的微生物多样性
核心微生物组由130个细菌OTU和14个真菌OTU组成(表1、2和3)。核心细菌微生物组含有不同的分类群，而核心真菌微生物组主要含有粪壳菌纲(Sordariomycetes)物种(8)。与核心微生物组相关的OTU也是所有臂形草属-尾稃草属种中最丰富的OTU。对于臂形草属-尾稃草属种独特的OUT的数量对于细菌为5至27个，对于真菌为2至12个，并且主要以低丰度存在于其各自物种中。
表3：与臂形草属-尾稃草属种相关的核心和独特微生物组
与湿生臂形草和俯仰臂形草相关的微生物物种
与湿生臂形草相关的细菌和真菌OTU的数量分别为189和48个。湿生臂形草具有最高的真菌多样性，比任何其他臂形草属-尾稃草属种高约15％。相反，湿生臂形草具有第二低的细菌多样性，比俯仰臂形草(最高的细菌多样性)低约31％。与所有其他臂形草属-尾稃草属种一样，在根中观察到最高的微生物多样性，而茎和叶中的微生物多样性非常低。
与俯仰臂形草相关的细菌和真菌OTU的数量分别为276和37个。俯仰臂形草具有最高的细菌多样性，比任何其他臂形草属-尾稃草属种高约3％至33％。相反，俯仰臂形草具有第二低的真菌多样性，比湿生臂形草低约23％。与所有其他臂形草属-尾稃草属种一样，在根中观察到最高的微生物多样性，而茎和叶中的微生物多样性非常低。
与湿生臂形草和俯仰臂形草均相关的前五种真菌和细菌OTU显示出与来自NCBI的分离株的序列同源性，所述分离株已经主要被鉴定为内生菌，包括其他禾本科物种(例如稻(Oryzae sativa)、小麦(Triticum aestivum))的内生菌、菌根(例如球囊霉属(Glomus)物种)或根瘤菌(根瘤菌目(Rhizobiales)物种)。还存在真菌病原体层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)，它是一系列农业作物物种的种传病原体(表4和5)。
表4：与臂形草属-尾稃草属种相关的最丰富的真菌OTU的实例以及它们对应的NCBI最佳Blastn匹配(top Blastn hit)(登记号、e-值、分离来源和内生来源-E+/-)。
表5：与臂形草属种相关的最丰富的细菌OTU的实例以及它们对应的NCBI最佳Blastn匹配(登记号、e-值、分离来源和内生来源-E+/-)。
与产生臂形草内酯的臂形草属-尾稃草属种相关的微生物多样性
在发现产生臂形草内酯的臂形草属-尾稃草属种(湿生臂形草和/或刚果臂形草)中仅鉴定出总共45个细菌和29个真菌OTU(表1和2)。与产生臂形草内酯的臂形草属-尾稃草属种相关的OTU代表了一系列不同的细菌和真菌分类群。
实施例2-臂形草属微生物组的宏基因组分析确定臂形草属-尾稃草属禾本科植物的真菌内生菌的宿主范围
在来自23个国家的281份种质(accession)的全球研究中，鉴定出总共97种源自11个臂形草属-尾稃草属种的真菌内生菌分离株。内部转录间隔区ITS序列用于进一步表征。使用引物ITS5和ITS4对包含内部转录间隔区ITS1和ITS2以及5.8S亚基的核核糖体DNA的整个区域进行PCR扩增(White et al.，1990)。使用Sanger测序技术对纯化的PCR扩增产物进行测序。然后基于ITS序列同一性将分离的传代培养的内生菌分组。基于内部转录间隔区(ITS)和18S编码区的核糖体DNA(rDNA)序列分析表明臂形草属内生菌分离株具有遗传多样性，代表至少10个不同的分类组(图1)。显示产生臂形草内酯的湿生臂形草和刚果臂形草物种表现出高水平的真菌内生菌多样性和丰度(图1)。
将序列数据用于BLASTN分析以鉴定NCBI数据库中的匹配。所发现的臂形草属内生菌在遗传上是新的。将每个分离株的ITS序列与公共可获得的数据库中的序列进行比较，未鉴定出具有>90％同一性的任何真菌菌株。系统进化分析法证实，来自不同ITS聚类的分离株属于不同的属。在数个种质中，从单一植物中分离的多种内生菌属于不同的rDNA特异性聚类，这表明同一植物中多种真菌内生菌物种的共存(表6)。
表6：从11种臂形草属-尾稃草属种中分离的真菌内生菌的汇总
宿主物种 宿主植物鉴定 内生菌分离株数量
俯仰臂形草 1.1 1
莫桑比克尾稃草 2.1 23
丝毛臂形草 2.3 1
匍匐臂形草 2.4 1
匍匐臂形草 2.4 3
锐头臂形草(B.miliiformis) 2.5 1
刚果臂形草 2.6 2
刚果臂形草 2.7 7
类黍尾稃草 2.8 3
莫桑比克尾稃草 2.9 10
毛柄尾稃草 2.11 3
湿生臂形草 2.12 3
类黍尾稃草 2.14 3
毛柄尾稃草 2.15 1
莫桑比克尾稃草 3.3 3
湿生臂形草 4.9 2
珊状臂形草 5.1 4
俯仰臂形草 7.1 1
湿生臂形草 8.1 3
湿生臂形草 9.2 3
俯仰臂形草 10.1 1
莫桑比克尾稃草 11.1 1
莫桑比克尾稃草 12.1 5
俯仰臂形草 14.1 4
湿生臂形草 15.2 3
四生臂形草 8 2
锐头臂形草 26 3
总分离株 97
将经选择分离的且可培养的真菌内生菌菌株的rDNA-ITS区序列用于鉴定它们是否存在于这5种臂形草属-尾稃草属种(Bb-珊状臂形草；Bh-湿生臂形草；Bd-俯仰臂形草；Um-莫桑比克尾稃草；Ur-U.ruziensis)的微生物组中(图2-2A)。在宏基因组学分析中共有27个分离株与OTU具有序列同源性(>10e-145)，进一步验证了它们的内生生态位。分离株与支顶孢属的种、紧密帚枝霉(Sarocladium strictum)、肉座菌属的种、芦竹小球壳孢(未培养的真菌物种)和假裸囊菌属(Pseudogymnoascus sp)具有序列同源性。观察到的ITS在整个宿主物种中存在的模式遵循ITS组相似性。例如，ITS5(例如2.15.A.2)和ITS1形成单个ITS组(组内没有亚聚类)，并且似乎普遍存在于臂形草属-尾稃草属中。相反，ITS7显示出宿主存在/不存在的模式，所述宿主存在/不存在与所鉴定的三个ITS7亚聚类[由内生菌分离株2.3.C.1(聚类1)、2.10.C.2(聚类2)、2.12.B.1和2.11.B.1(聚类3)代表]有关。ITS6组具有遗传多样性，有三个不同的聚类。内生菌分离株2.2.A.1仅在所测试的5个宿主物种之一中检测到，而2.10.D.1显示出宽的宿主范围。ITS2组内生菌表现出两种不同的宿主分布。内生菌12.1.B和9.2.B显示出宽的宿主范围，存在于所测试的5个宿主物种中的每一个中。相反，1.1.A显示出窄的宿主范围，因为它仅在所测试的5个宿主物种之一中检测到。在同一分类组的推定亚组之间的宿主定殖的变化可能是宿主-内生菌共同进化和特定化的指征。
实施例3-臂形草内酯的来源是微生物
对已保持在受控环境中的臂形草属-尾稃草属禾本科的成熟植物-内生菌联合体(associations)进行代谢特征分析。使用液相色谱-质谱法(LC-MS)，对于来自于这三个臂形草属-尾稃草属种(湿生臂形草、莫桑比克尾稃草、刚果臂形草)中的每一个物种的四株单独植物(生物学重复样品)，分析其中臂形草内酯的存在。制备冷冻干燥的假茎样品用于使用80％甲醇提取方法的LC-MS分析。在臂形草属-内生菌联合体(湿生臂形草、刚果臂形草)的根组织中鉴定出化合物臂形草内酯(图3至5；表7)。通过MS(在室温下8.93分钟、质荷比[m/z]为333.2059处提取的离子)证实了臂形草内酯的存在。在俯仰臂形草-内生菌联合体或莫桑比克尾稃草-内生菌联合体中未检测到臂形草内酯(表7)。
表7：臂形草属-尾稃草属中臂形草内酯的检测。湿生臂形草-内生菌和刚果臂形草-内生菌联合体的样品显示存在臂形草内酯。
臂形草属-尾稃草属 臂形草内酯
湿生臂形草 +
莫桑比克尾稃草(U.mosambiciensis) -
俯仰臂形草 -
刚果臂形草 +
+：检测到臂形草内酯；-：未检测到臂形草内酯
实施例4-用于将臂形草属内生菌接种到臂形草属-尾稃草属中的优化的方法
建立包含商业上相关的臂形草属-尾稃草属种质的宿主组以使得能够将遗传上新的且高度多样性的内生菌分离株接种到单个宿主基因型中。开发了一种在无菌条件下，用于将内生菌接种到不含微生物生物体的宿主植物中的优化的方法，其有利于高频率的成功接种(表8)。代表四种rDNA序列确定的进化枝的四种真菌内生菌被鉴定为用于接种到臂形草属-尾稃草属宿主组中并表征的候选物。
使灭菌的臂形草属种子在无菌条件下发芽以从将要用于接种的宿主植物中除去微生物生物体。在无菌条件下，使不含微生物的供体小植株在芽增殖培养基(M3B)上生长。将供体芽分成单个分蘖并转移至根繁殖培养基(MS+NAA)。使单个分蘖生长2-3周以促进根生长，然后再次将小植株分成单个分蘖，并除去外鞘以露出芽头。将具有完整的根的芽头转移至水琼脂以接种内生菌菌丝体。对于内生菌接种，沿芽分生组织制备小切口，并且将内生菌接种到伤口中。接种后，将小植株在1/2MS培养基上保持2周。然后将它们转移到土壤中，并使其在温室条件下生长8周，然后使用菌株特异性SSR标记物的诊断组测试内生菌的存在(图6)。
在接种后大约6个月，使用每种内生菌分离株的简单序列重复(SSR)标记物的诊断(即对于每种内生菌，在每个SSR基因座处的特定等位基因大小)组，测定每种候选物内生菌的内生菌接种频率。
对于来自每个核糖体DNA序列确定的进化枝的代表性内生菌，实现了成功的接种(表8)。观察到代表不同ITS组的内生菌分离株之间的变化。ITS5(2.15.A.2)>ITS7(2.10.C.2)>ITS2(12.1.B)>ITS1(5.1.B)。还观察到杂交物种相容性。与具有适度相容性的12.1.B(8至76％)和具有窄的宿主相容性的5.1.B(0至7％)相比，内生菌分离株2.15.A.2(58至83％)和2.10.C.2(38％至83％)表现出宽的物种相容性。正如所预期的，每种内生菌菌株对于其中最初分离出其的物种而言，显示出最高的接种频率。
表8：接种频率(％)的汇总。此处提供的数据是在接种后3至6个月所鉴定出的稳定的臂形草属-尾稃草属内生菌联合体。将臂形草属-尾稃草属内生菌的特异性SSR标记物的诊断组用于测试在植物中内生菌的存在和确认。此处显示的是经鉴定的内生菌阳性植物占收获的植物总数量的百分比。宿主植物和内生菌平均值显示于以灰色突出的列中。从其中分离出内生菌的臂形草属-尾稃草属种以淡灰色突出显示。
还观察到宿主接种能力的变化。莫桑比克尾稃草与宽范围的真菌内生菌以非常高的成功接种频率(60％)形成稳定的联合体。还值得注意的是，莫桑比克尾稃草与多种、高度多样性的真菌内生菌形成联合体(图1；表6)。从这个物种中分离出的内生菌菌株代表在臂形草属中所鉴定出的7个ITS组中的6个(图1)。湿生臂形草与宽范围的真菌内生菌以高的成功接种频率(41％)形成稳定的联合体。至于莫桑比克尾稃草，这个物种天然拥有多种内生菌的多样性，具有所鉴定出的7个ITS组中的4个(图1)。
实施例5-臂形草属-尾稃草属种子微生物组的宏基因组学分析
植物微生物组研究中的一个重大挑战是，为了分析植物微生物组的内生组分，有必要从植物组织中提取DNA。在所提取的DNA中存在的较高比例的植物DNA:微生物DNA(细菌为约20:1，真菌为约1:1)对于下游序列分析具有影响。在以前的研究中，处理这种情况的一个方法是产生大量的序列读段以实现目标数量的微生物组读段。
在该实施例中，开发了一种方法，以在从植物种子中提取DNA时富集微生物组(细菌和真菌DNA)。该方法并不限制在应用于植物种子中，而是可以应用于来自任何目的物种的任何植物组织，包括叶、茎和/或根植物材料。
与种子相关的内生微生物是值得关注的，这是因为它们可以在分子育种情况下使用，由此共同选择微生物和宿主植物中特定的目的性状。此外，在根和种子微生物组中均存在的内生微生物是值得关注的，这是因为分布于整个植物中的与种子相关的微生物可通过产生臂形草内酯而与增强的性能性状(如害虫和病害抗性或生物硝化抑制(BNI))相关联。
宿主种子定殖的变化可以是寄主-内生菌共同进化和特定化的指征
一旦分离和纯化，内生种子微生物组的各个组分可以进行基因组测序并表征以用于分子标记物开发、分类学鉴定和系统发育分析。所选择的微生物组组分生物体也可以单独地以及组合地进行表型评估，以鉴定将提高的生产性状(例如BNI)赋予一系列具有商业意义的臂形草属种的微生物。可以在宽范围的作物物种中进一步利用臂形草属微生物组的生物学特性以有益于可持续的农业和环境。
实施例6-在种子的微生物组分析中富集细菌和真菌DNA的方法
开发了一种方法来富集臂形草属种子中的微生物组(细菌和真菌DNA)组分(图7)。尽管在该实施例中用于植物种子，但该方法也可应用于来自任何目的物种的任何植物组织。根据植物组织，本领域技术人员将会理解，可以对该方法进行微小的改变以优化微生物组的富集，例如植物材料的研磨量可以变化，例如，从细磨到粗磨，这取决于植物材料的性质。
将50克来自十份选定种质(表9)中的每一份的种子在振荡下进行表面灭菌(5％[w/v]NaHCl和Tween 20)，持续30min。然后将种子样品在无菌MilliQ水中漂洗8至10次以确保已完全除去灭菌剂。在无菌条件下将种子在无菌滤纸上干燥过夜。使用genogrinder(SPEX SamplePrep 2010Geno/GrinderR，Metuchen，USA)对干燥的种子进行部分研磨。然后用无水乙醇将研磨的种子洗涤两次，持续12小时并持续振荡。洗涤后，使样品沉降，收集含有与种子相关的内生微生物组的上清液。然后将上清液在无菌条件下完全蒸发。使用Qiagen DNeasy植物微型试剂盒根据制造商的说明书从最终的粗制品(乙醇蒸发后留下的)中提取DNA。
同时，还使用Qiagen DNeasy植物微型试剂盒根据制造商的说明书从表面灭菌的种子(来自每份种质的10粒种子)中提取DNA。在宏基因组学分析中，使用用于剖析细菌微生物组(16S rDNA基因的V4区，约350个碱基对)的通用PCR引物515f(Wang&Qian，2009)和806r(McBain et al，2003)和用于剖析真菌微生物组(rDNA基因的ITS2区，约400个碱基对)的58A2F(Martin&Rygiewicz，2005)和ITS4(White et al，1990)，以及相关的Illumina接头来评估细菌和真菌。根据相应的用户指南制备核糖体RNA基因扩增子并在MiSeq(Illumina)上测序。
表9：该实施例中使用的臂形草属种。
*BNI化合物：生物硝化抑制化合物，例如臂形草内酯
实施例7-宏基因组学分析以鉴定与臂形草属禾本科植物的内生微生物组相关的种子
使用宏基因组学剖析四种选定的臂形草属-尾稃草属种的内生(细菌和真菌)性种子微生物组，其目的是鉴定与特定物种相关的微生物和/或性状相关的微生物，如害虫和病害抗性，或通过臂形草内酯的产生而具有的生物硝化抑制(BNI)。
所检验的臂形草属种包括先前记录的能够产生生物硝化抑制(BNI)化合物的三个物种——湿生臂形草、刚果臂形草、俯仰臂形草，以及不产生BNI化合物的珊状臂形草(表9)。
然后分析所述数据以鉴定与臂形草属的内生微生物组相关的种子：
●与臂形草内酯的产生相关
o特别是与湿生臂形草中的BNI性状相关
o通常与BNI性状相关(即对湿生臂形草、刚果臂形草和俯仰臂形草而言共有)
●对于湿生臂形草、刚果臂形草、俯仰臂形草或珊状臂形草而言独特的
●对所研究的所有臂形草属种而言共有的
应该理解，在不脱离本文所概述的本发明的精神的情况下，可以进行各种改变、修改和/或添加。
如本文所使用的，除上下文另有要求外，术语“包含(comprise)”和该术语的变型如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”并非意欲以任何方式限制或排除其他添加剂、组分、整数或步骤。
对本说明书中的任何现有技术的引用不视为且不应视为承认或任何形式的建议：该现有技术构成澳大利亚或任何其他地区的公知常识的一部分，或者该现有技术可合理地被本领域技术人员预期地确定、理解和/或认为是相关的。
参考文献
1.de Boer,A.H.,&de Vries-van Leeuwen,I.J.“Fusicoccanes:diterpeneswith surprising biological functions”,Trends in Plant Science,2012,17(6),360-368.
2.Subbarao,D.V.,et al.“A bioluminescence assay to detectnitrification inhibitors released from plant roots:a case study withBrachiaria humidicola”,Plant Soil,2006,288,101–112.
3.Subbarao,G.V.,et al.“Evidence for biological nitrificationinhibition in Brachiaria pastures”,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2009,106(41),17302-17307.
4.White,T.J.et al.“Amplification and direct sequencing of fungalribosomal RNA genes for phylogenetics”,In PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications,1990,第315-322页,Academic Press.
5.Martin KJ,Rygiewicz PT(2005)Fungal-specific PCR primers developedfor analysis of the ITS region of environmental DNA extracts.BMC Microbiology5:28.
6.McBain AJ,Bartolo RG,Catrenich CE,Charbonneau D,Ledder RG,RickardAH,Symmons SA,Gilbert P(2003)Microbial characterization of biofilms indomestic drains and the establishment of stable biofilm microcosms.Appliedand Environmental Microbiology 69:177-185.
7.Wang Y,Qian P-Y(2009)Conservative fragments in bacterial 16S rRNAgenes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomicstudies.PloS one 4:e7401.
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Claims (44)

1.一种分离、选择和/或表征内生菌菌株的方法，所述方法包括：
提供来自臂形草属(Brachiaria)-尾稃草属(Urochoa)种复合体的植物物种的植物材料的样品；
对所述样品进行宏基因组分析；
鉴定每个臂形草属-尾稃草属植物物种中的细菌和/或真菌的操作分类单位(OTU)；
比较每个样品物种中存在的OTU以鉴定核心、增补和/或独特微生物组；以及
选择代表所期望的核心、增补或独特微生物组的内生菌菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述臂形草属-尾稃草属种复合体的植物物种选自珊状臂形草(Brachiaria brizantha)、俯仰臂形草(Brachiaria decumbens)、湿生臂形草(Brachiaria humidicola)、细弱臂形草(Brachiaria stolonifera)、刚果臂形草(Brachiaria ruziziensis)、珊状尾稃草(Urochloa brizantha)、俯仰尾稃草(Urochloadecumbens)、湿生尾稃草(Urochloa humidicola)、莫桑比克尾稃草(Urochloamosambicensis)、马氏臂形草(Brachiaria marlothii)、Brachiaria nigropedata、网脉尾稃草(Urochloa dictyoneura)、毛柄尾稃草(Urochloa oligotricha)、类黍尾稃草(Urochloa panicoides)、宽花臂形草(Brachiaria obtusiflora)、Brachiariaserrifolia、背圆尾稃草(Urochloa advena)、直立尾稃草(Urochloa arrecta)、短尾尾稃草(Urochloa brachyura)、类杜茎尾稃草(Urochloa eminii)、毛尾稃草(Urochloamollis)、黄白尾稃草(Urochloa xantholeuca)、毛柄尾稃草(Urochloa oligotricha)、类黍尾稃草(Urochloa panicoides)、车前叶臂形草(Urochloa plantaginea)、厚背尾稃草(Urochloa platynota)、黄白尾稃草(Urochloa xantholeuca)、丝毛臂形草(Brachiariaholosericea)、匍匐臂形草(Brachiaria reptans)、锐头臂形草(Brachiariamilliformis)、四生臂形草(Brachiaria distachya)，以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述臂形草属-尾稃草属种复合体的植物物种选自：珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、刚果臂形草和莫桑比克尾稃草。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述植物材料的样品选自叶、茎和根材料中的一种或多种。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述植物材料的样品为种子材料。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述提供来自臂形草属-尾稃草属种复合体的植物物种中的植物材料的样品的步骤包括以下步骤：
研磨植物材料；
用醇洗涤研磨的植物材料；以及
从醇洗涤物中提取核酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述宏基因组分析包括从植物材料的样品中回收和分析遗传物质，以产生细菌和/或真菌序列数据。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述序列数据是使用通用聚合酶链反应(PCR)引物而产生，所述引物是针对16S rDNA基因的V4区和rDNA基因的ITS2区中的任一个或两个。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中代表所期望的核心、增补或独特微生物组的所选内生菌菌株是在与内生菌相关联的植物中提供有益特性的那些菌株。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述在与内生菌相关联的植物中的有益特性为提高的对水和/或养分胁迫的耐受性或提高的对害虫和/或病害的抗性。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述在与内生菌相关联的植物中的有益特性为富司烷化合物的产生。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述富司烷化合物为臂形草内酯(brachialactone)。
13.一种基本上纯化或分离的内生菌，其通过权利要求1至12中任一项的方法分离、选择和/或表征。
14.一种基本上纯化或分离的内生菌，其选自肉座菌属的种(Hypocrea sp.)/支顶孢属的种(Acremonium sp.)2.15.A.2、支顶孢属的种2.3.C.1、芦竹小球壳孢(Microsphaeropsis arundis)2.10.D.1、帚枝霉属的种(Sarocladium sp.)/支顶孢属的种2.12.B.1、帚枝霉属的种/支顶孢属的种2.10.C.2和帚枝霉属的种/支顶孢属的种2.11.B.1，它们保藏在国家度量协会，登记号分别为V15/028237、V15/028238、V15/028239、V15/028240、V15/028241和V15/028242。
15.一种用根据权利要求13或14所述的一种或多种内生菌接种的植物，所述植物包括被所述内生菌稳定侵染的不含内生菌的宿主植物。
16.根据权利要求15所述的接种的植物，在与未接种的对照植物相比时，其具有有益的特性，所述有益的特性为提高的对水和/或养分胁迫的耐受性或提高的对害虫和/或病害的抗性。
17.根据权利要求15所述的接种的植物，在与未接种的对照植物相比时，其具有有益的特性，所述有益的特性为富司烷化合物的产生。
18.根据权利要求17所述的接种的植物，其中所述富司烷化合物为臂形草内酯。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的接种的植物，其中植物为禾本科物种植物。
20.根据权利要求19所述的接种的植物，其中所述禾本科物种植物选自珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、网脉臂形草(B.dictyoneura)、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草、臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种；以及属于黑麦草属(Lolium)、羊茅属(Festuca)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、高粱属(Sorghum)、玉蜀黍属(Zea)、稻属(Oryza)、甘蔗属(Saccharum)、雀稗属(Paspalum)、芒属(Miscanthus)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、画眉草属(Eragrostis)和剪股颖属(Agrostis)的那些。
21.一种用根据权利要求13或14所述的内生菌侵染的植物，其中所述植物通过选自以下的方法进行侵染：接种、育种、杂交(crossing)、杂交(hybridisation)、转导、转染、转化和/或基因靶向；以及它们的组合。
22.一种植物、植物种子或其他植物部分，其源自根据权利要求15或21所述的植物。
23.根据权利要求13或14所述的内生菌用于产生被所述内生菌稳定感染的植物的用途。
24.一种增强对植物中的害虫和/或病害的抗性的方法，所述方法包括用根据权利要求13或14所述的内生菌接种所述植物。
25.一种产生富司烷的方法，所述方法包括：
从臂形草属-尾稃草属种复合体的植物中分离内生菌；
使所述内生菌在合适的培养基中生长；以及
从内生菌细胞中、从培养基中或从与培养基或内生菌相关的空气空间中回收一种或多种有机化合物，包括富司烷。
26.根据权利要求25所述的方法，其中内生菌为根据权利要求13或14所述的内生菌。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述富司烷为臂形草内酯。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述臂形草属-尾稃草属种复合体的植物选自：珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草、马氏臂形草、Brachiaria nigropedata、网脉尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、宽花臂形草、Brachiaria serrifolia、背圆尾稃草、直立尾稃草、短尾尾稃草、类杜茎尾稃草、毛尾稃草、黄白尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、车前叶臂形草、厚背尾稃草、黄白尾稃草、丝毛臂形草、匍匐臂形草、锐头臂形草、四生臂形草，以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种。
29.一种富司烷，其通过根据权利要求25至28中任一项所述的方法产生。
30.一种在臂形草属-尾稃草属种复合体的植物中产生富司烷的方法，所述方法包括：
提供臂形草属-尾稃草属种复合体的植物和内生菌；
用所述内生菌侵染所述植物以形成共生体；以及
使共生体在合适的培养基中生长，从而产生富司烷。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述内生菌为根据权利要求13或14所述的内生菌。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述富司烷为臂形草内酯。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述臂形草属-尾稃草属种复合体的植物选自：珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草、马氏臂形草、Brachiaria nigropedata、网脉尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、宽花臂形草、Brachiaria serrifolia、背圆尾稃草、直立尾稃草、短尾尾稃草、类杜茎尾稃草、毛尾稃草、黄白尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、车前叶臂形草、厚背尾稃草、黄白尾稃草、丝毛臂形草、匍匐臂形草、锐头臂形草、四生臂形草，以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种。
34.一种富司烷，其通过根据权利要求30至33中任一项所述的方法产生。
35.一种用一种或多种内生菌接种臂形草属-尾稃草属种复合体的植物的方法，所述方法包括：
提供臂形草属-尾稃草属种复合体的植物的灭菌的种子；
使所述种子在无菌条件下发芽以产生基本上不含微生物生物体的宿主植物；以及
用所述一种或多种内生菌接种所述宿主植物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述内生菌为根据权利要求13或14所述的内生菌。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述臂形草属-尾稃草属种复合体的植物选自：珊状臂形草、俯仰臂形草、湿生臂形草、细弱臂形草、刚果臂形草、珊状尾稃草、俯仰尾稃草、湿生尾稃草、莫桑比克尾稃草、马氏臂形草、Brachiaria nigropedata、网脉尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、宽花臂形草、Brachiaria serrifolia、背圆尾稃草、直立尾稃草、短尾尾稃草、类杜茎尾稃草、毛尾稃草、黄白尾稃草、毛柄尾稃草、类黍尾稃草、车前叶臂形草、厚背尾稃草、黄白尾稃草、丝毛臂形草、匍匐臂形草、锐头臂形草、四生臂形草，以及臂形草属-尾稃草属种复合体的种间和种内杂种。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中接种频率为约75％至约100％。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中使所述种子在无菌条件下发芽以产生宿主植物包括使发芽的种子在芽增殖培养基和根繁殖培养基上生长。
40.根据权利要求39所述的方法，其还包括将在芽增殖培养基上生长的芽分成单个分蘖并将它们转移至根繁殖培养基。
41.根据权利要求40所述的方法，其还包括使单个分蘖在根繁殖培养基上生长约1至约6周，以促进根生长。
42.根据权利要求35至41中任一项所述的方法，其中用一种或多种内生菌接种所述宿主植物包括移除外鞘以露出芽头，在芽分生组织中产生伤口并接种到伤口中。
43.根据权利要求35至42中任一项所述的方法，其还包括在接种后将小植株保持在无菌培养基上约1至约6周的时间。
44.根据权利要求35至43中任一项所述的方法，其还包括将接种的植物转移至土壤或类似的培养基中以进一步生长。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110088298A (zh) * 2016-08-12 2019-08-02 维多利亚农业服务控股公司 表征植物内生菌的方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10253038B2 (en) * 2017-05-01 2019-04-09 Florida State University Research Foundation, Inc. Fusicoccane derivatives and methods
CN109503623B (zh) * 2018-11-30 2020-04-21 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） Guanacastane类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用
WO2021007280A1 (en) * 2019-07-08 2021-01-14 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Compositions and methods for modulating microbiomes
BR112022000879A2 (pt) * 2019-07-19 2022-06-07 Agriculture Victoria Serv Pty Cepas de erwinia e métodos relacionados
CN114208437B (zh) * 2021-12-14 2022-09-13 青岛农业大学 一种玉米种子根鞘分离生物力测定技术方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998000091A2 (en) * 1996-07-03 1998-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antifungal agents
WO2012174585A1 (en) * 2011-06-20 2012-12-27 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Novel brachiaria-urochloa endophytes
CN104754932A (zh) * 2012-06-01 2015-07-01 维多利亚农业服务控股公司 大规模生产包含共生体的人工种子的方法
CN104883875A (zh) * 2012-06-01 2015-09-02 维多利亚农业服务控股公司 通过筛选多种宿主-共生生物联合体的共生体选择

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5408478B2 (ja) 2009-04-10 2014-02-05 独立行政法人国際農林水産業研究センター 環状ジテルペン化合物とその製造方法、土壌改良剤、硝化抑制剤及び肥料
WO2014020141A1 (en) * 2012-08-03 2014-02-06 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed additive composition
BR112015014693A2 (pt) 2012-12-20 2017-10-10 Gervais Danone Sa uso de bifidobacterium animalis para o tratamento ou a prevenção de ganho de peso corpóreo e resistência à insulina
JP6479685B2 (ja) 2013-02-04 2019-03-06 セレス セラピューティクス インコーポレイテッド 病原性細菌生育の抑制のための組成物および方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998000091A2 (en) * 1996-07-03 1998-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antifungal agents
WO2012174585A1 (en) * 2011-06-20 2012-12-27 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Novel brachiaria-urochloa endophytes
CN104754932A (zh) * 2012-06-01 2015-07-01 维多利亚农业服务控股公司 大规模生产包含共生体的人工种子的方法
CN104883875A (zh) * 2012-06-01 2015-09-02 维多利亚农业服务控股公司 通过筛选多种宿主-共生生物联合体的共生体选择

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. V. SUBBARAO等: "A paradigm shift towards low-nitrifying production systems: the role of biological nitrification inhibition (BNI)", 《ANNALS OF BOTANY》 *
G. V. SUBBARAO等: "Evidence for biological nitrification inhibition in Brachiaria pastures", 《PNAS》 *
武云鹏等: "野生大豆抗感大豆孢囊线虫材料内生细菌多样性分析", 《微生物学报》 *
蔚荣海等: "《基础生化实验与技术》", 30 September 2000, 吉林大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110088298A (zh) * 2016-08-12 2019-08-02 维多利亚农业服务控股公司 表征植物内生菌的方法

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