CN104883875A - 通过筛选多种宿主-共生生物联合体的共生体选择 - Google Patents

通过筛选多种宿主-共生生物联合体的共生体选择 Download PDF

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Abstract

本发明涉及选择和培育生物的新方法，特别是与共生生物表现出共生行为的生物，以及涉及由此开发出的新生物和共生体，例如植物或草(grass)和内生菌共生体。多种共生生物被用在多种生物中，并在育种过程的早期选择改善的共生相容性和表现。方法包括：通过用选自共生生物文库的共生生物接种宿主生物种质文库，而从种质产生改良生物；以及选择表现出所需共生体特征的改良宿主生物；以及通过对来自生物或生物-共生生物联合体的核酸文库的宏基因组分析，选择具有所需遗传和代谢特征的生物-共生生物联合体。

Description

通过筛选多种宿主-共生生物联合体的共生体选择
技术领域
本发明涉及选择和培育生物的新方法，具体而言是与共生生物——例如植物中的内生真菌或附生植物或细菌微生物组，例如反刍牲畜瘤胃中的微生物组——表现出共生行为的生物，以及涉及由此研发出的新生物和共生体。
背景技术
许多牲畜、作物和牧草物种的表型取决于个体基因型和共生生物基因型之间的相互作用。重要的植物，包括饲料用禾本科植物(grass)、豆科植物(legume)、乔木(tress)、灌木(shrub)和藤本植物(vine)通常被发现与包括真菌、细菌、病毒和其他微生物的内生菌存在联系。同样，重要的动物，包括牛、绵羊、猪、山羊等，其肠道和瘤胃中也存在微生物组。
有益和有害的园艺、农学和兽医特性都来自于这种联合体(association)，包括改善的对水和营养素胁迫的耐受，以及改善的对虫害的抗性。
例如，如果基因型正确的内生真菌在黑麦草植物中定殖，则黑麦草植物能够表现出改善的干旱耐受性和持续性。同样，在禾本科植物中，对昆虫的抗性可由内生菌产生的特定的代谢产物提供，具体而言是黑麦草碱(loline)生物碱和波胺(peramine)。其他由内生真菌产生的代谢产物，例如黑麦震颤素(lolitrem)和麦角生物碱，可对食草动物产生毒性并减少食草动物的进食。
已知在共生生物代谢产物特征中存在相当多的变化。例如，缺乏一种或两种动物毒素的内生真菌菌株已被引入商用黑麦草品种。
细菌微生物组也影响植物性能(performance)(例如，在黑麦草、小麦中)。
在动物中，肠道中的微生物负责动物饲料的消化。反刍动物宿主的 瘤胃中生存着一系列极其庞大而复杂的微生物，正是此微生物群落使其将低品质的饲料转化为高品质的蛋白质和脂质，以肉和乳的形式供人类消费。在上述过程中，产生了一种有效的温室气体——甲烷。瘤胃微生物-牛共生体在例如改善饲料转化效率和减少甲烷生产方面是重要的。在反刍动物中，对低品质饲料的成功消化可取决于具有具体的瘤胃微生物组特征。如果能够阐明宿主基因组区域与瘤胃微生物特征的差异有关，即可利用此来培育甲烷排放量更低、饲料转化效率得到改善的牛。
分子遗传标记物如简单序列重复(SSR)标记物已被开发用作诊断测试，以区分共生生物分类群，以及检测分类群内遗传变异。例如，标记物可用来区别具有不同毒性特征的共生生物菌株。
但是，仍需要方法来鉴定、分离和/或表征表现出和共生生物的共生行为的生物。人工培育此类共生体中的困难限制了它们的应用。例如，许多已知对牧草农业有益的新型内生菌表现出低接种频率(inoculation frequency)和在优良种质中较不稳定。
此外，在传统育种技术中，例如在饲草(forage grass)中(如多年生黑麦草和高羊茅)，通过经典的杂交育种技术来培育禾本科植物品种，在监测其多年的性能后，选择出具有优良特征的禾本科植物基因型。将被选出的形成实验品种的禾本科植物基因型随后用单一内生菌接种，所形成的禾本科植物-内生菌联合体接受任何有益特征(例如昆虫抗性)的评估。随后通过在数年时间内牧养动物来评估各个在其中利用单一内生菌的实验合成品种的农艺学性能及所产生的动物性能。此评估过程可揭示出，在不同的实验合成品种中使用的单一内生菌在某些所述品种中可能不会表现出植物和/或代际稳定性，或者在由单一内生菌所赋予的所需生物碱特征可在不同的合成品种中变化，未能孵育合适水平的昆虫抗性或导致动物中毒。如果上述耗时的过程能够被加速或改善，将是本领域中的一项重大进展。
因此，本发明的目标之一就是克服，或至少缓解与现有技术相关的一个或多个困难或缺陷。
发明内容
相应地，本发明的第一个方面是提供一种方法，用于产生一种改良 生物，此方法包括：
(i)提供生物的种质文库，以及共生生物文库；
(ii)用一种或多种选自共生生物文库的共生生物接种种质文库，以产生共生体；
(iii)培育、选择、筛选和/或评估接种的种质或共生体的所需共生体特征；和
(iv)随后鉴定、培养又或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良生物。
“共生体”的意思是，一种超生物体(supra-organism)，其代表生物与共生生物的联合体。例如，共生体可以是接种的植物种质。
“文库”的意思是，一种资源，例如共生生物的集合。
申请人已经证实可以利用多种生物的多种共生生物，并在育种过程的早期就选择出改善的共生相容性和性能。即，从头开始培育共生生物-宿主生物基因型组合并筛选所需特征，包括改善的共生体相容性和性能。这与现有技术不同，在现有技术中，宿主生物，例如禾本科植物品种，将被培育并选择一段时间，之后在品种发育后期才会用单一共生生物进行接种。
在本说明书中，术语“生物”指的是真核多细胞生物，包括但不限于动物和植物。在具体的实施方案中，动物可以是哺乳动物或鸟类。特别重要的是具有农业重要性的哺乳动物，例如在其肠道或瘤胃中包含着微生物组的牛、绵羊、猪、山羊等。在具体的实施方案中，此生物是植物，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。具体的植物类型包括但不限于，多年生禾本科植物、豆科植物、装饰性或长果实的乔木、藤本植物、灌木和灌木丛(bush)、草本植物(herb)，以及装饰性或可食的开花植物(flower)。
在本发明此方面的一个优选实施方案中，生物可以是一种植物或动物，共生生物能够与植物或动物形成共生联合体。生物优选地为可与内生菌建立共生联合体的植物。
“共生生物”的意思是，可以与多细胞生物相联合的微生物。
“与…联合”的意思是，共生生物生存在生物上、生物中或生物紧邻处。例如，共生生物可以是生存于另一种生物体内或细胞内或者所述生物的表面上或与表面紧密联系的微生物，例如与植物紧密联系的生物膜。 对于植物而言，共生生物可以是植物内生的，例如生存于植物的内部组织中，或其可为植物附生的，例如生长于植物外部。
共生生物可以选自真菌、病毒、细菌和其他微生物中的一种或多种。例如，其可以是内生菌，如内生真菌或内生细菌，附生植物，如附生真菌或附生细菌，细菌微生物组，或者是菌根如丛枝菌根。
相应地，在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种如上所述的方法，其中所述生物是植物，此方法包括：
(i)提供了植物种质文库；以及内生菌和/或附生植物和/或与植物联合的微生物组的文库；
(ii)用一种或多种选自所述文库的内生菌和/或附生植物和/或与植物联合的微生物组接种植物种质文库，以产生共生体；
(iii)培育、选择、筛选和/或评估共生体的所需共生体特征；和
(iv)鉴定、培养或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良植物。
在一个优选的实施方案中，此方法可用来开发表现出所需特征的改良共生体品种。
在本发明的另一方面，提供了一种生物-共生生物联合体的基因组选择方法，所述方法包括：
(i)提供了来自所述生物或所述生物-共生生物联合体的核酸样品文库；
(ii)使用宏基因组学分析所述样品，以获得每个样品的遗传特征(genetic profile)；
(iii)选择具有所需遗传和/或代谢特征的生物或生物-共生生物联合体。
在一个优选的实施方案中，所述方法可包括下述预先步骤：
(i)提供一种生物-共生生物联合体。
(ii)将所述生物-共生生物联合体置于一种或多种环境条件中；和
(iii)从经过每种环境条件处理的生物-共生生物联合体中制备核酸样品文库。
在本发明此方面的一个优选实施方案中，生物可以是植物或动物，共生生物可以是细菌微生物组。
在一个优选的实施方案中，此方法可用来开发表现出所需特征的改 良共生体品种。
植物可以为禾本科植物，优选多年生禾本科植物、豆科植物、藤本植物、灌木、乔木、草本植物、开花植物、灌木或灌木丛。根据本发明此方面的方法特别适用于禾本科植物和豆科植物。
内生菌可以是内生真菌或内生细菌。附生植物可以是附生真菌或附生细菌。在一个优选的实施方案中，文库可为细菌微生物组。
“通过宏基因组学分析所述样品”的意思是，分析从生物或生物-共生生物联合体回收的遗传物质，优选直接来自生物或生物-共生生物联合体的遗传物质，以使被取样的联合体中大部分(优选基本上所有)成员的大量无偏差样品和基因被分析。
此分析可包括检测多态标记物——例如简单序列重复(SSR)或接合型基因标记物——是否存在。
替代地或额外地，此分析可包括基因组和/或线粒体DNA和/或核糖体RNA测序，以及与已知核酸序列(例如指示细菌基因的16S rRNA序列)数据库进行序列比对。
所述生物-共生生物联合体被置于的一种或多种环境条件包括但不限于：不同的营养条件，例如，营养素胁迫，如低氮或低磷；以及不同的光、温度或水条件，例如分别为少光、寒冷胁迫或水胁迫。
在本发明的一个实施方案中，共生生物可包括一个遗传变异，以增强共生体的稳定性、共生体对非生物胁迫的耐受(例如，水胁迫)、共生体对生物胁迫的耐受(例如，病害抗性)、共生体的营养素利用效率(例如，磷利用效率和氮利用效率)；例如，在动物(如反刍牲畜物种)中的共生生物性状渐渗(trait introgression)，以增强共生体(即反刍牲畜生物及其瘤胃中的微生物组)的饲料转化效率或减少共生体的甲烷生成。
遗传变异可通过使用任意标准技术而引入，例如，通过一种或多种随机突变、双-多倍体化、定向突变、同源转基因(cisgenesis)、异源转基因(transgenesis)、内源转基因(intragenesis)。
遗传分析可根据上述方法进行。例如，筛选幼苗中的细菌16S rRNA序列。
共生体可以为任何适合的形式，包括接种的胚、植物种子、发芽的种子、幼苗、小植株、植株等。
在一个优选的形式中，核酸样品从幼苗叶中提取，更优选从幼苗的上胚轴、下胚轴或类似的胚芽中提取。在禾本科植物中，DNA/RNA可以从分蘖中提取。在另一个优选的形式中，核酸样品可以从根样品中提取。或者，核酸样品可以从整个发芽种子或幼苗中提取。
核酸样品优选为RNA样品，其之后可用来构建cDNA文库。
根据本发明此方面的方法还可包括对所选共生体种群进行表型分型，以评估共生体性能和/或所需特征的保持；以及通过如多系杂交来选择共生体，以产生合成共生体品种。
例如，可对所选共生体品种进行共生生物识别测定，然后通过多系杂交产生下一代种子。任选地，可重复上述步骤，以在下一代(例如下一代种子)中确认共生体的稳定性、所需特征、共生生物种类和/或共生生物发生率(incidence)。
相应地，在本发明的另一方面，提供了一种改良的共生体，其包括利用上述方法产生的一种或多种包含一种或多种共生生物的生物。
相应地，在本发明的另一方面，提供了一种改良的生物，其表现出和一种共生生物的共生体，并通过上述方法产生。
改良的生物可以是植物或动物。
当生物为植物时，植物可以是禾本科植物、乔木、开花植物、草本植物、灌木或灌木丛、藤本植物或豆科植物，或其产品。
植物材料可以是种子、幼苗、胚或等。
上述方法步骤可被重复，以获得共生体种子、植物或动物的后代。
另一方面，本发明提供了从本发明的种子或植物衍生的并且稳定感染了共生生物的植物、植物种子或其他植物部分。
植物细胞、植株、植物种子或其他植物部分优选为禾本科植物，更优选为牧草、草皮草或生物能源草，例如黑麦草属(Lolium)和羊茅属(Festuca)，包括多年生黑麦草(L.perenne)和高羊茅(L.arundinaceum)，以及臂形草属(Brachiaria)和尾稃草属(Urochloa)，包括珊状臂形草(B.brizantha)、俯仰臂形草(B.decumbens)、腐殖生臂形草(B.humidicola)和莫桑比克尾稃草(U.mosambicensis)。
“植物细胞”的意思是，任何受限于半透膜并包含质体的自增殖细胞。如果需要进一步增殖，此种细胞还需要细胞壁。本文中所使用的植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、 根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
大规模内生菌发现计划已经被用来建立内生真菌菌株文库。多年生黑麦草和高羊茅种质(accession)的集合已被建立。
所选的用来接种植物种质的内生菌可利用提交于2012年6月1日的题为《新型内生菌》的澳大利亚临时专利申请中所述技术来进行选择，该临时专利申请的全部公开内容通过引证的方式纳入本说明书。其中所描述的新型内生菌为特别优选的。
对这些种质(accession)中内生菌的遗传分析导致大量新型内生菌菌株的鉴定识别。这些新型内生菌菌株与已知的内生菌菌株在遗传学上存在差异。可通过实施代谢特征分析来确定这些菌株的毒素特征。
利用SSR标记物对植物中内生菌的具体检测可用来确认人工接种于例如禾本科植物、植物品种和栽培品种中的内生菌菌株的存在和种类。
在根据本发明此方面方法的筛选步骤(iii)中，接种后的种质可通过遗传分析和/或代谢特征分析来筛选。例如，可使用题为《新型内生菌》的澳大利亚临时专利申请中所述的遗传分析技术。
替代地或额外地，可对接种后的种质进行遗传分析(遗传表征)，来说明其与已知的共生生物基因型共生体之间的遗传差异，并确认人工接种于例如禾本科植物、植物品种和栽培品种中的共生生物菌株的种类。
“遗传分析”的意思是，分析共生生物的细胞核和/或线粒体DNA。
此分析可包括，检测多态标记物是否存在，例如简单序列重复(SSR)或接合型标记物。简单序列重复又被称为微卫星，其基于随机重复的1-7个核苷酸核心元件，更典型为1-4个核苷酸核心元件。SSR阵列被植入复杂侧翼DNA序列。微卫星被认为产生自复制滑动特性——其中DNA聚合酶暂停并沿其模板短暂滑动，因此相邻的短序列被重复。某些序列基序比其他序列更易产生滑动，导致基于不同基序类型的SSR位点的相对数量存在差异。一旦被复制，SSR阵列还可由于继续滑动和/或不规则的姐妹染色单体交换而扩大(或缩小)。SSR位点的总数量较大，使得原则上此类位点能够为任何连锁基因提供标签。
由于重复数量的差异，SSR是高度多态的，并且是共显性遗传的。SSR的检测是基于聚合酶链式反应(PCR)，只需要少量DNA并适合于自动操作。SSR在真核基因组(包括真菌基因组和植物基因组)中广泛存在，并且已被发现在植物基因组中，每21-65kb就会出现。因此， SSR是理想的标记物，具有广泛的应用，例如遗传多样性分析、基因型识别、基因组作图、性状作图和标记物辅助筛选。
已知可用来研究多年生黑麦草中的内生菌多样性的SSR标记物记载于van Zijll de Jong et al(2003)。
替代地或额外地，遗传分析可包括测序基因组和/或线粒体DNA，以及进行序列比对，来评估共生生物之间的遗传变异。
可对接种后的种质或生物-共生生物联合体进行代谢分析，以确定所需代谢性状的存在。
“代谢分析”的意思是，分析由共生生物产生的代谢产物，特别是毒素。此分析优选是通过产生每一种共生生物的接种植物并测量例如植物中的毒素水平、害虫和/或病害抗性、水和/或营养成分胁迫耐受来完成。更优选地，这是通过为每种内生生物产生等基因接种的植物并且测量植物中的毒素水平来完成。
“所需遗传和代谢特征”的意思是，共生生物具有遗传和/或代谢特征，其导致包含共生生物或与共生生物联合的生物中的有益表型。
例如，相对于缺乏共生生物或包含对照共生生物(例如，标准毒性(ST)内生菌)的对照植物，与共生生物联合的植物具有的有益特性包括，对水和/或营养成分胁迫的耐受改善、对害虫和/或病害的抗性改善、对生物胁迫耐受增强、对干旱耐受增强、水利用率提高、对极端温度耐受增强、毒性降低、营养成分可利用性增加、活力增加。
此有益特性还包括，所述联合植物对食草动物的毒性降低。
例如，相对于对照共生生物(例如ST内生菌)或相对于无共生生物的对照植物，对水和/或营养成分胁迫的耐受可增加至少约5％，更优选至少约10％，更优选至少约25％，更优选至少约50％，更优选至少约100％。相对于对照共生生物(例如ST内生菌)或相对于无共生生物的对照植物，对水和/或营养成分胁迫的耐受可优选增加约5％-约50％，更优选增加约10％-约25％。
例如，相对于对照植物，对害虫和/或病害的植物抗性可增加至少约5％，更优选至少约10％，更优选至少约25％，更优选至少约50％，更优选至少约100％。相对于对照植物，对害虫和/或病害的植物抗性可优选增加约5％-约50％，更优选增加约10％-约25％。
例如，相对于对照共生生物(例如ST内生菌)或相对于无共生生 物的对照植物，水利用效率和/或植物活力可增加至少约5％，更优选至少约10％，更优选至少约25％，更优选至少约50％，更优选至少约100％。相对于对照共生生物(例如ST内生菌)或相对于无共生生物的对照植物，水利用效率和/或植物活力可优选增加约5％-约50％，更优选增加约10％-约25％。
例如，相对于对照共生生物(例如ST内生菌)或相对于无共生生物的对照植物，毒性可降低至少约5％，更优选至少约10％，更优选至少约25％，更优选至少约50％，更优选至少约100％。相对于对照共生生物(例如ST内生菌)或相对于无共生生物的对照植物，毒性可优选降低约5％-约100％，更优选降低约50％-约100％。
在一个优选的实施方案中，毒性可被降低至可忽略的数量，或基本上零毒性。
在一个优选的实施方案中，内生菌可表现出所需毒素特征。
内生菌优选从羊茅种中分离，优选为高羊茅。
内生菌优选为内生真菌(Neotyphodium)属，更优选为选自钩状内生真菌(N.uncinatum)、苇状羊茅内生真菌(N.coenophialum)和多年生黑麦草内生真菌(N.lolii)的种，最优选苇状羊茅内生真菌。内生菌还可来自香柱菌属(Epichloe)，包括稻香柱菌(E.typhina)、E.baconii和羊茅香柱菌(E.festucae)。内生菌还可为非香柱菌属的外类群。内生菌还可为选自FaTG-3和类FaTG-3、FaTG-2和类FaTG-2的种。
内生菌还可来自枝顶孢属(Acremonium)，包括交枝顶孢(A.implicatum)，或者如题为《真菌和相关方法》的第2011902393号澳大利亚专利申请中所述，来自臂形草属和尾稃草属(Brachiaria-Urochloa)禾本科植物的内生菌，该专利申请的全部公开内容通过引证纳入本说明书。
“所需毒素特征”的意思是，与对照生物相比，共生生物产生明显减少的毒性化合物和/或明显更多的有益化合物。例如，在植物中，与接种对照内生菌(例如标准毒性(ST)内生菌)的植物相比，内生菌可产生明显减少的有毒生物碱，例如麦角瓦灵(ergovaline)；和/或同样与接种对照内生菌(例如标准毒性(ST)内生菌)的植物或无内生菌的对照植物相比，内生菌产生明显更多的生物碱，例如波胺、N-甲酰黑麦草碱、N-乙酰黑麦草碱和降黑麦草碱，赋予与其联合的植物有益特性，例如改 善的对水和/或营养成分胁迫的耐受和改善的对害虫和/或病害的抗性。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌可选自E1、NEA10、NEA11和NEA12，其于2010年1月5日保藏于国家计量院，登录号分别为V10/000001、V10/000002、V10/000003和V10/000004，并记载于国际专利申请PCT/AU2011/000020，该专利申请的全部公开内容通过引证纳入本说明书。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌可选自NEA16、NEA17、NEA18、NEA19、NEA20、NEA21和NEA23，其于2012年4月3日保藏于国家计量院，登录号分别为V12/001413、V12/001414、V12/001415、V12/001416、V12/001417、V12/001418和V12/001419，并记载于提交于2012年6月1日的题为《新型内生菌》的澳大利亚专利申请，该专利申请的全部公开内容通过引证纳入本说明书。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌可选自枝顶孢属1.1.A(1.1A)、3.3.A(3.3A)、5.1.B(5.1B)、9.2.A(9.2A)和12.1.A(12.1A)，其于2011年6月15日保藏于国家计量院，登录号分别为V11/011370、V11/011371、V11/011372、V11/011373和V11/011374，并记载于题为《真菌和相关方法》的第2011902393号澳大利亚专利申请，该专利申请的全部公开内容通过引证纳入本说明书。
此类内生菌可具有上文所述的所需毒素特征。
在本发明的一个优选实施方案中，共生生物可包括遗传变异，例如，用于在植物(如禾本科植物)中的内生菌性状渐渗，以增强共生体的植物稳定性、共生体的代际稳定性、共生体对非生物胁迫的耐受(例如，水胁迫)、共生体对生物胁迫的耐受(例如，病害抗性)、共生体的营养素利用效率(例如，磷利用效率和氮利用效率)；以及例如，用于在动物(如反刍牲畜物种)中的共生生物性状渐渗，以增强共生体(即反刍牲畜生物及其瘤胃中的微生物组)的饲料转化效率或减少共生体的甲烷生成。
遗传变异可通过使用任意标准技术而引入，例如，通过一种或多种随机突变、双-多倍体化、定向突变、同源转基因(cisgenesis)、异源转基因(transgenesis)、内源转基因。
在一个优选的实施方案中，内生菌可以是内生菌变体，如于2012年6月1日提交的题为《设计者内生菌(Designer Endophytes)》的澳大 利亚专利申请中所述，该专利申请的全部公开内容通过引证纳入本说明书。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌可以选自内生菌变体，所述内生菌变体选自NEA12dh5、NEA12dh6、NEA12dh13、NEA12dh14和NEA12dh17，其于2012年4月3日保藏于国家计量院，登录号分别为V12/001408、V12/001409、V12/001410、V12/001411和V12/001412。
此类内生菌可具有上文所述的所需毒素特征。
优选地，所述生物用共生生物接种，通过选自感染、育种、杂交(crossing)、杂交(hybridization)及其组合的方法。
在一个实施方案中，植物可通过等基因接种法来接种。此方法的优势在于，内生菌的表型效应可在不存在宿主特异性遗传效应的情况下被评估。更具体而言，可在植物种质中进行多次内生菌接种，在转移至土壤或其他生长培养基之前，在培养基中再生小植株。
在另一个实施方案中，植物种质文库可用多种内生菌接种。其好处在于，使有利的宿主-内生菌联合体被识别鉴定。
在植物中高度相容并稳定的反接合型(opposite mating-type)内生菌的识别鉴定为多年生黑麦草的内生菌分子育种提供了一种方法。植物优选通过过度接种(hyper-inoculation)被感染。
反接合型的内生菌菌株之间的菌丝融合为将有利性状传递至宿主植物提供了一种方法，优选通过过度接种。此类菌株优选地选自表现出高接种频率和与较大范围的种质的高相容性的有利特征，优选优良的多年生黑麦草和/或高羊茅宿主种质，以及表现出低接种频率和低相容性、但具有高度有利的生物碱毒素特征的内生菌。
被内生菌感染的植物可通过已知技术培养。本领域技术人员能够根据所要培养的植物容易地确定适合的培养条件。
筛选步骤(iii)可包括分析植物代谢产物。代谢产物可通过已知技术，例如色谱技术或质谱(LCMS或HPLC)来分析。在一个特别优选的实施方案中，被内生菌感染的植物可通过反相液相色谱质谱法(LCMS)来分析。此反相方法允许在一次LCMS色谱操作中分析来自单一的被内生菌感染的植物提取物中的特定的代谢产物(包括黑麦草碱、波胺、麦角瓦灵、黑麦震颤素和微紫青霉颤素(janthitrem)，如微紫青霉颤素I、微紫青霉颤素G和微紫青霉颤素F)。
在一个特别优选的实施方案中，内生菌可选自NEA2、NEA3、NEA6、NEA10、NEA11、NEA12、E1、NEA17、NEA21、NEA23、NEA18、NEA19、NEA16、NEA20、NEA12dh5、NEA12dh6、NEA12dh13、NEA12dh14、NEA12dh17、NEA12-DsRed和IRM1-35。
在另一个特别优选的实施方案中，LCMS包括EIC(提取离子色谱图)分析，可允许检测来自少量内生菌感染的植物材料的生物碱代谢产物。例如，代谢产物种类可通过比较内生菌感染的植物中的纯毒素或提取物与一种基本在相同条件下分析的已知毒素特征的保留时间来确定，和/或通过比较质谱碎片模式(如生成的质谱碎片模式)来确定。
如上所述，在根据本发明此方面的方法中，所选生物可以为植物或动物，优选为植物。当生物为植物时，植物种质可以以胚的形式存在，胚可被处理，形成人工种子。
相应地，在一个优选的实施方案中，提供了一种制备人工种子的方法，此方法包括：
提供植物种子来源；
对种子进行表面灭菌步骤；
从表面灭菌的种子中分离种子胚；和
用包衣包覆所述胚，形成人工种子。
人工种子可通过提交于2012年6月1日和2012年9月7日的题为《大规模产生共生体的方法》的澳大利亚临时专利申请中所述技术来制备，此临时专利申请的全部公开内容通过引证纳入本说明书。
种子可来自于任何适合的植物。所述植物可以是禾本科植物，优选多年生禾本科植物、豆科植物、藤本植物、乔木、草本植物、开花植物、灌木或灌木丛。根据本发明此方面的方法特别适用于禾本科植物和豆科植物。
种子可通过任何适合的技术进行表面灭菌。优选用酸(如盐酸)和漂白剂(如次氯酸钠)处理种子来对其进行灭菌。优选依次实施酸和漂白剂处理。酸处理可持续1～24小时，优选过夜。漂白剂处理可持续5分钟-1小时，优选约20分钟。漂白剂处理可在连续天实施两次，每次处理后都冲洗种子，例如使用无菌蒸馏水，并保存在约4-30℃，优选约24℃。
通过本领域技术人员已知的技术，可从处理后的种子中分离出胚。
在一个优选的实施方案中，所述胚可被处理，以产生一个或多个共 生生物(如内生菌)的进入点。例如，可以穿刺胚或其他方式损伤胚表面，例如通过擦伤或蚀刻，以促使共生生物进入。在一个特别优选的实施方案中，可使用皮下注射用的针头或类似物，在胚表面制造出一个或多个穿刺孔。
包衣可以是任何适合包裹胚的类型，包括海藻酸盐、琼脂、polyco2133、羧甲基纤维素、卡拉胶、结冷胶(gelrite)、瓜尔胶、果胶酸钠、黄芪胶的等。在一个优选的实施方案中，包衣是海藻酸盐，更具体而言是海藻酸钙。
在一个优选的实施方案中，胚可与包衣混合，并将包含单个胚的包衣液滴放入聚合溶液，例如氯化钙溶液，优选同时搅拌，以形成人工种子。在搅拌约1-60分钟后收集人工种子，优选在约15分钟搅拌后收集。
在一个优选的实施方案中，可在包覆之前用共生生物(如内生真菌)接种胚。在一个优选的形式中，可直接用内生菌菌丝体接种胚。
或者，在一个特别优选的实施方案中，分离出的胚可用包含共生生物的包衣层来包覆，例如包含内生真菌的包衣层。
在此实施方案中，接种步骤可包括：
提供种子胚来源；
用一种或多种共生生物(如内生真菌)接种所述胚；和
用包衣来包覆接种后的胚，以形成人工种子。
或者，接种步骤可包括：
提供种子胚来源；和
用包含共生生物(如内生真菌)的包衣来包覆所述胚，以形成人工种子。
在一个优选的实施方案中，种子可被双重包覆。优选第二包衣层为海藻酸盐，更优选为海藻酸钙，甚至更优选有色海藻酸钙。在一个优选的实施方案中，已有第一包衣层的人工种子在包覆第二包衣层之前可先空气干燥。
在一个优选的实施方案中，所述方法还可包括用第二包衣层来包覆人工种子，所述第二包衣层优选含有添加的适合胚和/或共生生物的营养成分。
或者，第二包衣层可不含添加的营养成分，此营养剥夺包衣层可被设计用来例如减少内生菌在发芽期间的向外生长(out-growth)，并限 制胚附近的内生菌的生长。
在一个优选的实施方案中，所述方法还可包括：
使人工种子生长，形成小植株或幼苗；和
筛选小植株或幼苗中的共生生物的存在，例如内生真菌。
使人工种子生长的步骤可利用任何适合的生长培养基来进行。特别优选发芽培养基，例如MS(Murashige和Skoog)、改良MS或MS+BAP(6-苯甲基氨基嘌呤)。
遗传分析可按照上述方法进行。例如，可筛选幼苗中的共生生物特异性(例如，内生菌特异性)简单序列重复(SSR)。
替代地或额外地，通过分子表型分型可筛选幼苗中有利共生体的存在。分子表型分型可通过于2012年6月1日提交的题为《分子表型分型方法》的澳大利亚临时专利申请中所述方法来实施，该申请全部公开内容通过引证纳入本说明书。
在此方法中，通过分子表型分型可筛选幼苗中有利共生体的存在。例如，可评估幼苗中改善的生物碱生产和/或改善的水溶性碳水化合物:蛋白的比值。此类技术可利用酶测定、比色测定、SSR标记物和/或代谢物组学分析。此类分析可以是半自动或基本全自动。
因此，此方法可包括筛选共生体中所需特征的存在，所述方法包括对共生体种群进行分子表型分型。
在一个优选的实施方案中，方法可包括评估共生体种群的生物碱生产和/或水溶性碳水化合物(WSC):蛋白的比值。此评估优选通过一种或多种选自酶测定、比色测定、SSR标记物和代谢物组学分析的方法进行。
在一个优选的实施方案中，生物碱生产的评估包括测量所述种群中生物碱特征和/或含量。优选的生物碱包括波胺、黑麦震颤素B和麦角瓦灵。在一个优选的实施方案中，生物碱可通过SSR标记物来推断，并通过代谢物组学分析来检测，更优选使用SSR标记物和代谢物组学分析的组合。
在另一个优选的实施方案中，可评估WSC:蛋白的比值。可通过酶测定对WSC进行定量。在一个优选的实施方案中，可确定蔗糖、葡萄糖、果糖、果聚糖各自的浓度。蛋白质可通过比色测定来定量。
在一个特别优选的实施方案中，可通过包括以下的方法来进行蛋白 质定量：
利用碱(如氢氧化钠)，从共生体中提取蛋白质，优选使用稀氢氧化钠溶液；
利用比色测定，如Bradford测定，进行蛋白质定量。
检测可利用如酶标仪(plate reader)来进行。
共生体可以是任何适合的形式，包括接种后的胚、植物种子、发芽的种子、幼苗、小植株和植株等。
种子优选来源自内生菌感染的植物(即，植物-内生菌共生体)。
在根据本发明此方面的方法中，筛选步骤(iii)可包括，通过加速老化来筛选人工种子，其记载于2012年6月1日提交的题为《稳定共生体筛选方法》的澳大利亚专利申请，该申请全部公开内容通过引证纳入本说明书。
相应地，本发明提供了一种评估植物/内生菌共生体的相容性和/或稳定性的方法，所述方法包括：
提供包括共生体的种子来源，例如接种内生真菌的植物胚；
通过向其施加加速老化，筛选种子和/或其后代的植物/共生生物联合体(即共生体，如植物-内生真菌共生体)的相容性和/或稳定性。
在加速老化过程中，种子或其后代被置于恶劣条件之下，优选通过高温和/或增加的含水量。在一个特别优选的实施方案中，种子可被暴露于高相对湿度的环境中。例如，种子可被暴露于约-20-50℃的温度下，优选10-45℃，更优选15-40℃，甚至更优选25-40℃，和/或约60％-100％的湿度水平，优选80％-100％，持续时间约1-30天，优选2-10天，更优选4-7天。
加速老化降低了内生菌的生活力，即它允许对不稳定联合体的反选择，并允许共生体按照其稳定性排序。
此方法优选包括另一个步骤，即对所选共生体种群进行快速共生生物(如内生真菌)生活力测定。
相应地，本发明的方法还包括评估植物/共生生物联合体(即共生体，如植物-内生菌共生体)的相容性和/或稳定性，其包括：
提供包括共生体的种子来源，例如接种内生真菌的植物胚；
通过向其施加加速老化，筛选种子和/或其后代的植物/共生生物联合体(即共生体，如植物-内生菌共生体)的相容性和/或稳定性；和
对所选共生体种群进行快速共生生物(如内生真菌)生活力测定。
根据本发明此方面，生活力测定步骤可包括：
培养种子，以产生小植株、幼苗或发芽的种子；
从小植株、幼苗或发芽的种子中提取DNA和/或RNA；
对提取出的DNA和/或RNA进行用于在植物中表达的共生生物特异性基因(如共生真菌特异性基因)的测定。
种子优选来源自从接种共生生物的植物(例如，接种内生真菌的植物)。
种子优选为人工种子，如前所述。
快速内生菌生活力测定记载于2012年6月1日提交的题为《快速内生菌生活力评估方法》的澳大利亚专利申请，其全部公开内容通过引证纳入本说明书。
种子优选培养一段相对短的时间，使得可获得对共生生物生活力(如内生真菌生活力)的快速评估。种子优选培养约1-10天，更优选3-10天，更优选3-7天，更优选3-5天。
本申请人已发现，内生菌特异性基因在上述时间范围内表达，使早期植物中内生菌生活力的评估得以进行。
在一个优选的形式中，DNA/RNA可提取自幼苗叶，更优选提取自幼苗的上胚轴、下胚轴或类似的胚芽。在禾本科植物中，DNA/RNA可以从分蘖中提取。在另一个优选的形式中，DNA/RNA可以从整个发芽种子中提取。
优选地，RNA和DNA共同提取，优选在单一步骤中。为了加速所述进程，优选从1-10日龄、优选3-10日龄、更优选3-7日龄、更优选3-5日龄的幼苗的上胚轴、下胚轴或类似的胚芽提取DNA/RNA。
所述测定是用于对所提取的DNA/RNA中的靶DNA/RNA分子进行扩增并同时定量的测定。所述测定优选为定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR/qRT-PCR)测定测定，或为动态聚合酶链式反应(KPCR)测定。在一个优选的形式中，所述测定为TaqMan或类似测定。
内生菌特异性基因可以为任何适合的类型。优选地，其只在或主要在植物中表达，或在植物中高度表达。特别优选编码蛋白7490、8263、0005和2232的基因。
通过本领域技术人员已知的方法来设计引物，用于靶基因的扩增。
种子可来自任何适合的植物。所述植物可以是禾本科植物，优选为多年生禾本科植物、豆科植物、藤本植物、灌木、乔木、草本植物、开花植物、灌木或灌木丛。根据本发明此方面的方法特别适用于禾本科植物和豆科植物。
种子优选地来源自共生生物如内生菌感染的植物(例如，植物/内生菌共生体)。
种子优选为人工种子。
根据本发明此方面的方法还可包括对所选共生体种群进行表型分型，以评估共生体性能和/或所需特征的保持；以及通过如多系杂交来选择共生体，以产生合成共生体品种。
例如，可对所选共生体品种进行共生生物识别测定，然后通过多系杂交产生下一代种子。任选地，上述步骤可被重复，以在下一代(例如下一代种子)中确认共生体的稳定性、所需特征、共生生物(如内生真菌)种类和/或共生生物(如内生真菌)发生率。
相应地，在本发明的另一方面，提供了一种改良的共生体，其包括利用上述方法产生的一种或多种包含一种或多种共生生物的生物。
相应地，在本发明的另一方面，提供了一种改良的生物，其表现出和一种共生生物的共生体，并通过上述方法产生。
改良的生物可以是植物或动物。
当所述生物为植物时，植物可以是禾本科植物、乔木、开花植物、草本植物、灌木或灌木丛、藤本植物或豆科植物，或其产品。
植物材料可以是种子、幼苗、胚或等。
上述方法步骤可被重复，以获得共生体种子、植物或动物的后代。
另一方面，本发明提供了衍生自本发明的种子或植物并且稳定感染了共生生物(如内生菌)的植物、植物种子或其他植物部分。
植物细胞、植株、植物种子或其他植物部分优选为禾本科植物，更优选为牧草、草皮草或生物能源草，例如黑麦草属和羊茅属，包括多年生黑麦草和高羊茅，以及臂形草属和尾稃草属，包括珊状臂形草、俯仰臂形草、腐殖生臂形草和莫桑比克尾稃草。
“植物细胞”的意思是，任何受限于半透膜并包含质体的自增殖细胞。如果需要进一步增殖，此种细胞还需要细胞壁。本文中所使用的植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、 根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
在本发明的一个替代的实施方案中，所述生物可以是动物，优选地选自牛、绵羊、山羊、鹿等。
相应地，在本发明的一个优选实施方案中，提供了如上述的一种方法，其中所述生物为动物，此方法包括：
(i)提供了动物种质文库；以及共生生物文库；
(ii)用一种或多种选自所述共生生物文库的共生生物接种所述动物种质文库，产生共生体；
(iii)培育、选择、筛选和/或评估所述共生体的所需共生体特征；和
(iv)鉴定、培养或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良动物。
在本发明的另一方面，提供了比对定位宿主基因组中影响瘤胃微生物特征的区域的方法，所述方法包括：
(i)提供了宿主基因组多态性文库；
(ii)通过实施联合研究，确定多态性对瘤胃微生物组特征的影响；和
(iii)鉴定宿主基因组中一个或多个影响瘤胃微生物特征的区域。
在一个优选的实施方案中，所述生物为牛。
另一方面，本发明包括鉴定和/或克隆核酸，其包括编码来自共生生物基因组的多肽或转录因子的基因。
用于鉴定和/或克隆编码上述基因的核酸的方法对于本领域技术人员是已知的，其包括构建核酸文库，例如cDNA文库或基因组文库；以及筛选此类文库，例如使用用于所需类型基因的探针；或使本发明的共生生物基因组发生突变，例如利用化学或转座子诱变；鉴定目的多肽或转录因子生产中的改变，并因此鉴定编码此多肽或转录因子的基因。
因此，在本发明的另一方面，提供了一种来自本发明的共生生物基因组的编码多肽或转录因子的基本纯化或分离的核酸。
“核酸”的意思是，能够携带遗传信息的核苷酸链。此术语通常指基因或具有功能活性的片段或其变体或所述生物基因组中其他影响其表型的序列。术语“核酸”包括单链或双链的DNA(如cDNA或基因组DNA)和RNA(如mRNA或microRNA)，任选地包括合成的、非天然的或 改变的核苷酸碱基、合成的核酸及其组合。
“编码多肽或转录因子的核酸”的意思是，编码通常存在于本发明的共生生物中的酶或转录因子的核酸。
本发明包括本发明的核酸的功能活性片段和变体。与核酸相关的“功能活性”的意思是，所述片段或变体(如类似物、衍生物或突变体)能够操控所编码的多肽的功能，例如，通过被翻译成能够催化或调控相关通路中包括的步骤，或调控共生生物中的通路的酶或转录因子。此类变体包括天然的等位基因变体和非天然的变体。一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和衍生化都包括在内，只要所述修饰没有导致所述片段或变体的功能活性的丧失。功能活性片段或变体与其相对应的上述序列的相关部分优选具有至少约80％的同一性，更优选至少约90％的同一性，甚至更优选至少约95％的同一性，最优选至少约98％的同一性。此类功能活性变体和片段包括，例如，具有保守性核酸改变的那些。
所述片段优选具有至少20个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少100个核苷酸。
所述片段优选在表达时能够产生与原始基因相同的活性。所述片段优选在共有序列中保留保守区。
所述变体优选为特定序列的变体，其或者提供了保守性取代，或者在共有序列中提供一定水平的有限修饰，例如，不超过约5％，更优选不超过1％的水平。
例如，编码X的序列的片段和变体可包括：来自物种Z的编码X的野生型序列；野生型序列的片段，其中此片段编码X并且保持物种Z的共有序列中的保守区域；以及所述野生型序列或片段的变体，其编码X活性并且只有保守性取代；变体X’，其编码X活性，且序列差异只在于一个或多个用来构成共有序列的辅助序列中的取代；或变体X”，其编码X活性，且其与野生型序列或片段相比氨基酸改变不超过约95％，更优选不超过约99％。
“保守性核酸改变”或“保守性取代”的意思是，由于遗传密码的简并性，导致所编码的蛋白中氨基酸保守的核酸取代。此类功能活性变体和片段还包括，例如，具有的核酸改变导致对应氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的保守性氨基酸取代的那些。
“保守性氨基酸取代”的意思是，用另一个同样类别的氨基酸取代一 个氨基酸，所述类别如下：
非极性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
不带电荷极性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性：Asp、Glu
碱性：Lys、Arg、His
其他保守性氨基酸取代还可按照下述类别进行：
芳香族：Phe、Tyr、His
质子供体：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
质子受体：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
在本发明的另一方面，提供了一种遗传构建体，其包括根据本发明的核酸。
“遗传构建体”的意思是，重组核酸分子。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的遗传构建体可以是载体。
“载体”的意思是，用来将遗传物质转移到靶细胞中的遗传构建体。
载体可以为任何适合的类型，可以是病毒或非病毒的。载体可以为表达载体。此类载体包括染色体、非染色体和合成核酸序列，例如，植物病毒衍生物、细菌质粒、来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒衍生物、来自毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒衍生物、噬菌体DNA、酵母人工染色体、细菌人工染色体、二元细菌人工染色体、衍生自质粒和噬菌体DNA组合的载体。但是，还可使用其他任意载体，只要其在靶细胞中可复制或可整合或可存活。
在本发明此方面的一个优选实施方案中，遗传构建体还可包括启动子和终止子；所述启动子、基因和终止子是可操作连接。
“启动子”的意思是，足够指导可操作连接的核酸序列的转录的核酸序列。
“可操作连接”的意思是，核酸和调控序列(如启动子)以一种允许所述核酸在适合的条件下表达的方式连接，例如，当适合的分子如转录激活因子蛋白结合在调控序列上时。可操作连接的启动子优选位于相关核酸的上游。
“上游”的意思是，沿着核酸的3’->5’的方向。
启动子和终止子可以为任何适合的类型，其对于靶细胞来说可以是内源的或外源的，只要其在靶细胞中是有功能的。
大量可用于本发明遗传构建体的终止子也为本领域技术人员所熟知。终止子与启动子序列可来自相同的基因或不同的基因。特别合适的终止子是多聚腺苷酰化信号，如(CaMV)35S polyA，其他终止子来自胭脂碱合酶(nos)基因和章鱼碱合酶(ocs)基因。
除了启动子、基因和终止子外，遗传构建体还包括其他用于核酸表达的必要元件，以不同的组合方式，例如，载体骨架、复制起点(ori)、多克隆位点、间隔区序列、增强子、内含子、抗生素抗性基因和其他选择性标记物基因(如新霉素磷酸转移酶(nptll)基因、潮霉素磷酸转移酶(hph)基因、膦丝菌素乙酰转移酶(bar或pat)基因)，以及报告基因(如β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因(gusA)和绿荧光蛋白(GFP)基因(gfp))。遗传构建体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点。遗传构建体还可包括用于扩增表达的合适的序列。
本领域技术人员要领会到，遗传构建体的各组分为可操作连接，导致所述核酸的表达。用于可操作连接本发明遗传构建体各组分的技术为本领域技术人员所熟知。此类技术包括使用接头，如合成接头，例如包括一个或多个限制性酶切位点。
遗传构建体优选为基本上纯化或分离。
“基本上纯化的”的意思是，遗传构建体中不含这样的基因，其在作为本发明核酸或启动子来源的生物的天然基因组中位于所述核酸或启动子的侧翼。因此，此术语包括，例如，纳入载体中的遗传构建体；或纳入自动复制的质粒或病毒中的遗传构建体；或纳入原核或真核生物的基因组DNA中的遗传构建体；或作为独立于其他序列的单独分子(例如，通过PCR或限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在的遗传构建体。此术语还包括遗传构建体，其是编码其他多肽序列的杂交基因的一部分。
基本上纯化的遗传构建体的纯度优选为至少约90％，更优选为至少约95％，甚至更优选为至少约98％。
术语“分离的”的意思是，所述物质从其原来的环境(例如，如果所述物质是自然存在的，即为自然环境)中被移出。例如，在活体植物中天然存在的核酸并未被分离，但是与在天然系统中的某些或全部共存物质分开的相同核酸为分离的。这些核酸可以是载体的一部分，和/或是一种组合物的一部分，但它们仍然是被分离，因为所述载体或组合物并不 是其天然环境中的一部分。
作为使用选择性标记物基因来提供表型性状以用于选择转化的宿主细胞的替代方式，转化细胞中遗传构建体的存在可以通过其他熟知的技术来确定，例如PCR(聚合酶链式反应)、DNA印记杂交分析、组织化学测定(如GUS测定)、薄层色谱(TLC)、RNA印记和蛋白质印记杂交分析。
本发明的遗传构建体可通过任何适合的技术引入生物，例如植物、动物、微生物或真菌。用于将本发明的遗传构建体纳入植物细胞或真菌细胞的技术(例如，通过转导、转染、转化或基因打靶)为本领域技术人员所熟知。此类技术包括：农杆菌介导的导入，根瘤菌介导的导入，对组织、细胞和原生质体的电穿孔，原生质体融合，向生殖器官中的注射，向未成熟胚中的注射，以及向细胞、组织、愈伤组织、未成熟和成熟胚中的高速弹丸导入(high velocity projectile introduction)，基因枪转化，Whiskers转化，以及上述方法的组合。技术的选择很大程度上取决于待转化的植物或真菌的类型，并且可由普通技术人员容易地确定。对于原生质体转化，特别优选PEG介导的转化。对于真菌转化，特别优选PEG介导的转化、原生质体电穿孔和农杆菌介导的菌丝外植体转化。
利用本领域所熟知的方法，可如下文所述对包含本发明的遗传构建体的细胞进行选择，然后在适合的培养基中培养，以再生转化植物或真菌。培养条件，如温度、pH等，对于本领域技术人员来说是显而易见的。利用本领域所熟知的方法，可以使转化后的植物或真菌进行有性或无性繁殖，以产生转化植物或真菌的连续后代。
除非上下文有其他要求，本文中所使用的术语“包括(comprise)”及其变型“包括”(comprising,comprises和comprised)并不排除其他添加物、成分、整数或步骤。
本说明书对现有技术的引用并非、也不应当被视为承认或以任何形式暗示此现有技术在澳大利亚或其他任何辖区构成公知常识的一部分，或此现有技术可被合理地预期本领域技术人员会确定、理解和认为其是相关的。
具体实施方式
在附图中
图1表示来自靶羊茅种质集合的种质中内生菌含量的基因型分型。
图2表示高羊茅内生菌的遗传多样性分析。
图3表示宿主和内生菌的多样性分析。
图4表示用于代谢分析、内生菌分离和等基因接种的羊茅-内生菌组合的选择。
图5表示用于代谢分析、内生菌分离和等基因接种的羊茅-内生菌组合的选择。
图6表示高羊茅内生菌的所需毒素特征。
图7表示代谢特征分析。
图8表示选择用于代谢产物的半定量分析的内生菌。
图9和图10表示羊茅内生菌的代谢组学分析。
图11表示在温度/水胁迫下的代谢特征的半定量分析。
图12表示选择用于等基因接种的内生菌。
图13表示在等基因接种之前对分离的内生菌培养物的基于SSR的基因型分型。
图14表示高羊茅和多年生黑麦草宿主基因型中的内生菌植物稳定性(接种后12个月时的稳定性)。
图15表示选择用于等基因接种的内生菌。
图16-19表示等基因高羊茅-内生菌联合体的代谢分析。
图20表示羊茅内生菌的抗真菌生物测定。柱1：禾本科炭疽刺盘孢菌(Colletotrichum graminicola)；柱2：凌风草德氏霉(Drechslera brizae)；柱3：禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)。
图21表示对所选新型羊茅内生菌的测序。
图22表示波胺生物合成途径。
图23A-C表示在非香柱菌外类群内生菌中perA基因的存在(图23A NEA17；图23B NEA18；图23C NEA19)。
图24表示麦角瓦灵生物合成途径。
图25表示在eas基因簇中的基因。
图26A-D表示内生菌菌株中用于麦角瓦灵生物合成的dmaW基因的存在(图26A NEA17；图26B NEA16；图26C AR542；图26D NEA20)。
图27A-D表示用于麦角瓦灵生物合成的eas基因簇的存在。图27A FaTG-2NEA17(287819)；图27B非香柱菌外类群NEA18(FEtc6-75)； 图27C FATG-3 NEA21(231557)；图27D苇状羊茅内生真菌NEA16(FEtc7-342)。
图28表示黑麦震颤素B生物合成途径。
图29表示黑麦震颤素B生物合成基因簇中的基因。
图30 A-D表示内生菌菌株中黑麦震颤素B生物合成基因簇1(ltmG、ltmM和ltmK)的存在。图30A FaTG-2 NEA17(287819)；图30B非香柱菌外类群NEA18(FEtc6-75)；图30C FATG-3 NEA21(231557)；图30D苇状羊茅内生真菌NEA16(FEtc7-342)。
图31 A-D表示内生菌菌株中黑麦震颤素B生物合成基因簇2(ltmB、ltmQ、ltmP、ltmF和ltmC)的存在。图31A FaTG-2 NEA17(287819)；图31B非香柱菌外类群NEA18(FEtc6-75)；图31C FATG-3 NEA21(231557)；图31D苇状羊茅内生真菌NEA16(FEtc7-342)。
图32 A-D表示内生菌菌株中黑麦震颤素B生物合成基因簇3(ltmE和ltmJ)的存在。图32A FaTG-2 NEA17(287819)；图32B非香柱菌外类群NEA18(FEtc6-75)；图32C FATG-3 NEA21(231557)；图32D苇状羊茅内生真菌NEA16(FEtc7-342)。
图33表示黑麦草碱生物合成途径。
图34表示黑麦草碱生物合成基因簇。
图35 A-D表示内生菌菌株中黑麦草碱生物合成基因簇的存在。图35A FaTG-2 NEA17(287819)；图35B非香柱菌外类群NEA18(FEtc6-75)；图35C FATG-3NEA21(231557)；图35D苇状羊茅内生真菌NEA16(FEtc7-342)。
图36A-F表示内生菌菌株NEA23(269850)的生物碱生物合成基因分析。图36A黑麦草碱基因簇的存在；图36B波胺基因的存在；图36C黑麦震颤素基因簇01的分析；图36D黑麦震颤素基因簇02和03的分析；图36E用于麦角瓦灵生产的dmaW基因的分析；图36F用于麦角瓦灵生产的eas基因簇的分析。
图37表示NEA23和NEA21的基因型分析。
图38表示NEA16和NEA20的基因型分析。
图39表示多年生黑麦草内生菌的所需毒素特征。
图40表示来自于某靶黑麦草种质文库的种质中内生菌含量的基因型分析。
图41表示来自于某靶黑麦草种质文库的种质中内生菌含量的分析。灰色圆圈-候选；黑色圆圈-对照。
图42表示等基因宿主植物基因型栽培品种“相似度”确认。
图43表示等基因宿主植物基因型栽培品种“相似度”确认。
图44表示用于宿主-内生菌联合体的QC的宿主组分子遗传测试的发展。
图45表示将候选内生菌接种至多种黑麦草宿主组的分生组织培养物中。
图46表示所选的内生菌。
图47表示已知的生物碱及其前体的具体表征。
图48表示宿主组鉴定测试。
图49和图50表示新型等基因宿主-内生菌联合体的深入代谢特征分析。
图51表示LEPJ：已知生物碱。
图52表示LEPJ的精确质量。
图53表示LEPJ的鉴定。Bro08_ST_1联合体的单重复的LCMS分析，展示提取离子色谱图。(A)阳性离子提取；(B)波胺；(C)麦角瓦灵；(D)黑麦震颤素B；(E)微紫青霉颤素；(F)阴性离子提取。
图54表示LEPJ的鉴定。Tolosa_NEA12联合体的单重复的LCMS分析，展示提取离子色谱图。(A)阳性离子提取；(B)波胺；(C)麦角瓦灵；(D)黑麦震颤素B；(E)微紫青霉颤素；(F)阴性离子提取。
图55表示LEPJ的定量。根据保留时间和光谱，对生物碱含量的LCquant分析。(A)波胺；(B)麦角瓦灵；(C)黑麦震颤素B；(D)微紫青霉颤素。
图56表示E+宿主植物与E-宿主植物的半定量生物碱(LEPJ)特征的对比。Y误差条代表标准误差；每个柱上方的字母代表含有相同内生菌的不同宿主之间的显著差异；*代表含有不同内生菌的相同宿主之间的显著差异；**比值是相对于Bronsyn ST。
图57表示在等基因宿主(Imp04)中的不同内生菌的半定量生物碱特征的对比。Y误差条代表标准误差；*代表含有不同内生菌的相同宿主之间的显著差异。
图58表示所选内生菌在不同等基因宿主中的生物碱(LEPJ)特征 稳定性的评估。Y误差条代表标准误差；每个柱上方的字母代表含有相同内生菌的不同宿主之间的显著差异；*代表含有不同内生菌的相同宿主之间的显著差异；**比值是相对于Impact。
图59表示黑麦震颤素B的生物合成；
图60表示麦角瓦灵的生物合成；
图61表示黑麦震颤素B生物合成途径的分析；
图62表示雀稗宁(paspalinine)——A震颤原途径。
图63表示一种途径分析：雀稗宁——A震颤原。
图64表示黑麦震颤素和雀稗宁在共生体中的存在。
图65表示，在生产波胺的内生菌不存在的情况下，波胺在植物中以痕量存在。
图66表示用来评估由内生菌所介导的宿主表型变化的过程。1个等基因宿主：Impact(Imp04)；5个宿主-内生菌联合体：NEA10、NEA11、NEA12、ST、E-；6个克隆复制子。
图67表示内生菌对共生体性能的影响。A.分蘖数量；B.芽鲜重；C.根鲜重；D.根干重
中灰——0.5mM NO3 -；深灰——2.5mM NO3 -；浅灰——10.0mM NO3 -。
图68表示在T1采收之前的植物。
图69表示通过分蘖数量来测量的性能。
图70表示利用454测序平台的序列分析。
图71表示利用Illumina测序平台的序列分析。
图72表示已测序的多年生黑麦草内生菌基因组的总结。总产量＝84.8千兆碱基(gigabase)(GAll:7.4Gb,HiSeq:77.4Gb)；HiSeq平均产量＝2.2Gb/菌株；GAll平均产量＝373Mb/菌株。
图73表示已测序的多年生黑麦草内生菌基因组的总结。总读段数＝436920622碱基对；HiSeq成对读段平均数＝12844656碱基对/菌株；GAll成对读段平均数＝1863852碱基对/菌株。
图74-78表示Illumina读段v 454重叠群。
图79表示454FLX v 454Titanium v Illumina GAll覆盖度展示。
图80表示454FLX v 454Titanium v Illumina GAll v HiSeq覆盖度展示。
图81表示均聚物校正：图像视图。
图82表示均聚物校正：碱基视图。
图83表示泛基因组单核苷酸多态性(SNP)识别(calling)：图像视图，读段水平。
图84表示77个独立的测序运行，通过相似性排序。
图85表示独立的测序运行还能展示出菌株特异性缺失。
图86表示独立的测序运行能够从SNP数据预测氨基酸改变。
图87表示重叠群数量随着拼接完善(assembly refinement)的次数而减少。
图88表示N50随着拼接完善的次数而增加。
图89表示拼接完善减少了支架(scaffold)的数量和单个“未组成支架的”重叠群的数量。
图90表示每个重叠群的碱基平均数随着拼接完善而增加。
图91表示黑麦震颤素B、麦角瓦灵和波胺的结构，并所示的所需毒素特征。
图92表示用于评估内生真菌属内生菌的抗真菌活性的体外生物测定。
图93表示离脱叶测定，用于评估在有和没有内生真菌属内生菌的情况下，多年生黑麦草植物对禾冠锈病(Puccinia coronata f.sp.Lolii)的抗性。
图94表示在有和没有内生真菌属内生菌的情况下，用于多年生黑麦草植物的干旱耐受和水利用效率的温室和田野试验筛选。
图95表示细胞分裂中的步骤。
图96表示内生菌细胞染色体加倍的实验流程。
图97表示用于内生真菌属菌株中DNA含量评估的流式细胞术校准。峰值表明相关细胞核DNA含量。
图98表示NEA12dh内生真菌属内生菌菌株的流式细胞术分析。
图99表示与对照内生菌菌株相比，NEA12dh内生真菌属内生菌菌株在培养8周后的生长速率分析。
图100表示与对照内生菌菌株相比，NEA12dh内生真菌属内生菌菌株在培养5周后的生长速率分析。
图101表示NEA12dh内生真菌属内生菌菌株的抗真菌生物测定。
图102表示NEA12dh内生真菌属内生菌菌株的抗真菌生物测定。
图103表示用秋水仙碱处理的内生真菌属内生菌菌株的基因组勘测测序读段深度的分析。
图104示出了比对定位(mapping)至NEA12基因组勘测序列拼接的基因组勘测测序读段的分析。
图105表示X射线诱变的实验流程。
图106表示内生真菌属内生菌的吲哚-二萜生物合成途径。
图107表示X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的体外生长。
图108表示内生真菌属内生菌的ltm基因簇。
图109表示X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的基因组序列变异的确认。
图110表示在X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的基因组序列中，单核苷酸多态性(SNP)。
图111表示X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的基因组序列中的小插入/缺失(INDEL)。
图112表示X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的基因组序列中的缺失。
图113表示X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的基因组序列的基因区域中SNP的数量。
图114表示X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的基因组序列的基因区域中INDEL的数量。
图115表示X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的基因组序列中基因组序列改变(缺失)的光谱。
图116表示X射线照射的菌株的诱变指数，基于X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的基因组序列中所观测到的基因组序列改变的数量。
图117表示NEA12dh内生真菌属内生菌菌株的代谢分析。
图118表示X射线照射的内生真菌属内生菌菌株的代谢分析。
图119表示利用具有不添加营养成分的海藻酸钙基质的包衣，对多年生黑麦草胚进行海藻酸钙包覆，以产生人工种子。
图120表示利用具有有色海藻酸钙基质的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子。用王后绿(90610)染色的多年生黑麦草的人工种子；a)空气干燥的人工种子；b)铺于发芽培养基上的人工种子。 用王后粉(92330)染色的多年生黑麦草的人工种子；c)空气干燥的人工种子；d)铺于发芽培养基上的人工种子。
图121表示利用具有多个海藻酸钙基质层的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子。a)包覆添加了营养成分的第一层包衣(无色)海藻酸钙层(层A)的多年生黑麦草的人工种子；b)包覆添加了营养成分的两层(第一层A，无色；加上第二层B，王后绿染色)海藻酸钙层的多年生黑麦草的人工种子；c)将有双层包衣的人工种子置于发芽培养基。
图122表示利用具有多个海藻酸钙基质层的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子。a)-c)包覆了第一层包衣(无色)海藻酸钙层(层A)和具有王后粉或王后绿染色的海藻酸钙层的第二层包衣(层B)的多年生黑麦草人工种子的横截面。d)-e)包覆了第一层包衣(无色)海藻酸钙层(层A)和具有王后绿染色的海藻酸钙层(层B)的第二层包衣的多年生黑麦草人工种子的横截面。
图123表示多年生黑麦草栽培变种Bronsyn E-(无内生菌，2668种子批次)的种子、胚和人工种子的萌发。a)原始种子：在滤纸上发芽频率为1％；b)表面灭菌后的种子：在滤纸上发芽频率为10％；c)分离的胚：在发芽培养基上的发芽频率为48％；d)人工种子(和发芽培养基)：在MS培养基上的发频芽率为40％。
图124表示多年生黑麦草栽培变种Bronsyn E-(有内生菌，2667种子批次)的种子、胚和人工种子的萌发。a)原始种子：在滤纸上发芽频率为10％；b)表面灭菌后的种子：在滤纸上发芽频率为30％；c)分离的胚：在发芽培养基上的发芽频率为90％；d)人工种子(和发芽培养基)：在MS培养基上的发芽频率为81％。
图125表示多年生黑麦草人工种子的发芽和从人工种子衍生的幼苗的发育。
图126表示多年生黑麦草的新鲜分离的种子来源的胚，每个胚被单独放置于a)96孔板的每个孔中，将b)内生菌菌丝体悬液加入到每个单独的孔中，在层流下使其进行部分空气干燥，然后c)用海藻酸钙层包覆的人工种子。
图127表示通过方法1制备的人工种子。
图128表示通过方法1制备的发芽中的人工种子。
图129表示通过方法2制备的人工种子。
图130表示通过方法2制备的人工种子，具有内生菌向外生长。
图131表示通过方法3制备的人工种子。
图132表示通过方法3制备的人工种子，具有内生菌向外生长。
图133表示通过方法3制备的发芽中的人工种子。
图134表示加速老化的概况。
图135表示在种子的加速老化处理及其后的种子贮存之后，具有不同内生菌的多年生黑麦草栽培变种Bronsyn的种子发芽率。
图136表示在种子的加速老化处理及其后的种子贮存之后，具有不同内生菌的多年生黑麦草栽培变种Bronsyn的种子中内生菌生活力。
图137表示在种子的加速老化处理之后，代表在不同宿主遗传背景下不同内生菌的共生体的种子发芽率。
图138表示在种子的加速老化处理之后，在不同宿主遗传背景下不同内生菌的生活力。在Alto、Trojan和Bealey的每张图表中，条状代表内生菌NEA10、NEA11、NEA12和E1，按照从左到右的顺序。在Bronsyn的每张图表中，条状代表内生菌AR1、NEA10、NEA11、NEA12、E1和ST，按照从左到右的顺序。
图139表示在种子的加速老化处理之后，在不同宿主遗传背景下不同内生菌的生活力。
图140表示为TaqMan测定而设计的引物。
图141表示TaqMan引物对内生菌特异性基因LtmJ的功能性；RNA和DNA已标记。
图142表示TaqMan引物对内生菌特异性基因7490的功能性；RNA和DNA已标记。
图143表示TaqMan引物对内生菌特异性基因8263的功能性；RNA和DNA已标记。
图144表示TaqMan引物对内生菌特异性基因0005的功能性；RNA和DNA已标记。
图145表示TaqMan引物对内生菌特异性基因2232的功能性；RNA和DNA已标记。
图146表示TaqMan测定对照——无模板。
图147表示TaqMan测定对照——植物GAPDH。RNA和DNA已 标记。
图148表示在共提取的DNA/RNA合并样品中检测内生菌特异性基因7490；RNA和DNA已标记。
图149表示在共提取的DNA/RNA合并样品中检测内生菌特异性基因0005；RNA和DNA已标记。
图150表示用于在共提取的DNA/RNA合并样品中检测的对照(无模板)；RNA和DNA已标记。
图151表示在从单个10日龄上胚轴中共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因2232；RNA和DNA已标记。
图152表示在从单个10日龄上胚轴中共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因7490；RNA和DNA已标记。
图153表示在从单个10日龄上胚轴中共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因0005；RNA和DNA已标记。
图154表示用于在从单个10日龄上胚轴中共提取的DNA/RNA样品中检测的对照(无模板)；RNA和DNA已标记。
图155表示在从3天、5天和7日龄上胚轴池中共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因2232。圆形＝7天E+池；正方形＝5天E+池；三角形＝3天E+池；菱形＝7天E-池。
图156表示在从3天、5天和7日龄上胚轴池中共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因7490。圆形＝7天E+池；正方形＝5天E+池；三角形＝3天E+池；菱形＝7天E-池。
图157表示在从3天、5天和7日龄上胚轴池中共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因0005。圆形＝7天E+池；正方形＝5天E+池；三角形＝3天E+池；菱形＝7天E-池。
图158表示共生体种群的代谢分析，以进行从头开始的培育和选择。
图159表示前20位波胺生产的植物。
图160表示共生体种群的分子表型分型，以进行从头开始的培育和选择。
图161表示从葡萄糖生产葡萄糖-6-磷酸。
图162表示在共生体种群中水溶性碳水化合物的存在。
图163表示蛋白质定量。
图164表示种质之间的遗传多样性和相关性。
图165表示种质之间的遗传多样性和相关性。
图166表示通过测序的基因型分型。
图167表示用于通过测序的基因型分型的步骤。
图168表示现在商用黑麦草培育程序的总体计划。
图169表示大量待进行用于基因组选择研究的基因型分型和表型分型的个体需求，与具体形状的遗传性数值之间关系的总体表现。
图170表示在黑麦草培育程序中，基因组选择的执行的计划。
图171表示多年生黑麦草(Lolium perenne)中微生物组的表征。垂直轴代表在与数据库1中的非植物数据库序列比对定位之后，在全营养条件下生长的多年生黑麦草-微生物组共生体的cDNA文库中比对定位的序列的百分比(％)。水平轴代表所分析的样品：L＝叶；R＝根；FR＝无内生菌；ST＝标准毒性内生菌。
图172表示多年生黑麦草(Lolium perenne)中微生物组的16S分析。图中示出了在多年生黑麦草微生物组中具代表性的微生物在分类学上的分布。
图173表示多年生黑麦草(Lolium perenne)中叶和根微生物组。图中绘出了分别来自叶和根的序列读段计数的按照细菌分类之和。
图174表示多年生黑麦草(Lolium perenne)中叶和根微生物组。图中表示通过样品组层次聚类而产生的样品树。
图175和176表示多年生黑麦草(Lolium perenne)中叶和根微生物组。图中示出11个包含10个基因以上的聚类中的两个。图175：聚类5——低NH4诱导；图176：聚类3——低氮抑制。
图177表示多年生黑麦草(Lolium perenne)中叶和根微生物组。图中示出比对定位至被标注为固氮螺菌属(Azospirillum)属种的序列的读段。
图178表示南极洲发草(Deschampsia antarctica)中叶和根微生物组。图中示出了在南极洲发草叶和根微生物组中具代表性的微生物在分类学上的分布。
图179表示南极洲发草中叶和根微生物组。图中示出热图，显示了在芽和根中细菌物种优势(bacterial species predominance)的差异。
图180表示南极洲发草中根微生物组。图中示出热图的放大区域，显示了响应于根样品的不同营养水平的细菌物种优势的差异。
图181表示南极洲发草中叶微生物组。图中示出热图的放大区域，显示了响应于叶样品的不同营养水平的细菌物种优势的差异。
图182示出了南极洲发草中的叶和根微生物组。该图示出了热图的放大区域，显示了聚类于一起的固氮螺菌属种。
图183示出了不同稀释率下的内生菌悬液。
图184示出了全基因组关联分析，以评估宿主(15头奶牛)中624930多态性对其瘤胃微生物组特征的影响。示出了5个重叠群的结果。灰色代表奇数染色体，黑色代表偶数染色体。
本发明将通过参考下列非限制性实施例来进行描述。
实施例1——饲草育种中的新模式
旧模式：
禾本科植物的育种和选择后，仅进行单一内生菌接种和共生体评估，获得采用单一的未经选择的内生菌的合成草品种。
新模式：
禾本科植物-内生菌共生体的从头开始的育种和选择后，进行共生体评估，获得采用多种内生菌的合成共生体品种。
应用于黑麦草/羊茅和臂形草属/尾稃草属。
草-内生菌共生体的下一代从头开始的分子育种。
新的原理和方法
将合成品种的概念拓展至共生体的双方，即禾本科植物宿主和内生菌。
使用选择用于最佳共生菌相容性和性能的种群中多种内生菌和禾本 科植物的基因型。
从头开始捕获植物基因型×内生菌基因型作用。
从头开始育种和选择共生体的最佳共生体相容性和性能，而不是在培育和选择禾本科植物宿主后仅进行内生菌接种和共生体评估。
捕获和利用更多的内生菌基因型对共生体性能的作用。
利用显著的内生菌基因型对共生体性能的作用，而不局限于害虫抗性(和降低的动物中毒)。
捕获并利用全局(global)新型内生菌遗传多样性[步骤1]
从头开始使用多种新的内生菌，而非在品种发育晚期利用单一的品牌内生菌，从而利用更多的内生菌基因型多样性(即“内生菌种质集合”)。
产生并利用全新内生菌遗传多样性[步骤2]
在新的内生菌中产生全新的遗传变异[即随机诱变(如离子辐射)；双/多倍体化(如秋水仙碱处理)；定向突变(targeted mutagenesis)(如ExZact缺失和ExZact编辑(ExZact-Edit))；同源转基因；异源转基因；内源转基因；综合基因组编辑(如ExZact添加)]，以在大规模建立禾本科植物-内生菌共生体中获得加强的内生菌性状渐渗[即“育种设计者内生菌”]。
在共生体种群中捕获很多禾本科植物和内生菌基因型多样性，以进行从头开始的共生体育种[步骤3]
建立大规模的共生体种群，包括几百到几千种禾本科植物基因型中的几十到几百种内生菌基因型，以从头开始育种和选择共生体。
使用基于以下的大规模内生菌接种方法：将从直接用不同内生菌接种的分离禾本科植物胚获得人工种子，然后用海藻酸盐层包覆或者用含内生菌的海藻酸盐层包覆(即共生体人工种子)。
对于臂形草属/尾稃草属基因型，接种单一内生菌，并且还在(具体为单性生殖的)禾本科植物宿主基因型中共接种多种内生菌。从头开始进行共生体育种和选择[步骤4-8]。
将加速老化作为选择工具应用于共生体人工种子和/或其后代，选择大规模共生体种群的相容性和稳定性，所述种群包括在几百到几千种禾本科植物基因型中的几十到几百种内生菌基因型[步骤4]
通过应用快速内生菌生活力测定(rapid endophyte viability assay)，选择来自步骤4的共生体种群的生活力[步骤5]
对来自步骤5的共生体种群进行综合的多年表型分型，分析共生体性能和生物碱生产[步骤6]
从步骤6选择Syn0共生体，用于多系杂交，以产生合成的共生体实验品种[步骤7]，然后确定内生菌的发生率和种类[步骤8]。
禾本科植物-内生菌共生体的下一代从头开始的分子育种-内生菌流程
内生菌种质
步骤1：发现新型内生菌中的全球多样性(global diversity)
步骤2：全新产生新型内生菌多样性
建立共生体
步骤3：大规模产生禾本科植物-内生菌共生体
选择共生体的稳定性、目标生物碱特征和性能
步骤4：共生体稳定性的选择工具
步骤5：快速内生菌生活力测定
步骤6：共生体的多年表型分型(包括分子的)
步骤7：选择Syn0共生体亲本用于多系杂交，以产生用于综合评估的实验性合成品种
步骤8：内生菌ID测定
多系杂交Syn0共生体亲本
步骤9：在已知内生菌种类和发生率的情况下对所选共生体亲本(Syn0)进行多系杂交，并回收Syn1种子
确认共生体稳定性、生物碱特征，以及内生菌种类和发生率
步骤10：共生体稳定性的选择工具
步骤11：快速内生菌生活力测定
步骤12：共生体分子表型分型*
步骤13：内生菌ID测定*
评估Syn1共生体
步骤14：评估共生体Syn1实验合成品种的农艺学性能
*对Syn1代混合样品的生物碱特征及内生菌种类和发生率的评估
多系杂交Syn1共生体植物
步骤15：在已知内生菌种类和发生率的情况下进行共生体(Syn1)多系杂交，并回收Syn2种子
步骤16：共生体稳定性的选择工具
步骤17：快速内生菌生活力测定
步骤18：共生体分子表型分型*
步骤19：内生菌ID测定*
评估Syn2共生体
步骤20：评估共生体Syn2实验合成品种的农艺学和动物性能
*对Syn2代混合样品的生物碱特征及内生菌种类与发生率的评估
实施例2——高羊茅内生菌发现
高羊茅(Lolium arundinaceum)中内生菌的发现和表征的本研究的目的是：
1.鉴别和表征新的高羊茅内生菌，用于在种质中的评估。
2.开发和评估新型内生菌和优良种质之间的最佳联合体。
内生菌的发现是基于筛选568个种质(assession)，以鉴别内生菌阳性植物，然后对210个内生菌进行基因型分型，以鉴别高羊茅中的新型内生菌。
来自高羊茅的新型内生菌在植物中的表征是基于下述步骤：
●建立高羊茅栽培品种分生组织培养物，用于等基因宿主组；
●确定48个样品的内源代谢特征；
●对38种内生菌进行分离；
●将15-20种内生菌接种至等基因宿主组；
●对等基因宿主-内生菌联合体进行表征。
来自靶羊茅种质集合的种质中包含的内生菌基因型分析
最初，测试了来自30个国家的472个种质的内生菌发生率；每一种质的每一批中有6-10颗种子(重复2次)被用于分析，并使用6个SSR来评估内生菌发生率。
来自非代表性地理来源的新种质被包括在所述分析之中，对来自40个国家的总计568个种质测试了内生菌发生率。
表1：来自靶羊茅种质集合的种质中内生菌含量的基因型分型
表1中示出了来自靶羊茅种质集合的种质中内生菌含量的基因型分型。检测到233个内生菌阳性种质(41％)。在内生菌发生率评估中还示出了地理来源。
图2中示出了高羊茅内生菌的遗传多样性分析。所选的210个种质的组被用来评估高羊茅内生菌的遗传多样性。遗传多样性是用38个SSR标记物来评估。检测到6个不同的分类群(taxa)。大部分是苇状羊茅内生真菌。20种是FaTG-2。6种为假定的FaTG-3。13种是类FaTG-3。
图3中示出了宿主和内生菌的多样性。
图4中示出了选择羊茅-内生菌组合用于代谢特征分析(metabolic profiling)、内生菌分离和等基因接种。最初选择52个种质用于代谢特征分析和内生菌分离。在25个种质(红色)中持续检测到内生菌的存在。其他来自非代表性聚类的48个种质被建立在温室中，并被筛选内生菌的存在。20个种质为内生菌阳性(蓝色)，并且已被选择用于进一步分析。
图5中示出了选择羊茅-内生菌组合用于代谢特征分析、内生菌分离和等基因接种。初始的选择以红色示出。其他的选择以蓝色示出。
高羊茅内生菌的所需毒素特征如图6中所示。
实施例3——代谢特征分析
下文示出了用于对高羊茅-内生菌联合体的半定量代谢特征分析以检测内源宿主背景中生物碱产生的实验设计。
用于代谢产物的半定量分析的实验设计
图7中示出了用于检测麦角瓦灵和波胺的代谢特征分析。
图8中示出了所选的用于代谢产物的半定量分析的内生菌。
用于检测不同羊茅内生菌的生物碱生产的代谢特征分析
图9中示出了高羊茅-内生菌联合体的代谢分析，用于检测在内源宿主背景中的生物碱生产，包括黑麦草碱、黑麦草碱甲酸盐、波胺、麦角瓦灵和黑麦震颤素B。表2中示出了在内源宿主背景中一系列属于不同内生菌菌种的内生菌菌株的高羊茅-内生菌联合体的生物碱特征(即黑麦草碱、波胺、麦角瓦灵和黑麦震颤素B)。
表2在内源宿主背景下，一系列属于不同内生菌菌种的内生菌菌株的高羊茅-内生菌联合体的生物碱特征(即黑麦草碱、波胺、麦角瓦灵和黑麦震颤素B)(*已发表的数据；nd＝未确定)。
羊茅内生菌的其他代谢分析如图10所示。
实施例4——在温度/水胁迫下代谢特征的半定量分析
除了对在标准条件下生长的高羊茅-内生菌联合体的代谢分析，为了检测在内源宿主背景下的内生菌所赋予的生物碱生产(图7-10)，进行在高温和水胁迫条件下生长的高羊茅-内生菌联合体的代谢特征的半定量分析。相应的高羊茅-内生菌联合体是生长在16h光照和30℃、18h黑暗和20℃下，然后取样用于生物碱特征分析，如下文所述：
●采收(对照)→冷冻干燥→50mg假茎材料→80％甲醇萃取→LCMS分析
●回收和水胁迫
●二次采收(胁迫)→冷冻干燥→SSR再次确认所有的植物材料。
此过程在模拟夏季条件的受控(生长室)环境下进行，根据需要给予光照和水。每个种质9个拷贝被种植到普通栽培混合物中。使用二次取样的随机完全区组(Randomized Complete Block)。
图11示出了对在高温和水胁迫条件下生长的高羊茅-内生菌联合体的代谢特征的半定量分析。
实施例5——使用新型内生菌在高羊茅中的植物内等基因接种
如表3所示，共有36种羊茅内生菌已从一系列不同地理来源的羊茅种质中被分离，其被发现属于下述不同分类群：其中19种是苇状羊茅内生真菌；5种是FaTG-2；3种是外类群(outgroup)；3种是FaTG-3；3种是类FaTG-3；3种是钩状内生真菌。
表3从所选羊茅-内生菌组合中分离真菌培养物
用于羊茅内生菌的植物接种的多样性羊茅宿主组的分生组织培养物的建立
表4示出了所选的用于鉴别代表性的植物基因型的高羊茅和多年生黑麦草栽培品种，此植物基因型被包括在用于羊茅内生菌植物接种的多种宿主组之中。所有选择的植物基因型都具有大于80％的高再生频率。
栽培品种 基因型代 物种 特征
Bariane BARI 27 高羊茅 柔软的叶，成熟更晚，很可口
Dovey DOV 24 高羊茅 高产量，快速建立
Quantum QUAN 17 高羊茅 柔软的叶和提高的锈病抗性
Jesup JES 01 高羊茅 寒冷季节多年生饲料
Bronsyn BRO 08 多年生黑麦草 标准多年生黑麦草饲料型
表4所选的用于鉴别代表性的植物基因型的高羊茅和多年生黑麦草栽培品种，此植物基因型被包括在用于羊茅内生菌的植物内接种的多样化宿主组(diverse host panel)之中。
图12中示出了选择用于在多样化宿主组中的植物内等基因接种的来自含内生菌的羊茅种质的分离内生真菌。图13中示出了在植物内等基 因接种之前对分离的内生菌培养物进行基于SSR的基因型分型，以确定其种类。
表5中示出了SSR基因型分型结果，其说明了不同羊茅内生菌菌株的不同SSR标记物的等位基因数量和大小。
表5内生菌菌株中等位基因的存在情况
表6中示出了所选择的来自含内生菌的羊茅种质的分离内生真菌在多样化宿主组中的植物内等基因接种的结果。表6中提供了测试的接种的数量、成功接种的数量和成功接种的百分比，以说明在高羊茅和多年生黑麦草宿主中高羊茅内生菌的接种能力。
表6在高羊茅和多年生黑麦草宿主中高羊茅内生菌的接种能力
实施例6——在高羊茅和多年生黑麦草宿主基因型中内生菌的植物稳定性
在用一系列所选择的来自羊茅种质的分离内生菌进行植物内等基因接种之后，评估在不同高羊茅和多年生黑麦草宿主基因型(即BRO 08、BARI 27、DOV 24)中这些内生菌的内生菌植物稳定性，表明：
●几种高羊茅内生菌(如NEA17、NEA18、NEA19)在多年生黑麦草(BRO08)中是稳定的。
●BARI 27与除NEA15以外的所有内生菌都形成稳定的联合体。
●NEA15无法与任何所测试的宿主基因型形成稳定的联合体。
●DOV 24形成少数稳定的联合体。
在接种后12个月评估，在来自多样化宿主组的不同高羊茅和多年生黑麦草基因型中接种的新型高羊茅内生菌的这些联合体的稳定性。对应结果在表7中示出。
表7—在接种后12个月评估的，在来自多样化宿主组的不同高羊茅和多年生黑麦草基因型(BARI 27、BRO 08、DOV 24、JESS01和QUAN17)中接种的新型高羊茅内生菌(如NEA13、NEA14、NEA15、NEA16、NEA17等)的联合体的稳定性。NA：不适用；NI：未接种；稳定联合体的数目/联合体的数目
图14示出了在接种后12个月时，在来自多样化宿主组的高羊茅和多年生黑麦草基因型中所选内生菌的稳定性。
图15中示出了所选择用来进行植物内等基因接种的新型羊茅内生菌的范围。
1.表8示出了所选择用于在来自多样化宿主组的高羊茅基因型(即BARI 27、JESS01和QUAN17)中进行植物内等基因接种的其他新型高羊茅内生菌(如NEA20、NEA21、NEA22等)，其基于以下选择标准：几乎不产生或不产生麦角瓦灵。
2.不产生黑麦震颤素B。
3.产生黑麦草碱和/或波胺。
表8—所选择用于在来自多样化宿主组的高羊茅基因型(即BARI27、JESS01和QUAN17)中进行植物内等基因接种的其他新型高羊茅内生菌(如NEA20、NEA21、NEA22等)。Nco＝苇状羊茅内生真菌；？＝未测试的生物碱特征；TBI＝待接种。
实施例6—在来自多样化宿主组的高羊茅基因型中进行新型高羊茅内生菌的植物内等基因接种之后，对建立的内生菌-高羊茅联合体的代 谢特征分析
图16、18和19中示出了在来自多样化宿主组的高羊茅基因型中进行新型高羊茅内生菌的植物内等基因接种之后，对建立的高羊茅-内生菌联合体的代谢特征分析。这些图：
●比较所选内生菌在不同等基因宿主中的半定量生物碱特征；
●比较等基因宿主中不同内生菌的半定量生物碱特征；
●比较多年生黑麦草基因型Bro08中高羊茅和多年生黑麦草内生菌的半定生物碱特征。
图17示出了在来自多样化宿主组的高羊茅基因型中进行新型高羊茅内生菌的植物内等基因接种之后，建立的高羊茅-内生菌联合体中波胺和麦角瓦灵的存在。
表9示出了在来自多样化宿主组的高羊茅基因型中进行新型高羊茅内生菌的植物内等基因接种之后，对建立的高羊茅-内生菌联合体的代谢特征分析。已确认的内生菌阳性(E+)植物被分成5个重复(replicate)，并被常规修剪以促进分蘖。4个月后，E+植物以12个重复被重新栽培(re-pot)。一个月后，如果有9个以下阳性拷贝存在，则再重新栽培E+植物。每次重新栽培后，利用SSR标记物检测内生菌状态。
表9—在来自多样化宿主组的高羊茅基因型中进行新型高羊茅内生菌的植物内等基因之后建立的高羊茅-内生菌联合体，用于代谢特征分析。
在来自多样化宿主组的高羊茅基因型中进行新型高羊茅内生菌的植物内等基因接种之后建立的一系列高羊茅-内生菌联合体被选择用于代谢特征分析(表9)。总计，对29个等基因宿主-内生菌联合体按照下述实验设计进行了LCMS分析。
实验设计
●修剪并重新栽培植物
●16h光照，30℃；18h黑暗，20℃
●采收(对照)→冷冻干燥→50mg假茎材料→80％甲醇萃取→LCMS分析
●回收和水胁迫
●二次采收(胁迫)→冷冻干燥→50mg假茎材料→80％甲醇萃取→LCMS分析
在模拟夏季条件的受控(生长室)环境下对此进行确认，根据需要给予光照和水。9个拷贝/种质被种植到普通栽培混合物中。使用二次取样的随机完全区组。
实施例8——羊茅内生菌的生物保护特性
三种真菌病原体(即禾本科炭疽刺盘孢菌、凌风草德氏霉和禾谷丝核菌)——导致一系列真菌病害并感染一系列不同的植物宿主——被包括在抗真菌生物测定中，其用来分析分离的羊茅内生菌的潜在抗真菌活性。图20示出了分离的羊茅内生菌的抗真菌生物测定的结果。抗真菌生物测定的结果也在表10中示出。一系列内生菌被发现具有高度(H)和中度(M)抗真菌活性(表10)。
表10—对分离的羊茅内生菌的抗真菌生物测定
实施例9—新型高羊茅内生菌的基因组勘测测序
对一系列新型高羊茅内生菌进行基因组勘测测序(GSS)。
图21示出了对所选新型羊茅内生菌的GSS策略。进行GSS分析的新型羊茅内生菌的生物碱特征在表11中示出。
表11—测序的内生菌的生物碱特征。绿色：生物碱存在；黄色：生物碱不存在；灰色：生物碱特征未确定。
*特征来自于公开的数据
图22示出了波胺生物合成途径。PerA编码单一多功能酶，其催化所有的生物合成步骤。GenBank登录号：AB205145。非香柱菌属外类群 内生菌中PerA基因的存在情况在图23中示出。
图24示出了麦角瓦灵生物合成途径。麦角瓦灵生物合成中所涉及的eas基因簇中的基因在图25和表12中示出。dmaW基因编码DMAT合酶，其催化麦角瓦灵生物合成的第一关键步骤。新型羊茅内生菌中dmaW基因的存在情况在图26中示出，新型羊茅内生菌中eas基因簇的存在情况在图27中示出。
表12—eas基因簇中的基因
图28表示黑麦震颤素B的生物合成途径。黑麦震颤素B生物合成中所涉及的基因簇中的基因在图29和表13中示出。在内生菌中基因簇1(ItmG、ItmM和ItmK)的存在情况在图30中示出，基因簇2(ItmB、ItmQ、ItmP、ItmF和ItmC)的存在情况在图31中示出，基因簇3(ItmE和ItmJ)的存在情况在图32中示出。
表13黑麦震颤素B生物合成中所涉及的基因簇中的基因
图33示出了黑麦草碱生物合成途径。黑麦草碱生物合成中所涉及的基因簇中的基因在图34和表14中示出。在新型羊茅内生菌中黑麦草碱生物合成基因簇的存在情况在图35中示出。
表14黑麦草碱生物合成基因簇中的基因
图36示出了内生菌菌株NEA23的生物碱生物合成基因分析。表15和16示出了多种内生菌菌株的生物碱生物合成基因分析。表15示出了通过比对定位对应于不同生物碱生物合成基因/基因簇的基因组勘测序列读段(read)，评估在不同内生菌中生物碱生物合成基因的存在情况/不存在情况的结果。
表16示出了通过比对定位对应于不同生物碱生物合成基因/基因簇的基因组勘测序列读段，以及所观察到的对应高羊茅-内生菌联合体的对应生物碱特征，评估不同内生菌中生物碱生物合成基因的存在情况/不存在情况的结果。
表16—生物碱生物合成基因分析。绿色：生物碱存在；黄色：生物碱不存在；灰色：生物碱特征未确定。*特征来自于公开数据。G+＝基因/基因簇存在；G-＝基因/基因簇不存在；PG+＝基因/基因簇部分存在。表17示出了具有有利毒素特征的新型羊茅内生菌(NEA16、NEA18、NEA19、NEA20、NEA21和NEA23)。
表17—具有在生物测定中观察到的有利毒素特征和抗真菌活性的新型羊茅内生菌(NEA16、NEA18、NEA19、NEA20、NEA21和NEA23)。
*对照商用内生菌
新型羊茅内生菌NEA23和NEA21的基因型分析在图37中示出所示。
实施例10—多年生黑麦草内生菌的发现和表征
目标是：
1.鉴定和表征新型多年生黑麦草内生菌用于在种质中的评估。
2.开发和评估新型内生菌和优良种质之间的最佳联合体。
实验策略
1.鉴定和表征新型多年生黑麦草内生菌用于在专有种质中的评估。
活动：建立新型内生菌菌株的专有“文库”
●靶向种质集合
●种质样品的基因型分型；
●种质样品的代谢组学分析；
●真菌培养物的分离和接种；
●接种的植物的代谢组学分析；
●内生菌稳定性的评估。
2.开发和评估新型内生菌和优良种质之间的最佳联合体。
活动：将新型内生菌递送至种质改良过程
●所选内生菌的大规模接种；
●所选宿主-内生菌联合体的遗传分析；
●所选宿主-内生菌联合体的表型分型。
多年生黑麦草内生菌的所需毒素特征在图6中示出。
对内生菌稳定性的结果要求如下：
代间稳定性
●最大<每代5％损失
●每代的理想损失为2-3％
种子贮存稳定性
●种子中3年
黑麦草种质集合的建立，用于244个种质的内生菌发现—鉴别和建立。
图40示出了来自于靶黑麦草种质集合的种质中内生菌含量的基因型分型。
图41示出了来自于靶黑麦草种质集合的种质中内生菌含量的分析。遗传上独特；毒素产生在基于基因型预测的所需限制内。
来自所选黑麦草-内生菌联合体的真菌培养物的分离
具有所建立的候选内生菌和所确认的基因型的体外培养物；
所建立内生菌培养物的长期超低温保存。
表18所选黑麦草-内生菌联合体的真菌培养物的分离
实施例11——多年生黑麦草内生菌的等基因接种
表19—为多样化多年生黑麦草宿主组建立分生组织培养物。
图42示出了等基因宿主植物基因型栽培品种“相似性”确认。
●使用58种多年生黑麦草SSR标记物评估Bronsyn和Tolosa(96种个体)的遗传多样性。
●轻易区分Bronsyn和Tolosa栽培品种
图43示出了等基因宿主植物基因型栽培品种“相似性”确认。使用56种多年生黑麦草来源的SSR标记物，评估96种Impact、Bealey和Barsandra基因型的遗传多样性。
图44示出了开发用于宿主-内生菌联合体的QC的宿主组(host-panel)分子遗传测试。
●已鉴定了5种多年生黑麦草SSR标记物的组，来区分不同的宿主组基因型。
●等基因宿主植物和内生菌的完全QC能力
图45示出了将候选内生菌接种至多样化黑麦草宿主组的分生组织培养物中。
成熟的等基因黑麦草-内生菌联合体的再生
●用于评估内生菌接种频率的定量评分
●3种诊断性的SSR标记物被用来确定内生菌的存在和种类，并且将样品在0-3的范围内评分；
●定量评分也被用于种子纯度测试，以及内生菌的存在和种类测试。
表20—用于评估内生菌接种发生率的定量评分
所有内生菌-宿主联合体的平均接种频率为15％。
接种成功率
表21—成功接种的百分比
表22—成功接种的数量
表23—所测试的接种的总数量
图46示出了所选择的内生菌。
在优先黑麦草宿主组基因型中的内生菌植物稳定性
●在首次接种后的6-12个月(上行)对植物重新取样，在首次接种后的2年和3年(下行)再次取样。
●在所有宿主植物中NEA11内生菌高度稳定。
●NEA12表现出变化的稳定性程度。
表24—在优先黑麦草宿主组基因型中的内生菌植物稳定性
多年生黑麦草等基因接种
内生菌NEA10和NEA12接种困难，成功接种的频率较低。
NEA10仅与Impact和Bronsyn相容。
NEA12仅与Impact、Barsandra和Tolosa相容。
表25—多年生黑麦草等基因接种
内生菌NEA3、NEA2和E34尚未被成功接种。
E1广泛相容。 
NI     未接种的
表26—多年生黑麦草等基因接种
E1内生菌在优先黑麦草宿主组基因型中的植物稳定性
表27—E1内生菌在优先黑麦草宿主组基因型中的植物稳定性。植物在首次接种后6-12个月被重新取样(下行)。
等基因宿主联合体中的内生菌稳定性的总结
●观察宿主和内生菌的具体效应
-鉴别新型内生菌的稳定宿主-内生菌联合体以建立设计者联合体
■例如，Impact–NEA10；Tolosa–NEA12；Barsandra–E1
●重要的基因型×基因型(GxG)效应突出了共生体育种的重要性。
-Bronsyn和Impact表现出较高的接种成功率——更好的相容性范围；
-E1表现出高的成功接种率，具有中等的相容性；
-NEA11、NEA10和ST内生菌随时间而高度稳定；
-NEA12的植物稳定性仍是问题。
●强调维持和表征高度有价值的联合体。
实施例12—等基因宿主-内生菌联合体的代谢特征分析
a可忽视的黑麦震颤素B水平
b农业种子样品中未测量到波胺
c不同的反应：Bealey、Meridian和Source植物-/-/-；Barsandra和Barfest L/E/P。未选择做其他分析。
N.A未形成稳定的等基因宿主-内生菌联合体 
表28—等基因宿主-内生菌联合体的代谢特征分析。
新型等基因宿主-内生菌联合体的深入代谢特征分析。
图47示出了已知的生物碱及其前体的具体表征。
步骤：
1.建立用于已知生物碱(LEPJ)的半定量分析的方法。
2.比较E+与E-宿主植物的半定量生物碱(LEPJ)特征。
3.比较等基因宿主中不同内生菌的半定量生物碱特征。
4.评估不同等基因宿主中所选内生菌的生物碱(LEPJ)特征的稳定性。
利用宿主组鉴定测试来确定宿主基因型(图48)。
测试了每个宿主-内生菌联合体的10个重复。
●两株确认的内生菌阳性植物被分割成4个重复；
●植物通常被修剪以促进分蘖；
●2年后(表29第一列)—将植物重新栽培为10个重复；
●2个月后(表29第二列)—将内生菌阳性植物重新栽培为15个重复；
●利用SSR标记物测试内生菌状态。
表29—内生菌状态
表49和50示出了新型等基因宿主-内生菌联合体的深入代谢特征分析。
●每个宿主-内生菌联合体有10个重复(20×10＝200个样品)。
●完全随机区组设计。
●在受控条件下生长6周后，采收两个器官(假茎和叶)。
●在6周的再生长后进行二次采收。
●水供应：50ml/天
●14小时光照(620mmolm-2s-1光强度)/21℃
●10小时黑暗/16℃。
结果：
为了确定内生菌、宿主植物和器官类型之间的代谢差异模式，
样品分离→LC/MS分析→生物碱(LEPJ)特征
           QQQ分析   生物碱途径分析
                     生物碱分离和定量表征
目前的研究：
冷冻干燥的假茎材料
50mg冷冻干燥粉末 
在1ml甲醇:水(80:20，v:v)中萃取两次。
图51示出了LEPJ:已知生物碱。
图52示出了LEPJ的精确质量(accurate mass)。
表30—LEPJ的精确质量。
图53和54示出了LEPJ的鉴定。
图55示出了LEPJ的定量。
图56示出了E+与E-宿主植物的半定量生物碱(LEPJ)特征的比较。
图57示出了在等基因宿主(Imp04)中多种内生菌的半定量生物碱特征的比较。
图58示出了所选内生菌在不同等基因宿主中的生物碱(LEPJ)特征的稳定性评估。
●重要的基因型×基因型(G x G)效应突出了共生体育种的重要性。
●接种至相同等基因宿主中的不同内生菌之间具体的LEPJ生物碱生产有差异。
●例如，接种至Impact(Imp04)中的NEA11，与接种至相同宿主基因型中的NEA10相比，产生更多波胺和更少麦角瓦灵。
●包含相同内生菌的不同宿主植物之间LEPJ生物碱生产有差异，表明宿主基因型效应。
●例如，在用ST和NEA11接种的Bealey(Bea02)和Barsandra(San02)中未检测到麦角瓦灵；在用相同内生菌接种Bronsyn(Bro08)中检测到相对较高量的麦角瓦灵。
对与描述相符并且在种质池中稳定的内生菌的评估。
遗传因子含量(genic content)可用于预测黑麦震颤素B的存在/不存在。
半定量LCMS可用来评估种质池中LEPJ的相对量。
●NEA12与某些种质背景形成稳定的联合体，在所评估的宿主中产生J，但不产生LEP并表现出广谱抗真菌活性。
●NEA11是一种高度相容的内生菌，其在一系列宿主背景下与ST相比产生较少的P和较多的E，但是不产生LJ。
●E1是一种高度相容的内生菌，其在Imp04中不产生LEPJ，但在Bro08中产生J。
●NEA10在有限的宿主背景下形成稳定的联合体，并且与NEA11(以及根据推断，ST)相比产生更多的E和更少的P。
表31—用来评估种质池中LEPJ的相对量的半定量LCMS。
途径分析
●已知在多年生黑麦草内生真菌中的黑麦震颤素B和麦角瓦灵生物合成途径。
●进行途径分析，以确定基因缺失是否会导致已知生物碱(LEPJ)前体产生的改变，并且直接流向其他已知毒素的合成。
图59示出了黑麦震颤素B生物合成。
图61示出了黑麦震颤素B生物合成途径的分析。
图62示出了雀稗宁——一种震颤原途径。
图63示出了一种途径分析：雀稗宁——一种震颤原。
图64示出了共生体中黑麦震颤素和雀稗宁的存在。
表37—共生体中黑麦震颤素的存在
表38—共生体中雀稗宁的存在
图65示出了在不存在产生波胺的内生菌的情况下，波胺在植物中以痕量存在。
实施例13——内生菌对共生体性能的作用
在等基因宿主背景下，内生菌对共生体性能的影响的评估是通过以下测定来完成：
·    分蘖数量
·    芽重量
·    根重量
·    根长度
·    根:芽比值
图66表示用来评估由内生菌所介导的宿主表型变化的过程。
图67表示内生菌对共生体性能的影响。
ANOVA
·内生菌对所有测定性状的重要影响；
·无重要的结合内生菌/硝酸盐效应
·硝酸盐对内生菌植物稳定性无效应
表40—在等基因宿主背景下，内生菌对共生体性能的影响的评估是通过以下测定来完成：第3列：分蘖数量；第4列：芽鲜重(g)；第5列：根长度(cm)；第6列：根鲜重(g)。
每个等基因联合体的8个重复被评估表型性能。
植物被种植在沙子盆中4周以建立
第4周进行处理：干旱和水涝
8周时第一次采收
12周时第二次采收
图68表示T1采收之前的植物。
图69表示通过分蘖数量测定的性能。
重要的基因型×基因型(G×G)效应
·宿主植物之间重要的变异
·内生菌对性能的重要影响
实施例14——内生菌基因组勘测测序
不同测序平台中性能进展
Roche 454
·400-500bp读段
·每次运行100万个读段
·12x覆盖度
Illumina GAIIx
·150bp双端读段
·每个流动槽8条泳道
·每个泳道2000万双端读段
·每个泳道12个样品
·每个样品10x覆盖度
Illumina HiSeq 2000
·100bp双端读段
·每个流动槽8条泳道
·每次运行2个流动槽
·每个泳道2亿5000万双端读段
·每个泳道24个样品
·每个样品20-30x覆盖度
内生真菌属内生菌的泛基因组分析
利用454测序平台的序列分析
10个多年生黑麦草内生真菌和非多年生黑麦草内生真菌基因组被测序
产生多年生黑麦草内生真菌的参考基因组
包括基因含量的细胞核结构被表征
种内多态性被鉴定，突出测序不同多年生黑麦草内生真菌基因组的重要性。
某些毒素代谢多样性和基因缺失-增加之间的关系被确定。
与相关有性形式的对比揭示出来自两个谱系的基因缺失是表型多样性的一种来源。
与麦角菌科另一个成员的线粒体基因组的对比揭示出其是高度保守的，具有由基因间隔区和内含子区域的插入缺失导致的基因组大小差异。
图70表示利用454测序平台的序列分析。
利用Illumina测序平台的序列分析
23种多年生黑麦草内生菌菌株被测序：
·16多年生黑麦草内生真菌
·3LpTG-2
·4非多年生黑麦草内生真菌
参考基因组构建——ST
多年生黑麦草内生菌多样性的代表用于泛基因组分析
现在的商用内生菌
NEA2、NEA3、NEA4、AR1
未来(潜在的)商用内生菌
NEA10、NEA11、NEA12、E1
遗传多样性的聚类内分析
来自不同地理来源的内生菌
·ST(萨姆森草原)–NA6(摩洛哥)和C9(西班牙)来自相同地理来源的内生菌
·NEA12(法国)——15310和15311
图71表示利用Illumina测序平台的序列分析。
图72表示已测序的多年生黑麦草内生菌基因组的总结。
图73表示已测序的多年生黑麦草内生菌基因组的总结。
关键研究活动
·纳入GAll和HiSeq数据，以拼接并比对定位多种内生菌菌株和基因。
·完成ST内生菌参考基因组的序列拼接。
·“相同”菌株的高分辨基因组序列分析。
·代表多年生黑麦草内生菌多样性的内生菌菌株的泛基因组序列分析。
多年生黑麦草内生真菌标准毒性参考基因组完善和泛基因组分析
·直到最近，所有的基因组测序都是通过Roche 454平台来进行的。
·现在，还可从一个独立的平台(Illumina GAII&HiSeq2000)获得大量内生菌菌株和物种的其他序列数据。
·这很有用，因为两种方法使用的是根本上不同的测序化学，因此一种可作为另一种的补充。
·多年生黑麦草内生真菌标准毒性(ST)是参考菌株，本发明人拥有其最多的454序列数据。
·使用此内生菌的两组数据有什么收获？
图74-78表示Illumina读段和454重叠群的对比。图74表示Illumina数据总体上确认454数据。图75表示Illumina数据能够更正454均聚合物的错误。图76表示来自其他菌株的Illumina数据鉴定了菌株特异性单核苷酸多态性(SNP)。图77表示来自其他物种的Illumina数据鉴定了双重复/三重复基因(如FEtc7-58)的单倍型。图78表示三重复基因，如FEtc7-58。
图像交互查阅和分析：读段水平
图79表示454FLX、454Titanium、Illumina GAll覆盖度展示。
图80表示454FLX、454Titanium、Illumina GAll、Hi Seq覆盖度展示。
图81表示均聚物校正：图像视图。
图82表示均聚物校正：碱基视图。
图83表示泛基因组SNP识别：图像视图，读段水平。
图84表示77次独立测序运行，通过相似性排列。其能够展示普通的SNPs。
图85表示独立测序运行还能够展示菌株特异性缺失。
图86表示独立测序运行能够从SNP数据预测氨基酸改变。
利用Illumina数据来完善454序列拼接
方法
·利用Newbler(罗氏拼接软件)完成拼接，并利用来自Illumina序列数据(接合配对、读段深度等)和Newbler拼接数据(重叠群之间的连接、高度相似重叠群)的信息进行完善。
·一些定义：
重叠群  连续的确定的拼接序列
支架  包含多于一个重叠群的序列，重叠群之间的连接和相对于彼此的方向为已知的，但重叠群通过未知的序列连接。
N50  重叠群的长度，其中50％的总拼接长度被包含于比此长度更长的重叠群中。
图87表示重叠群的数量随着拼接完善的次数而减少。
图88表示N50随着拼接完善的次数而增加。
图89表示拼接完善减少了支架的数量和单个“未组成支架的”重叠群数量。
图90表示每个重叠群中的平均碱基数随着拼接完善而增加。
ST内生菌的参考基因组序列拼接的现状
2494个重叠群，总计33804495bp；
这些重叠群中的1496个在449个支架中，最大的为395697bp，总计25953091bp；
998个单个“未组成支架的”重叠群，其中包含7851404bp；
Augustus基因预测程序预测10821个编码蛋白的基因。
ST参考基因组为产生其他多年生黑麦草内生真菌和相关真菌的泛基因组提供了基础。
候选内生菌状况的评定
之前的候选评估过程：
–鉴定E+种质(77)；
–鉴定新型、遗传多样化的内生菌基因型；
–鉴定42种主要的候选内生菌，进行内源宿主背景下的代谢特征分析；
–去掉产生黑麦震颤素B的候选内生菌(29)；
–去掉重复的内生菌基因型(5)；
–鉴定8种主要的候选内生菌用作进一步研究。
a＝在内源背景下可忽略的水平
b＝不能从原始来源植物中分离
c＝接种至等基因组但不稳定
d＝难以接种至等基因组
表41候选内生菌状况的综述
在大规模建立用于从头选择的禾本科植物-内生菌共生体的新模式中，有可能考虑15931和F2内生菌。
实施例15——通过诱变产生新型设计者内生真菌属内生菌突变体菌株的评定
此工作的目的是，通过诱导多倍体化和诱变，产生多年生黑麦草内生菌(Neotyphodium lolii)的新型突变体，使禾本科植物宿主-内生菌变体联合体具有想要的特性，如增强的生物活性(例如，抗真菌活性)，和/或改变的植物定殖能力和稳定性(例如，改变的体外生长)，和/或相应的禾本科植物宿主-内生菌变体联合体的改变的生长性能(例如，增强的植物活力、增强的干旱耐受、增强的水利用效率)。此禾本科植物宿主-内生菌突变体联合体被称为新型“设计者”禾本科植物-内生菌联合体。
通过诱变产生和表征新型设计者内生真菌属内生菌变体菌株的实验策略
实验内容因此包括：
1.建立新型“设计者”禾本科植物-内生菌联合体的表型筛选，例如：
·增强的生物胁迫耐受；
·增强的干旱耐受和增强的水利用效率；
·增强的植物活力。
2.新型“设计者”内生菌的靶向产生(即多倍体化和X射线诱变)和表征(即抗真菌生物测定、体外生长率、基因组勘测测序(GSS))。
3.“设计者”禾本科植物-内生菌联合体的育种
·将“设计者”内生菌接种至禾本科植物(如多年生黑麦草)种质的发育过程。
建立新型“设计者”禾本科植物-内生菌联合体的表型筛选
利用NEA12对增强的生物胁迫耐受的评估如图92和93所示。图92表示评估内生真菌属内生菌的抗真菌活性的体外生物测定。图93表示离脱叶测定，以评估对禾冠锈病(Puccinia coronata f.sp.Lolii)的抗性。
对增强的干旱耐受和增强的水利用效率的评估如图94所示。此过程包括温室和野外试验筛选，其针对干旱耐受、存活和恢复、干旱后重新生长、代谢特征分析和多种性状剖析(基于与植物形态学、植物生理学、植物生物化学相关的评估和测量)。
通过多倍体化产生“设计者”多年生黑麦草内生真菌基因型
此过程包括不利用转基因技术产生内生真菌属内生菌的新型变异。秋水仙碱已被广泛和成功用于植物(如多年生黑麦草)中的染色体加倍。它在有丝分裂中抑制染色体分离，诱导自动多倍体化(染色体加倍，参见图95)。此过程使得能够通过诱导的染色体加倍产生新型内生菌，并且可应用于产生人工多倍体内生菌。
染色体加倍的实验流程如图96所示。
图97表示流式细胞术校准，以用于评估内生真菌属内生菌中DNA含量。峰值表明相关细胞核DNA含量。
NEA12dh菌株的流式细胞术分析如图98和表42所示。
1.ST是高度稳定、广泛相容的。
2.NEA12只产生微紫青霉颤素。
3.AR1只产生波胺。 
表42经受秋水仙碱处理(在不同的浓度百分比下)的经秋水仙碱处理的内生菌菌株(ST、NEA12和AR1)，导致回收用于流式细胞术分析的菌落(菌落的#)。
NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株体外生长的分析
NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株在体外培养8周后的生长速率分析如图99所示。在首次筛选中，对变异的分析鉴定出两种NEA12dh内生真菌突变内生菌菌株(NEA12dh17和NEA12dh4)，其与对照NEA12内生菌相比表现出不同的体外生长速率：
NEA12dh17生长明显加快(p<0.01**)；
NEA12dh4生长明显减慢(p<0.05*)。
NEA12dh内生真菌属变体内生菌菌株在体外培养5周后的生长速率分析如图100所示。在一个确认筛选中，学生t检验鉴定出两种NEA12dh内生真菌属变体内生菌菌株(NEA12dh17和NEA12dh15)，其与对照NEA12内生菌相比表现出不同的体外生长速率：
NEA12dh17生长明显加快(p<0.01**)；
NEA12dh15生长明显减慢(p<0.05*)。
NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株的抗真菌生物测定
一系列真菌病原体(导致一系列真菌病害，并感染一系列不同的植物宿主)被包括在抗真菌生物测定中，其用来分析NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株，以评估这些菌株的抗真菌活性谱，如表43所示。
表43真菌病原体(导致一系列真菌病害，并感染一系列不同的植 物宿主)被包括在抗真菌生物测定中，其用来分析NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株，以评估这些菌株的抗真菌活性谱。
NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株的抗真菌生物测定如图101和图102所示。对20种NEA12dh菌株进行了抗真菌活性改变的筛选。4种NEA12dh菌株(即dh5、dh6、dh13和dh14)被鉴定为具有比NEA12更高的抗真菌活性。
NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株的基因组勘测测序和序列分析
对具有增强的抗真菌活性、表现出更快的体外生长速率和更高的DNA含量的NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株进行基因组勘测测序(GSS)。获得了10种NEA12dh菌株和对照NEA12菌株的序列数据(在表44中以蓝色突出显示)。
表44一系列NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株与对照NEA12菌株相比，表现出不同的抗真菌活性[高于对照或等于对照(标准，Std)]，以及不同的体外生长速率[比对照慢，比对照快或等于对照(标准，Std)]。
NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株获得自秋水仙碱处理的NEA12对照菌株(在表44中以蓝色突出显示)，将从突变菌株获得的基因组勘测序列(GSS)数据按照下述步骤分析：
·从头拼接来自NEA12对照菌株的GSS数据，其作为参考基因组序列，用于分析NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株；
·对来自NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株的GSS数据序列读段，比对定位至NEA12参考基因组序列；
·鉴定潜在的复制区域，即具有比希望的序列覆盖度更高的区域；
·鉴定已被复制的基因序列。
NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株GSS读段深度的分析如图103所示。对似乎具有比希望读段深度更高的读段深度的序列重叠群的分析表明，没有主要的复制事件发生(除了全基因组事件)。这些重叠群的读段深度模式在不同菌株中是不同的。这表明NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株与对照NEA12菌株之间存在差异。
对NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株和对照NEA12菌株GSS序列拼接分析如表45所示。
菌株 #重叠群 N50 最大重叠群 #碱基
NEA12 143202 28621 181461 32734984
NEA12dh5 305031 29444 191191 30994592
NEA12dh17 274394 37802 209957 30777017
NEA12dh18 282692 30717 177813 30889903
表45对NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株和对照NEA12菌株的GSS序列拼接分析。
通过利用与用于对照NEA12内生菌菌株的基因组序列拼接相同的参数，进行独立的从头开始序列拼接。序列拼接统计中的差异可能表明菌株之间的基因组差异。所获得的NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株的且用于序列拼接的GSS数据，表明更少的碱基被并入序列拼接，并产生更多的序列重叠群。更小的序列重叠群的数量增加可能是由转座子移动/复制所导致。
比对定位至NEA12基因组序列拼接的序列读段的分析如图104所示。尽管本发明人不希望被理论所限制，如果基因组相同，则应预期比对定位至参考基因组序列的序列读段的数量没有差异。NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株中比对定位至NEA12序列重叠群的序列读段中有35-70％的大小大于5kb。NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株和对照 NEA12菌株的基因组序列之间存在差异。
通过基于秋水仙碱处理的诱变产生并表征新型“设计者”内生真菌属突变内生菌菌株的结果总结
与对照NEA12菌株相对比，在NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株中分析序列读段深度的改变。尽管没有检测到大的局部基因组序列复制事件，根据GSS序列分析不能排除NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株中全基因组复制事件的发生。
根据从NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株获得的GSS数据，独立进行从头序列拼接。序列拼接统计中的差异表明NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株中的基因组变化是由秋水仙碱处理导致。比对定位至NEA12参考基因组序列的NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株的序列读段的数量在不同菌株间有差异。对NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株进行的所有GSS数据分析表明了基因组差异。
总之，以下新型“设计者”内生菌是通过对NEA12内生菌的秋水仙碱处理而产生：
·4种具有增强的生物保护特性(即抗真菌生物活性)的NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株(dh5、dh6、dh13和dh14)；
·一种比对照NEA12菌株具有更高体外生长速率(即潜在具有增强的稳定性/宿主定殖能力)的NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株(dh17)；
·10种进行了基因组勘测测序的NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株(包括dh5、dh6、dh13、dh14和dh17)和对照NEA12菌株；和
·5种被选出并进行植物中等基因接种的NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株(包括dh5、dh13和dh17)。
用NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株在多年生黑麦草中的植物中等基因接种
以下NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株和对照NEA12菌株被用于在多年生黑麦草中的植物等基因接种：NEA12
NEA12dh5  高抗真菌活性
NEA12dh13  高抗真菌活性
NEA12dh4   生长缓慢
NEA12dh15  生长缓慢
NEA12dh17  生长快速
表46：用NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株在多年生黑麦草基因型(IMP04和TOL03)中的等基因接种。数字表示用不同的NEA12dh内生真菌属突变内生菌菌株进行等基因接种的两种基因型的多年生黑麦草的数量。
通过X射线诱变产生“设计者”多年生黑麦草内生真菌基因型
通过X射线诱变产生“设计者”内生真菌属内生菌基因型提供了产生新型内生菌突变菌株的机会，此突变菌株具有增强的特性，如在禾本科植物宿主中增强的稳定性、更广泛的宿主相容性以及改善的毒素特征，例如，以下在高度稳定和广泛相容的ST内生菌中去除有害的生物碱黑麦震颤素B的产生。
此类新型“设计者”内生菌将比现存的商用内生菌(如AR1和AR37)更具优势，因为其是高度稳定、广泛相容并且具有最佳的毒素特征。
图105表示X射线诱变内生菌菌株的实验流程。
图106表示吲哚二萜生物合成途径。黑麦震颤素B是导致食草动物的一种疾病——黑麦草蹒跚病的主要毒素。3个基因簇中的10个基因为黑麦震颤素生物合成所必需。本发明人将最初的分析集中在3个分别来自每个基因簇的Ltm基因上。设计并完成优化的多重PCR分析。
X射线照射的多年生黑麦草内生真菌菌株筛选
在初级主要筛选中，X射线照射的多年生黑麦草内生真菌(被建立 为通过X射线诱变诱导的多年生黑麦草内生真菌内生菌的新型变异的初始来源，代表被诱变的多年生黑麦草内生真菌内生菌菌株集合)的超过5000个菌落被通过多重PCR分析筛选靶Ltm基因的存在，初步鉴定了约140个假定的黑麦震颤素B基因簇PCR阴性菌落(约占所筛选的5000个菌落的2.5％)。在次级筛选中，提取高品质的DNA(140个液体培养物)并进行PCR分析。鉴定出两种假定的黑麦震颤素B基因之一(Ltm J)的缺失突变体。
表47经30Gy剂量照射而获得的假定的X射线照射诱导的多年生黑麦草内生真菌的ltm基因缺失突变体。菌落数字代表假定的X射线照射诱导的ltm基因缺失突变体独特的标识(即139-6和145-15)。黑色代表各自ltm基因分析的PCR阴性结果，灰色代表各自ltm基因分析的PCR阳性结果。
“设计者”X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株的抗真菌生物测定
有8种经X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株(即获得自X射线诱变的突变菌株1-35、4-7、7-22、7-47、123-20、124-6、139-6、144-16和145-15)和一种对照多年生黑麦草内生真菌菌株(即ST内生菌菌株)。
抗真菌生物测定中包括5种真菌病原体(其导致一系列真菌病害并感染一系列不同的植物宿主)，用来分析X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株，如下：
■马齿苋离蠕孢菌
■禾本科炭疽刺盘孢菌
■凌风草德氏霉
■高粱茎点霉
■禾谷丝核菌
■
与观察到的对照ST内生菌菌株的抗真菌活性谱相比，未观察到被测试的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株的抗真菌活性的明显差异。
“设计者”X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株的体外生长
对“设计者”X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株的体外生长速率的分析结果如图107所示，在第5周时进行与对照ST菌株相比X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株体外生长的统计学分析，揭示出体外生长速率的明显差异，如下所示：
p<0.05*(X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株139-6)
p<0.01**(所有其他突变菌株)
“设计者”X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株的基因组勘测测序
对8种X射线照射的多年生黑麦草内生真菌ST突变菌株和相应的对照ST菌株进行基因组勘测测序(GSS)，获得不同菌株的基因组序列覆盖度为46倍-79倍，如表48所示。
表48对8种X射线照射的多年生黑麦草内生真菌ST突变菌株和相应的对照ST菌株进行基因组勘测测序而获得的基因组序列覆盖度。
检测“设计者”X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株的基因组序列变异
检测X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株的基因组序列变异的分析结果如图109所示。检测单核苷酸多态性(SNPs)的相应结果如图110所示，检测小插入/缺失片段(INDEL)的结果如图111所示。X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变菌株中序列读段深度和成对插入片段大小的差异如图112所示。
Ltm基因簇序列分析结果如图108所示。在Ltm基因簇的编码序列或调控序列未发现大或小的缺失。在Ltm基因簇的编码序列或调控序列未发现单核苷酸多态性(SNPs)、插入或易位。
在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌突变菌株中检测到的基因组序列改变谱
图113表示在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株的基因区域检测到的单核苷酸多态性(SNP)的数量。在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株中，以及与对照ST菌株相比，SNP的数量有很大差异。与对照ST菌株相比，所有的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株在基因区域中每Mb都有两倍以上的SNP数量。X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株每Mb平均有6个SNP，而对照ST菌株每Mb平均有2个SNP。
图114表示在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株的基因区域中INDEL的数量。所有的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株在基因区域中都比对照ST菌株包含更多的INDEL。X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株与对照ST菌株的INDEL数量差异平均为每Mb 134INDEL。当根据照射处理(即应用的照射剂量和重复照射的次数)进行分组时，在10Gy*2处理时似乎出现INDEL数量的峰值，这与SNP检测分析获得的结果相一致。
图115表示在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株中检测到的以缺失形式表示的基因组序列改变的谱。
表49表示在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体 菌株中检测到的这些基因组序列缺失中的一些的实例。
表49在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株的基因组序列中检测到的缺失。粗体表示通过序列读段覆盖度的改变确认的缺失。其余是潜在的转座子缺失。
X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株#7_47，其通过对多年生黑麦草内生真菌ST内生菌以10Gy剂量进行两次X射线照射(10Gy*2)而产生，具有数量最多的大缺失。
在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株的基因组中缺失序列的注释
X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株1_35：
在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株1_35中，检测到下列在重叠群ST454contig00831中长度约为4400-8000bp的缺失序列，此基因组序列区域包含以下两个预测的基因：
1)ref|XP_386347.1|假定蛋白FG06171.1[赤霉菌660x0.0]gb|EAW12630.1|DUF500域蛋白[曲霉菌NRRL 1]；253x9e-66，和ST454contig00831_AUGUSTUS_gene_3958：4728(183letters)；和
2)gb|EAW13545.1|2,3-环核苷酸2-磷酸二酯酶[曲霉菌32x2.4]
X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变菌菌株7_47：
在X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变菌菌株7_47中，检测到下列在重叠群ST454contig01082、ST454contig01131和ST454contig02985中的缺失序列，这些基因组序列区域不包含预测基因：
查询＝ST454contig01082长度＝9120读段数＝287
gb|AAA21442.1|假定的pol多聚蛋白[稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)]1451e-32
查询＝ST454contig02985长度＝2414读段数＝99
gb|AAA21442.1|假定的pol多聚蛋白[稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)]922e-17
X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株的诱变指数
图116表示在通过对多年生黑麦草内生真菌进行不同照射水平的X射线照射而获得的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株的基因区域中，每Mb的SNP和Indel。菌株1_35有3.6kb的缺失；菌株7_47有3处缺失(长度为4.2kb、1kb、0.6kb)。菌株124_6有部分复制。菌株139_6和145_15有部分复制。
考虑到ST内生菌每Mb约有443.5个基因，利用10Gy*2处理，预期的SNP/INDEL在基因组中的发生率为每个基因0.33。
总结
分析X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株中多种类型的基因组序列变异，即缺失、SNP、INDEL、倒位和易位。SNP、 INDEL、缺失和复制是在对X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株的基因组勘测序列中被鉴定。对多年生黑麦草内生真菌ST内生菌进行10Gy*2X射线照射处理，从中回收的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株中SNP和INDEL的数量出现明显的峰值。X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异缺失突变体菌株7_47有3处大缺失。这说明此基于X射线照射的诱变方法能用来产生新型“设计者”内生真菌属内生菌菌株，并实现：
·获得自对ST多年生黑麦草内生真菌内生菌的X射线照射的5000个X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌菌株被筛选；
·140个假定的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变体菌株被鉴定；
·对9个X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变体菌株进行抗真菌生物测定；
·对9个X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变体菌株进行体外生长测定；
·对9个X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变体菌株进行基因组勘测测序；
·2个具有基因缺失的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变体菌株(1_35和7_47)被鉴定；和
·3个具有基因复制的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变体菌株(124_6、139_6和145_15)被鉴定。
用X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变菌株在多年生黑麦草中的植物等基因接种
表50用X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变体 菌株在多年生黑麦草基因型(IMP04和TOL03)中的等基因接种。数字表示用不同的X射线照射的多年生黑麦草内生真菌变异内生菌突变体菌株进行等基因接种的两种基因型的多年生黑麦草的数量。
通过秋水仙碱处理获得的NEA12dh和通过X射线照射获得的内生真菌属变异内生菌菌株的代谢特征分析
通过秋水仙碱处理获得的NEA12dh内生菌变异菌株的代谢特征分析的结果如图117所示。
通过X射线照射处理获得的多年生黑麦草内生真菌ST内生菌变异菌株的代谢特征分析的结果如图118所示。
使以下内生菌在PDB上生长3周：
■对照多年生黑麦草内生真菌ST内生菌菌株；
■通过X射线照射处理获得的多年生黑麦草内生真菌ST内生菌变异菌株4-7；
■通过X射线照射处理获得的多年生黑麦草内生真菌ST内生菌变异菌株139-6；
■通过X射线照射处理获得的多年生黑麦草内生真菌ST内生菌变异菌株144-16；
■通过X射线照射处理获得的多年生黑麦草内生真菌ST内生菌变异菌株145-15。
并且对其进行利用LCMS对以下进行的代谢特征分析：
1.滤液；
2.菌丝体提取物。
单独使用菌丝体提取物或滤液，能轻易将通过X射线照射处理获得的多年生黑麦草内生真菌ST内生菌变异菌株与对照多年生黑麦草内生真菌ST菌株区分开。
实施例16——用于大规模生产禾本科植物-内生菌共生体(人工种子)的方法
此工作的目的是开发有效、稳健和低成本的方法，用于大规模生产禾本科植物-内生菌共生体。此方法应该：
a)适用于将几十到几百种内生菌接种到几百到几千种禾本科植物 基因型中；
b)适用于多年生黑麦草、高羊茅和臂形草属；以及
c)适用于接种新型和“设计者”内生菌，其具有重新产生的遗传变异[即诱导突变(离子辐射、秋水仙碱)、定向突变、异源转基因、同源转基因、内源转基因等)。
此方法还应使得能够进行禾本科植物-内生菌共生体的下一代从头开始的分子育种、选择和评估(而非仅是培育和选择禾本科植物宿主，以及随后接种内生菌和评估共生体)。
所完成的实验策略—和相应的实验步骤—包括：
1.大规模的从多年生黑麦草种子获得的胚的分离和人工种子生产
A.研发一种高效、成本低、大规模的种子表面灭菌方法；
B.研发一种高效、成本低、大规模的从种子获得的胚分离方法；
C.研发一种高效、成本低、大规模的人工种子产生方法；
D.测试人工种子的发芽频率和发芽阶段；
E.用从包含内生菌的种子分离出的胚制成人工种子，评估从人工种子衍生的幼苗中内生菌的存在；
2.大规模的内生菌接种至多年生黑麦草人工种子
F.开发一种高效、成本低、大规模的内生菌接种方法，用于人工种子[用内生菌菌丝体接种从种子获得的人工胚，然后进行人工种子生产，包括人工种子的双层/多层包覆(内层含内生菌，外层为“假糊粉/胚乳”)]；和
E.从用新型内生菌接种的不含内生菌的种子分离的胚制成人工种子，评估从人工种子衍生的幼苗中内生菌的存在。
大规模的从多年生黑麦草种子获取的胚的分离和人工种子生产
种子表面灭菌方法
所进行的种子表面灭菌方法包括以下步骤：
第1天：将种子浸泡在10％的硫酸O/N中
第2天：用10％的Domestos处理20分钟，用无菌蒸馏水清洗后贮存于24℃。
第3天：用10％的Domestos处理20分钟，用无菌蒸馏水清洗后贮 存于24℃，然后进行胚分离(参见下文B))。
进行4次独立的实验，每次处理200个种子。
未观测到细菌或真菌污染。
胚分离方法
根据以上成功的种子灭菌方法(参见上文A))，1个人能在4小时内分离出1000个黑麦草种子来源的胚。
人工种子生产方法
将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子
i)具有未添加营养成分的海藻酸钙基质的包衣
使用具有未添加营养成分的海藻酸钙基质的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子，实施以下步骤：
·新鲜分离的胚并将其与3％海藻酸钠溶液混合；
·将海藻酸盐液滴置于50mM氯化钙溶液中，同时以60rpm搅拌，每个液滴包含一个胚；
·搅拌15分钟后收集人工种子，用足量的无菌蒸馏水清洗。
将人工种子放置在发芽培养基MS或MS+1mg/L BAP上。
图119表示通过使用具有未添加营养成分的海藻酸钙基质的包衣多年生黑麦草胚进行海藻酸钙包覆产生的人工种子。
ii)具有添加了营养成分的海藻酸钙基质的包衣
使用具有添加了营养成分的海藻酸钙基质的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子，实施以下步骤：
·新鲜分离胚并将且在改良MS培养基(由MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES组成)中与3％海藻酸钠溶液混合；
·将海藻酸盐液滴(包含单个胚)置于50mM氯化钙溶液中，同时以60rpm搅拌；
·每个液滴包含一个从种子获得的分离的胚；
·搅拌15分钟后收集人工种子，用无菌蒸馏水介质充分清洗；
·将人工种子放置在用于发芽的MS培养基平板上。
iii)具有有色海藻酸钙基质的包衣
使用具有添加了营养成分的有色海藻酸钙基质的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子，实施以下步骤：
·新鲜分离胚并将其在改良MS培养基(由MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES组成)中与3％海藻酸钠溶液混合；
·将不同的食物染料(即10μL/ml王后绿(90610)或王后粉(92330))加入海藻酸钠包衣溶液中，使包衣基质着色，因此为说明多层包覆潜力建立了基础；
·将海藻酸盐液滴(包含单个胚)置于50mM氯化钙溶液中，同时以60rpm搅拌；
·每个液滴包含一个从种子获得的分离的胚；
·搅拌15分钟后收集人工种子，用无菌蒸馏水介质充分清洗；
·将人工种子放置在用于发芽的MS培养基平板上。
图120表示使用具有有色海藻酸钙基质的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子。
iv)具有多层海藻酸钙基质层的包衣
使用具有多层海藻酸钙基质层的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子，实施以下步骤：
·新鲜分离胚并将其在改良MS培养基(由MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES组成)中与作为第一包衣层(层A)的3％海藻酸钠溶液混合，以制备人工种子；
·将海藻酸盐液滴(包含单个胚)置于50mM氯化钙溶液中，同时以60rpm搅拌；每个液滴包含一个从种子获得的分离的胚；
·搅拌15分钟后收集用层A包覆的人工种子，用无菌蒸馏水介质充分清洗；用层A新鲜包覆的人工种子的平均直径为4毫米。将用层A包覆的人工种子置于培养皿中，在层流柜中进行1-2小时的空气干燥。空气干燥后的层A包覆的人工种子的直径是2毫米；
·在用食物染料(即10μL/ml王后绿(90610))的改良MS培养基(由MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES 组成)中将空气干燥后的层A包覆的人工种子与作为第二包衣层(层B)的3％海藻酸钠溶液混合，以按照相同的步骤制备双层包覆的人工种子。
图121表示使用具有多层海藻酸钙基质层的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子。
图122表示使用具有多层海藻酸钙基质层的包衣，将多年生黑麦草胚以海藻酸钙包覆成人工种子。多年生黑麦草的新鲜分离的从种子获得的胚被单个放置于a)96孔板或b)384孔板的孔中。利用一次性注射器将海藻酸钠加入到单个孔中，并将海藻酸盐溶液中的单个胚吸入注射器。利用一次性注射器将包覆了海藻酸盐溶液的单个胚加入到搅拌中的聚合氯化钙溶液中，以产生人工种子。在产生多年生黑麦草人工种子方面，96孔板比384孔板更优。
评估人工种子的发芽频率
为了评估人工种子的发芽频率，实施以下步骤：
多年生黑麦草栽培变种Bronsyn E-(无内生菌，2668种子批次)的种子、胚和人工种子的发芽
对以下种子的发芽频率进行比较性评估(图123)：
a)原始种子：在滤纸上1％发芽频率； 
b)表面灭菌的种子：在滤纸上10％发芽频率； 
c)分离的胚：在发芽培养基上48％发芽频率； 
d)人工种子(和发芽培养基)：在MS培养基上40％发芽频率。 
多年生黑麦草栽培变种Bronsyn E+(有内生菌，2667种子批次)的种子、胚和人工种子的发芽
对以下种子的发芽频率进行比较性评估(图124)：
a)原始种子：在滤纸上10％发芽频率； 
b)表面灭菌的种子：在滤纸上30％发芽频率； 
c)分离的胚：在发芽培养基上90％发芽频率； 
d)人工种子(和发芽培养基)：在MS培养基上81％发芽频率。 
图125表示多年生黑麦草人工种子的发芽和衍生自人工种子的幼苗的发育。
评估衍生自人工种子的幼苗中内生菌的存在
为了评估衍生自人工种子的幼苗中内生菌的存在，实施以下实验：
衍生自多年生黑麦草栽培变种Bronsyn E+(有内生菌，2667种子批次)的种子和人工种子的幼苗中内生菌的存在
将20个在滤纸上发芽Bronsyn E+(2667)种子的幼苗转移到土壤中。
将衍生自萌发的用来自Bronsyn E+(2667)种子的胚制成的人工种子的25个幼苗转移到土壤中。人工种子中的胚用10％H2SO4过夜处理而灭菌。
衍生自种子和人工种子的幼苗长出6周后，根据内生菌特异性SSR测试评估内生菌的存在。
将20个在滤纸上发芽的Bronsyn E+(2667；包含ST内生菌)种子的幼苗转移到土壤中，在内生菌特异性SSR测试中，19个幼苗中有13个对ST内生菌存在为测试阳性(68％)。
将衍生自萌发的用来自Bronsyn E+(2667)种子的胚制成的人工种子的25个幼苗转移到土壤中。人工种子中的胚用10％H2SO4过夜处理而灭菌。在内生菌特异性SSR测试中，23个幼苗中有19个对ST内生菌为测试阳性(83％)，这清楚说明用于种子表面灭菌、大范围胚分离和用海藻酸钙包衣生产人工种子的方法并不对存在的内生菌的生活力有不利影响。
在多年生黑麦草人工种子中大范围接种内生菌
开发了用于在多年生黑麦草人工种子中大范围接种内生菌的不同方法，方法1到方法3的实施例如下：
用内生菌菌丝接种分离的来自种子的胚，并产生内生菌感染的多年生黑麦草人工种子
多年生黑麦草的新鲜分离的来自种子的单个胚被放置在a)96孔板的每个孔中，b)向每个孔加入内生菌菌丝体悬液，允许其在层流下进行部分空气干燥，然后c)产生用海藻酸钙层包覆的人工种子(图126)。
方法1：在用海藻酸钙包覆前，使用内生菌悬液直接接种分离的胚
方法1，用内生菌菌丝体接种分离的来自种子的胚，并生产内生菌感染的多年生黑麦草人工种子，此方法是基于在用海藻酸钙包覆前，使用内生菌悬液直接接种分离的胚，如下所述：
在96孔板的每个孔中，在室温下，将多年生黑麦草的新鲜分离的胚用内生菌悬液(1/16稀释)孵育30分钟。
从孔中除去接种悬液，在滤纸盘上使接种后的胚进行部分空气干燥。
用包含3％海藻酸钠的改良MS生长培养基(MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES+1mg/L BAP)和接种内生菌的胚来生产人工种子(图127)。
使人工种子在用于发芽的MS培养基上发芽。
用内生菌悬液(1/8稀释)直接接种多年生黑麦草新鲜分离的胚，进行部分空气干燥，然后在96孔板的单个孔中用海藻酸钙包覆。
用内生菌直接接种多年生黑麦草的人工种子，然后用海藻酸钙层包覆，处理后的人工种子能够在MS发芽培养基上发芽(图128)。
方法2：用包含内生菌的海藻酸钙层直接包覆分离的胚
方法2，用内生菌菌丝体接种分离的来自种子的胚，并生产内生菌感染的多年生黑麦草人工种子，此方法是基于用包含内生菌的海藻酸钙层直接包覆分离的胚，如下所述：
将多年生黑麦草的胚新鲜分离到96孔板的单个孔中的内生菌悬液(1/16稀释)中。
将含有两倍浓度的海藻酸钠(6％)的改良MS生长培养基(MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES+1mg/L BAP)加到每个孔中，以用包含内生菌的海藻酸盐层包覆胚。用内生菌层包覆的胚生产人工种子(图129)。在用于发芽的MS培养基上使人工种子发芽。
在96孔板的单个孔中，新鲜分离多年生黑麦草胚，并将其包覆以内生菌悬液(1/8或1/16稀释)，然后加入海藻酸钙以产生包覆所述胚的包含内生菌的海藻酸盐层。
在培养之后，观测到内生菌从用来包覆分离的多年生黑麦草胚的包含内生菌的海藻酸盐层向外长出(不考虑所使用的内生菌悬液稀释率， 图130)，其说明被包含在海藻酸钙包衣层中的内生菌的生活力。
方法3：由内生菌接种的分离胚产生的人工种子的双层包覆
方法3，用内生菌菌丝体接种分离的来自种子的胚，并生产感染内生菌的多年生黑麦草的人工种子，此方法是基于对由内生菌接种的分离胚产生的人工种子进行双层包覆，如下所述：
在96孔板的单个孔中，将新鲜分离的多年生黑麦草胚用内生菌悬液(1/16稀释)包覆，和海藻酸盐混合[在改良的MS培养基(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES+1mg/L BAP中的6％海藻酸钙]，以产生包含内生菌的第一包衣层。
将具有包覆新鲜分离的多年生黑麦草胚的包含内生菌的第一海藻酸盐层的人工种子在空气层流中于滤纸上进行吸附干燥(blot-dry)30分钟，然后包覆含3％海藻酸钙但不含任何营养成分的第二海藻酸盐层。
然后使具有以含内生菌的层包覆的多年生黑麦草胚的双层包覆的人工种子在MS培养基上发芽。
对用内生菌接种的人工种子的以不含营养成分的介质进行的第二层包覆的目的是，减少内生菌在发芽期间向外长出，并限制在分离的多年生黑麦草胚附近的内生菌生长(图131)。
将具有包覆新鲜分离的多年生黑麦草胚的包含内生菌的第一海藻酸盐层的人工种子放在空气层流中于滤纸上进行吸附干燥30分钟，然后包覆含3％海藻酸钙但不含任何营养成分的第二海藻酸盐层。
在最长达3周的时间内，内生菌生长主要被限制在内海藻酸盐包衣(图132)。
在96孔板的单个孔中，将多年生黑麦草胚直接新鲜分离到内生菌悬液(1/8稀释)中，然后部分空气干燥，并用第一海藻酸盐层[在改良的MS培养基(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES+1mg/L BAP中的3％海藻酸钙]包覆。
将具有直接的内生菌接种的多年生黑麦草胚的人工种子贮存在4℃过夜，然后包覆含3％海藻酸钙但不含任何营养成分的第二海藻酸盐层。
然后使具有直接的内生菌接种的多年生黑麦草胚的双层包覆的人工种子在MS培养基上发芽。
在MS培养基上发芽的具有直接的内生菌接种的多年生黑麦草胚的 双层包覆的人工种子，显示出的发芽频率与用于胚分离的原始种子批次的发芽频率相当(图133)。
评估衍生自人工种子的幼苗中内生菌的存在，所述人工种子具有用新型内生菌接种来自种子的胚
为了评估衍生自人工种子的幼苗中内生菌的存在，所述人工种子具有使用方法1用新型内生菌(如NEA11)接种来自种子的胚，进行下述实验：
衍生自人工种子的幼苗中内生菌的存在，所述人工种子为用新型内生菌NEA11接种来自多年生黑麦草种子栽培变种Bronsyn E-(不含内生菌，2668种子批次)的胚而产生。
在衍生自人工种子的幼苗长出6周后，根据内生菌特异性SSR测试评估内生菌存在。
将来自发芽的人工种子的23个幼苗转移到土壤中，其中所述人工种子为使用方法1用新型内生菌NEA11接种来自多年生黑麦草种子栽培变种Bronsyn E-(不含内生菌，2668种子批次)的胚而产生。23个幼苗中有6个(即26％)在内生菌特异性SSR测试中对NEA11内生菌的存在为测试阳性，表明建立共生体(表51)。从发芽的人工种子(所述人工种子是使用方法1用新型内生菌NEA11接种来自多年生黑麦草种子的胚而产生的)建立的共生体中内生菌的存在，是在转移到土壤后3个月之后确认。
表51评估衍生自人工种子的幼苗中内生菌的存在，所述人工种子具有用新型内生菌接种来自种子的胚
在多年生黑麦草人工种子中大规模接种“设计者”内生菌
使用上述方法1-3，在多年生黑麦草人工种子中大规模接种衍生自通 过秋水仙碱处理的诱导突变的“设计者”内生菌(如NEA12dh17)或衍生自X射线诱变的“设计者”内生菌(如IRM1-35)。
在96孔板的每个孔中，在室温下，将多年生黑麦草的新鲜分离的胚用“设计者”内生菌(如NEA12dh17和IRM1-35)悬液(1/16稀释)孵育30分钟。
从孔中除去接种悬液，在滤纸盘上使接种后的胚进行部分空气干燥。
用包含3％海藻酸钠的改良MS生长培养基(MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES+1mg/L BAP)和“设计者”内生菌接种的胚来生产人工种子。
使人工种子在用于发芽的MS培养基上发芽。
在96孔板的每个孔中，直接用“设计者”内生菌(如NEA12dh17和IRM1-35)悬液(1/8稀释)接种新鲜分离的多年生黑麦草胚，部分空气干燥，然后用海藻酸钙包覆。
直接用“设计者”内生菌(如NEA12dh17和IRM1-35)接种、然后用海藻酸钙包覆的多年生黑麦草人工种子能够在MS培养基上发芽，导致共生体的建立。共生体——通过在多年生黑麦草人工种子中大规模接种衍生自通过秋水仙碱处理的诱导突变的“设计者”内生菌(如NEA12dh17)或衍生自X射线诱变的“设计者”内生菌(如IRM1-35)而产生——中“设计者”内生菌的存在和种类是通过内生菌特异性SSR测试来说明。
在多年生黑麦草人工种子中大规模接种转基因内生菌
使用上述方法1进行在多年生黑麦草人工种子中大规模接种衍生自对NEA12内生菌的遗传转化(使用包含用于表达DsRed荧光标记物基因的嵌合基因的质粒进行)的转基因内生菌(如NEA12-DsRed)。
在96孔板的每个孔中，在室温下，将多年生黑麦草新鲜分离的胚用转基因内生菌(如NEA12-DsRed)悬液(1/16稀释)孵育30分钟。
从孔中除去接种悬液，在滤纸盘上使接种后的胚进行部分空气干燥。
用包含3％海藻酸钠的改良MS生长培养基(MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES+1mg/L BAP)和转基因内生菌接种的胚来生产人工种子。
使人工种子在用于发芽的MS培养基上发芽。
在96孔板的每个孔中，直接用转基因内生菌(如NEA12-DsRed)悬液(1/8稀释)接种新鲜分离的多年生黑麦草胚，部分空气干燥，然后用海藻酸钙包覆。
直接用转基因内生菌(如NEA12-DsRed)接种、然后用海藻酸钙层包覆的多年生黑麦草人工种子能够在MS培养基上发芽，导致具有转基因内生菌的共生体的建立。共生体——通过在多年生黑麦草人工种子中大规模接种转基因内生菌(如NEA12-DsRed)而产生——中转基因内生菌的存在和种类是通过内生菌特异性SSR测试来说明。
在高羊茅人工种子中大规模接种新型内生菌
使用上述方法1进行在高羊茅人工种子中大规模接种来自高羊茅的新型内生菌(如NEA17、NEA19、NEA20)。
在96孔板的每个孔中，在室温下，将高羊茅的新鲜分离的胚用新型羊茅内生菌(如NEA17、NEA19、NEA20)悬液(1/16稀释)孵育30分钟。
从孔中除去接种悬液，在滤纸盘上使接种后的胚进行部分空气干燥。
用包含3％海藻酸钠的改良MS生长培养基(MS(无CaCl2)+750mg/L谷氨酰胺+5μM CuSO4+1.95g/L MES+1mg/L BAP)和新型内生菌接种的胚来生产人工种子。
使人工种子在用于发芽的MS培养基上发芽。
在96孔板的每个孔中，直接用新型羊茅内生菌(如NEA17、NEA19、NEA20)悬液(1/8稀释)接种新鲜分离的高羊茅胚，部分空气干燥，然后用海藻酸钙包覆。
直接用新型羊茅内生菌(如NEA17、NEA19、NEA20)接种、然后用海藻酸钙层包覆的高羊茅人工种子能够在MS培养基上发芽，导致共生体的建立。共生体——通过在高羊茅人工种子中大规模接种新型羊茅内生菌(如NEA17、NEA19、NEA20)而产生——中新型内生菌的存在和种类是通过内生菌特异性SSR测试来说明。
实施例17——用于选择稳定共生体的方法
多年生黑麦草内生菌的世代稳定性和生活力
饲料遗传供应工业(以技术为导向的牧草植物种子育种商业公司) 的经验已产生一系列对衍生自检定种子批次的禾本科植物作物中内生菌存在的稳定性的需求。以代际稳定性(即，与其后代相比的来自品种繁殖的一代的种子批次中内生菌的存在)的方式，能产生的最高水平的损失为5％，但是理想情况为每代不超过2-3％的损失。此外，由于对大规模种子批次的仓库贮存的需求，在采收后，种子中的内生菌在至少3年内必须稳定并能存活(允许在发芽后的幼苗中重新定殖)。
可应用来鉴定并预测代际稳定性和生活力的实验策略包括：
·使用分子遗传标记物技术，如内生菌特异性的简单序列重复(SSR)测定，以在诊断PCR测试的基础上鉴定内生菌是否存在(存在或不存在，以及PCR产物的特征性大小)。此测试适合于追踪来自连续种群的植物种群中的稳定性变化。但是，其无法确认种子中的生活力。
·定量PCR(qPCR)是用于检测内生菌特异性基因表达的一种方法，考虑到幼苗的发芽，其因此适用于回溯确认种子中内生菌的生活力。
加速老化(AA)是一种以应用特定的温度和相对湿度(RH)条件(Gundel et al.,2009)为基础，能够在短时间内模拟长期贮存对内生菌生活力的影响(Happ et al.,1993)的人工方法。AA测试因此适用于在商业可接受的多年生黑麦草种子批次中区分种子品质(Wang et al.,2004)，以在适用于商业决策的时间范围内提供预测性测定。
所述目的研究的目标因此是，开发一种AA方法，用于禾本科植物-内生菌共生体的种子，其能够被用来根据内生菌在贮存种子中的预测生活力对内生菌进行优劣排序。此方法还适用于选择具有长期存活的内生菌的稳定的共生体，其可用作禾本科植物-内生菌共生体的下一代从头分子育种、选择和评估工具(而非仅培育和选择禾本科植物宿主，然后接种内生菌和评估共生体)。此方法同时适用于多年生黑麦草和高羊茅的共生体(不同宿主遗传背景，不同内生菌)。
AA法是使用一系列加速老化的湿度水平和处理时间，然后是不同的贮存时间和条件(如表52中总结)而开发的，其应用于单一遗传背景(即栽培变种Bronsyn)下的多种新型内生菌-禾本科植物联合体(不同的内生菌，即ST、AR1、NEA3、NEA2、NEA6和AR37；表52)。
表52用于加速老化的条件
图134表示AA过程的概要，总结如下：
·下述处理：
·每次处理有400颗种子(每个重复100颗)未贮存而发芽；
·每次处理有400颗种子(每个重复100颗)被贮存。
·发芽14天后，对幼苗进行计数，并记录发芽率。
·幼苗生长8周，然后评估内生菌的存在。
表53被接种至多年生黑麦草栽培变种Bronsyn亚种群(非等基因)中的内生菌菌株。E＝麦角瓦灵；L＝黑麦震颤素B；P＝波胺。
图135示出了包含不同内生菌的多年生黑麦草栽培变种Bronsyn在种子AA处理及之后的种子贮存之后的种子发芽率的结果。
此结果表明：
·内生菌存在对共生体种子生活力没有影响(参见对照处理，无 AA)；
·在高湿度下(即相对湿度为80％)加速老化并在高温(即40℃)下贮存对发芽的影响最大(即在贮存24个月时不发芽)。
图136表示包含不同内生菌的多年生黑麦草栽培变种Bronsyn在种子AA处理及之后的种子贮存之后，种子中内生菌生活力的对应数据。
结果表明：
·AA(即相对湿度为80％，持续7天)对于预测贮存种子中内生菌生活力是高度有益(informative)的；
·在室温下、中等长度贮存期(即14个月)内，内生菌生活力轻微下降；
·在高温(即40℃)下贮存种子导致内生菌生活力的快速下降；
·新型内生菌NEA3、NEA2和NEA6的生活力低于ST、AR1和AR37的生活力。
研究之后被扩展至在不同的宿主遗传背景下(即栽培变种Bronsyn、Alto、Trojan和Bealey)，评估AA法在预测不同内生菌(即ST、NEA10、NEA11、NEA12、E1和AR1)在贮存的种子中的内生菌生活力方面的应用(表54、表55)。
表54用于加速老化的内生菌菌株和宿主栽培品种
表55加速老化的条件变化
图137表示代表在不同宿主遗传背景下的不同内生菌的共生体，在种子加速老化处理后的种子发芽率。
图138表示在种子加速老化处理后，在不同宿主遗传背景下不同内生菌的内生菌生活力值。
结果表明：
·AA处理对内生菌生活力有大影响；
·在100％相对湿度下进行AA处理4-7天对于预测种子中内生菌生活力非常有益；
·AA可根据一系列宿主独特遗传背景下的生活力对内生菌进行排序；
·在新型内生菌中生活力等级排序为E1<NEA10<NEA11和NEA12；
图139表示在种子加速老化处理后，在不同宿主遗传背景下不同内生菌的内生菌生活力值。
AA处理(即100％相对湿度下进行4天或7天)因此被证明降低内生菌生活力，由此使其可潜在用作稳定联合体的选择工具。
上述结果表明，AA处理可用于选择通过人工接种产生的稳定共生体。
·AA处理提供了可被用作共生体稳定性选择工具的机会。
·AA处理(即100％相对湿度下进行4-7天)降低了内生菌生活力，因此可用于对将在商业实践中被证明存在问题的不稳定联合体的高度有效的反向选择。
·AA处理允许根据共生体的稳定性对其进行排序。
·用以下组合来说明稳定共生体的鉴定或选择：在Alto中的NEA10，在Bealey中的NEA11，在Trojan和Alto中的NEA12。
通过扩展开发用于多年生黑麦草种子的预测宿主-内生菌联合体的生活力的AA方案，此方案被扩展至高羊茅-内生菌联合体的种子；包括测定在一种或多种高羊茅遗传背景下的多种羊茅内生菌(AR542[MaxPTM/MaxQTM/ArkPlusTM]；E34；KY31)。AA条件如表56所述，所评估的高羊茅-内生菌共生体如表57所述。
表56加速老化和贮存的对比。
禾本科植物宿主 内生菌
Quantum II Max-P
Bar Optima E34
Jesup Max-Q
Kentucky 31 KY31
表57进行加速老化处理和贮存的高羊茅-内生菌共生体。
总结：
·建立了一种AA处理方法(即80％-100％相对湿度下进行4-7天)。
·此方法允许预测在贮存的种子中内生菌生活力(基于在单一或不同宿主遗传背景下评估的一系列内生菌)。
·此方法允许根据在贮存的种子中的预测生活力对新型内生菌进行优劣排序(基于在单一宿主遗传背景下评估的一系列内生菌)。
·此方法允许根据稳定性选择共生体并对其进行排序。
实施例18——快速内生菌生活力评估方法
目的：
此工作的目的是开发一种快速、可靠和低成本的方法，用于确定多年生黑麦草种子中内生菌的生活力。相应的测定需求被确定如下。
测定需求：
1.快速确定：3-5日龄的幼苗； 
2.强健并可靠； 
3.足够敏感，从单个种子到种子批次皆可使用；
4.特异性针对内生真菌属内生菌(即不检测其他真菌)；
5.只检测活体内生菌。
基于早期内生菌基因表达的TaqMan分析
所述测定设计中的步骤如下所述：
a)通过在包含内生菌、其他真菌、短柄草属基因序列的数据库中进行数据的BLAST序列分析，获得自Bronsyn+/-ST(6周龄的分蘖)的转录组序列数据被用来鉴定在植物中表达的候选内生菌特异性基因；
b)5种在植物中表达的内生菌特异性基因(Bronsyn的多年生黑麦草植株的6周龄分蘖)被鉴定——LtmJ和4种未特征的蛋白(7490、8263、0005、2232)；
c)设计用于TaqMan测定的引物，如下：
—DNA引物和探针——死的和活的内生菌样品都将扩增；
—RNA引物和探针——只有活的可育性(viable)内生菌 样品会扩增；
—用于种子生活力评估的Bronsyn GAPDH植物基因的引物；
—DNA引物和探针——可育性种子和不可育性种子都将扩增；
—RNA引物和探针——只有可育性种子会扩增。
图140表示设计的用于TaqMan测定的引物
TaqMan引物功能性 
TaqMan引物功能性在来自以下的样品上检测：
—6周龄的Bronsyn+ST的分蘖；
—6周龄的Bronsyn的分蘖，无内生菌，作为阴性对照；
—来自体外内生菌培养的ST菌丝体，作为阳性对照以能够解决以下实验性假说：
a)内生菌特异性转录产物(即LtmJ和4种未表征的蛋白(7490、8263、0005、2232))能在ST内生菌菌丝体的分别提取的DNA和RNA样品中被检测到吗？
b)植物特异性基因(即GAPDH)转录产物能在多年生黑麦草叶材料的分别提取的DNA和RNA样品中被检测到吗？
c)内生菌特异性转录产物(即LtmJ和4种未表征的蛋白(7490、8263、0005、2232))能在内生菌感染的多年生黑麦草(Bronsyn+ST)叶材料的分别提取的DNA和RNA样品中被检测到吗？
图141表示对内生菌特异性基因LtmJ的TaqMan引物功能性测试。
·如所预期的，ST培养物中没有RNA；
·仅表达在植物中。
图142表示对内生菌特异性基因7490的TaqMan引物功能性测试。
图143表示对内生菌特异性基因8263的TaqMan引物功能性测试。
图144表示对内生菌特异性基因0005的TaqMan引物功能性测试。
图145表示对内生菌特异性基因2232的TaqMan引物功能性测试。
图146表示TaqMan测定对照——无模板。
图147表示TaqMan测定对照——植物GAPDH。
所获得的结果总结如下：
·LtmJ引物良好地发挥作用，并且如所预期的，LtmJ未在内生菌(ST)体外培养物中被转录，因为Ltm基因仅在植物中表达；
·设计用于其他4个内生菌特异性基因(编码未表征的蛋白)的引物全部发挥了作用，且此4个基因均在已建立的禾本科植物-内生菌共生体的分蘖中表达(内生菌生活力评估)。
从内生菌感染的多年生黑麦草植物的混合样品中共提取RNA/DNA
此外，利用通过单独一步共提取DNA和RNA而产生的样品，进行实验：
·单独一步共提取DNA和RNA
—多年生黑麦草栽培变种Bronsyn+ST内生菌的6周龄的分蘖；
—多年生黑麦草栽培变种Bronsyn(无内生菌)的6周龄的分蘖；
—多年生黑麦草栽培变种Bronsyn+ST内生菌的7日龄分离的衍生自发芽种子的上胚轴(混合样品)
·用共提取的DNA和RNA测试TaqMan引物
—测试在植物中表达的内生菌特异性基因7490和0005。
·共提取的DNA和RNA样品的质量足够使引物/探针发挥作用吗？
·在来自禾本科植物-内生菌共生体的7日龄的上胚轴中表达的内生菌特异性基因能使早期植物中内生菌生活力的评估得以进行吗？
图148表示在共提取的DNA/RNA混合样品中检测内生菌特异性基因7490。
图149表示在共提取的DNA/RNA混合样品中检测内生菌特异性 基因0005。
图150表示在共提取的DNA/RNA混合样品中的检测的对照(无模板)。
从各个10日龄的衍生自发芽种子的上胚轴中共提取DNA/RNA
此外，利用通过单独一步共提取DNA和RNA而产生的样品，进行实验：
—10日龄分离的衍生自发芽种子的上胚轴(单一种子)；
—7日龄分离的衍生自发芽种子的上胚轴(混合种子)。
这些样品被用来在共提取的DNA/RNA中测试设计的TaqMan引物，特别是测试为在植物中表达的内生菌特异性基因7490、0005和2232所设计的引物，以回答以下问题：
·从各个10日龄分离的衍生自发芽种子的上胚轴共提取的DNA/RNA样品中能检测到内生菌特异性测试基因的表达吗？
图151表示在从各个10日龄上胚轴共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因2232。
图152表示在从各个10日龄上胚轴共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因7490。
图153表示在从各个10日龄上胚轴共提取的DNA/RNA样品中检测内生菌特异性基因0005。
图154表示用于从各个10日龄上胚轴共提取的DNA/RNA样品中的检测的对照(无模板)。
内生菌特异性基因表达在早期发育阶段能够检测到吗？
此外，为了评估内生菌特异性基因表达在早期发育阶段是否能够检测到，利用通过单独一步共提取DNA和RNA而产生的样品，进行实验：
—7日龄分离的衍生自萌芽种子的上胚轴(混合)；
—5日龄分离的衍生自萌芽种子的上胚轴(混合)；
—3日龄分离的衍生自萌芽种子的上胚轴(混合)。
这些样品被用来在共提取的DNA/RNA中测试设计的TaqMan引物，特别是测试为在植物中表达的内生菌特异性基因7490、0005和 2232所设计的引物，以回答以下问题：
内生菌特异性基因会早于7天表达吗？
图155表示在从3、5、7日龄混合上胚轴共提取的DNA/RNA中检测内生菌特异性基因2232。
图156表示在从3、5、7日龄混合上胚轴共提取的DNA/RNA中检测内生菌特异性基因7490。
图157表示在从3、5、7日龄混合上胚轴共提取的DNA/RNA中检测内生菌特异性基因0005。
在单一完整的萌芽种子中，内生菌特异性基因表达在早期发育阶段能够检测到吗？
此外，为了评估在单一完整的萌芽种子样品中，内生菌特异性基因表达在早期(小于3天)发育阶段能否检测到，利用通过从单一种子样品共提取DNA和RNA而产生的样品，进行实验：
—3日龄分离的衍生自萌芽种子的上胚轴(对照)；
—3日龄单一完整的萌芽种子(即包括上胚轴的单个完整的种子)；
—2日龄单一完整的萌芽种子(即包括上胚轴的单个完整的种子)；
—1日龄单一完整的萌芽种子(即包括上胚轴的单个完整的种子)；
以确认来自单一完整的萌芽种子的信号充分，并且所述测定可在100个单一完整的萌芽种子上分别进行以能够定量评估内生菌生活力(％水平)。
测定验证
通过评估以下内容进行测定验证：
a)有待在具有新型内生菌(即除了ST的内生菌，如AR1、AR37、NEA2、NEA6、NEA10、NEA11、NEA12和E1)的共生体中检测的内生菌特异性基因表达；
b)有待在具有不同宿主遗传背景(即来自如基因型Bronsyn和Alto的多年生黑麦草)的共生体中检测的内生菌特异性基因表达；
此外，为了进行测定验证，将来自定量快速测定的结果(即在单一完整的萌芽种子水平的基于内生菌特异性基因表达的测定；3-10天)与检测内生菌在宿主的定殖和共生体建立的测定(即在6周龄的植物水平的基于当前内生菌DNA检测的测定)相比较。
此外，使用被设计用来检测高羊茅-内生菌共生体(即来自在不同高羊茅遗传背景下(如BarOptima、BarSelect和BarElite)的不同内生菌(如E34、E77、E79和E80)的种子)和禾本科植物-内生菌联合体(在臂形草属和尾稃草属禾本科植物中的枝顶孢属内生菌)中内生菌特异性基因表达的引物，来评估被开发用于多年生黑麦草-内生菌共生体的测定的适用性。
实施例19——分子表型分型作为从头育种的工具I
在鉴定新型内生菌形成的稳定宿主-内生菌联合体的过程中，已观测到重要的基因型×基因型(G×G)效应。
“设计者”联合体是相容、稳定的，并且可在一定种群水平下因其他表型而被选择(性能、生物碱生产等)。例如，已在下列组合(黑麦草品种-新型内生菌)中观测到特别稳定的联合体：
·Impact–NEA10
·Tolosa–NEA12
·Bealey–E1
研究的目的因此是，开发分子表型分型，作为从头育种和共生体选择的工具，其基于以下步骤：
·在多种宿主禾本科植物种群成员中，使用多种内生菌；
·相关生物碱含量的代谢特征分析；
·基于单个共生体的性能的选择。
为了在种群中鉴定出具有最佳生物碱生产的各个植物，对来自多年生黑麦草品种Bealey——其包含两种不同的内生菌菌株(NEA2和NEA6)的混合物——的单一种群的80株植物进行半定量代谢特征分析。在所述植物种群中观察到生物碱特征和含量的差异(图158)。两种内生菌菌株被观察到表现出不同的特征性生物碱：NEA2之前已被描述(van Zijll de Jong et al.2008)为生产黑麦震颤素B、无麦角瓦灵和中等水平的波胺；而NEA6生产低水平的黑麦震颤素B、中等 的麦角瓦灵和中等的波胺。在所述种群中对生产黑麦震颤素B的植物的鉴定确认了NEA2的存在(在大多数植物中)，而无法确认NEA6的存在。
图158表示对多年生黑麦草-内生菌共生体种群的代谢特征分析。
然后将所述研究拓展至在种群中鉴定具有有利(高波胺、低麦角瓦灵、无/低黑麦震颤素B)毒素特征的各个植物。基于SSR分析的遗传同一性测试是鉴定内生菌的存在和种类以及进行精确选择的关键。植物宿主内的遗传变异似乎会在由单一内生菌基因型(如NEA6)表征的亚群内影响有利毒素特征，如在生产波胺的植物组中的定量变化所示(图159，表58)。此数据能用于育种选择过程。
表58所选样品的SSR标记物分析
总之，此研究表明：
1.开发用于生物碱(P/E/L)生产的分子表型分型方法，作为多年生黑麦草-内生菌共生体的从头分子育种的工具。
2.在多年生黑麦草-内生菌共生体(由一个禾本科植物宿主种群中的两种内生菌组成)概念验证的从头选择中，使用分子表型分型方法。
3.对由两种内生菌和多种禾本科植物宿主基因型组成的多年生黑麦草-内生菌共生体的亚种群的最佳生物碱(P/E/L)生产的有效选择。
实施例20——分子表型分型作为从头育种的工具II
目前的饲草育种没有检查广泛的化合物或分子，主要是由于成本限制。通过将共生体的分子表型分型应用于改善牧草的质量而得到的育种改良的饲草能够将优良的反刍动物营养特征赋予饲草栽培品种。
此工作的目的是，开发高通量、成本有效的分子表型分型方案，其可用作共生体育种工具。这是通过以下步骤来实现：
·牧草品质定量，通过水溶性碳水化合物(WSC)和蛋白质的比值来测定。
—预期改善的水溶性碳水化合物(WSC)和蛋白质的比值能提高产率，以及降低农业系统对环境的影响。
·根据各个共生体性能的选择
鉴定种群中具有最佳的水溶性碳水化合物(WSC)和蛋白质的比值的各个植物
图160表示对共生体种群的分子表型分型结果，以能够进行从头育种和选择。
水溶性碳水化合物定量
存在若干方法，可用于定量植物样品中的水溶性碳水化合物WSC，但是由于在通量和成本方面的多种限制，没有一种方法在饲草培育中被广泛采用。
所开发的方案是基于酶法测定，关键的改良是将机器自动化应用到输送以下系统的样品处理过程：
·快速和半自动化；
·提供了葡萄糖、蔗糖、果糖、果聚糖各自的浓度；
·在多年生黑麦草中的精确、已证明的应用；
·酶方法和HPLC结果的已证明的相关性。
图161表示从葡萄糖生产葡萄糖-6-磷酸。
图162表示在一个共生体种群中水溶性碳水化合物的存在。
所开发的方案已通过以下实验举例证明：
·从已建立的野外试验的三叶阶段对约1000个多年生黑麦草基因型的集合×4克隆重复(3次技术重复)取样；
·对样品进行热处理，然后冷冻干燥，再通过碳水化合物提取和葡萄糖、果糖、蔗糖和果聚糖含量的酶测测定的半自动流水线处理。
·利用这种方案，每天处理约400株植物。
·鉴定具有高和低碳水化合物水平的植物，随后对其进行实验性概念验证育种步骤。
图163表示蛋白质的定量。
目前可用若干种方法来实现蛋白质的测定，但是由于在通量和成本方面的多种限制，没有一种方法在饲草培育中被广泛采用。
所开发的方案是基于已建立的比色测定，关键的改良是将机器自动化应用到输送以下系统的样品处理过程：
·测定真正的植物蛋白；
·比色定量方法；
·对不同的提取缓冲液和比色法的广泛测试证明目前使用的方法为最佳——用弱NaOH提取，用Bradford定量，用酶标仪检测。
成果
总之，实现了如下成果：
1.开发一种用于水溶性碳水化合物和总蛋白的自动分子表型分型方法，作为多年生黑麦草-内生菌共生体从头分子育种的工具；
2.这些分子表型分型方法被用于较大多年生黑麦草种群的概念验证筛选；
3.在“概念验证”育种步骤，具有高水溶性碳水化合物水平的多年生黑麦草植物的亚种群被选择。
实施例21——共生体中内生菌鉴定方法
用于内生菌存在、种类和发生率的种子批次(seed bulk)对比植物个体的测试
8个多年生黑麦草品系被用于通过SSR标记物测试NEA2/NEA6 内生菌存在、种类和比例。
每个品系85株植物；
每个品系23x10种子批次
栽培品种/品系 来源
Bealey NEA2 Nucleus'11
Bealey NEA2 11235AT2
Bealey NEA2 12138A
Trojan NEA2/NEA6 951T1
Trojan NEA2/NEA6 13181A
Trojan NEA2/NEA6 13206
Bealey NEA2 Nucleus'02
Bealey NEA2 RG0339
表59栽培品种和来源
表60预期的SSR特征
表61植物个体
表62种子批次
总结
·NEA2被鉴定为在Bealey NEA2/NEA6中的优势内生菌。
·在Bealey中NEA2/NEA6的比例在2002-2011年期间没有改变。
·Trojan中观察到NEA2/NEA6的比例几乎相等。
·分蘖测试是用于清楚评估内生菌存在、种类和发生率的稳健方法。
·确定具体的内生菌菌株在每一品系中的准确发生率；
·鉴定不含内生菌的植物。
·批量种子测试是用于评估内生菌发生率的指示性方法。
·确定每一种内生菌在具体的品系中的相对比例；
·不允许鉴定不含内生菌的个体。
内生菌接种的多年生黑麦草品系的遗传纯度
·来自5个品系的种子样品
–编号为Lp513、Lp539、Lp613、Lp660、Lp667
·用3个标记物分析多个种子批次(每品系23批次)–区分ST、NEA2、NEA6的诊断能力。
·Lp513、Lp613——包含NEA6>NEA2；
·Lp660——包含NEA2、ST，痕量NEA6；
·Lp667——包含ST、NEA6；
·Lp539——仅包含ST。
与之前对NEA2、NEA6发生率评估的关系？
ST内生菌侵入的来源？
成果
1.建立了用于确定在各个分蘖样品中内生菌存在、种类和发生率的方法。
2.建立了用于确定在成批种子样品中内生菌存在、种类和发生率的方法。
实施例22——用于共生体基因型中等位基因含量表征(allelic content characterization)方法
用于宿主基因型中等位基因含量表征的方法
基于SNP的标记物工具已在多年生黑麦草中被开发出来，转移至意大利黑麦草，并在高羊茅中被开发出来。
全面的栽培品种目录已从可获得的种质之间的遗传多样性和相关性被开发出来。
克隆育种区已被建立，并进行基因型分型以协助育种决策。
基于SNP的标记物工具已被开发出来，以对宿主植物和内生菌进行共基因型分型。
SNP工具已被开发出来，以在基于序列的测定系统中评估约1000颗种子的种子批次纯度和内生菌的含量。
共生体的共基因型分型已被开发并举例证明。
·方案：
—研磨2.5克种子；
—提取DNA；
—对DNA进行384轮PCR；
—合并PCR产物；
—连接Illumina接头；
—扩增样品；
—用Illumina HiSeq2000测序——在单一泳道有1-2％的尖峰；
—利用LINUX中产生的两个管道处理数据；
—利用一对定制的R脚本分析数据。
图164和165表示种质间的遗传多样性和相关性。
通过测序的基因型分型
开发中的方案——将降低的测序成本应用至：
·用分子标记物使基因组饱和；
·每个样品的低成本；
·可能的高通量；
·基因组序列数据将协助开发；
·在玉米和大麦中的最初研究；
·比对定位至大麦遗传图谱中的24186个标记物；
·在玉米中开发的约200000个标记物；
·已发表的方案——Elshire et al May 2011PlosOne；
·内部开发的96个初始的定制条形码。
图166表示通过测序的基因型分型。
图167表示用于通过测序的基因型分型步骤。
育种选择程序
随着育种程序所获得的数据组不断增多，植物的选择需要复杂的计算工具，以使收获最大。
程序方法：
选择保存所有等位基因变体的表型优质个体的亚组。
程序设计：
使用者确定要选择的亚组的大小。
程序选择保留了种群中可见的所有等位基因变异的个体的亚组。
程序选择使用者确定的优质个体亚组的大小。
输出植物种类、平均表型数值和丢失的等位基因数量。
表型数值为单个数字，但可产生复合数值。
实例：从1000株植物中选择150株植物，处理时间约为1小时。
用于栽培品种亚选择的可能的计划：
·克隆育种区PG one50和LP443所代表的栽培品种被选择用于亚选择。
·在栽培品种中，根据表型性能和/或相关标记物进行选择，同时保持整个种群的等位基因频率。
·预期有约6％优质植物被鉴定，约20-30个体被需要以保持种群多样性。
·在初次尝试中靶性状是品质——消化吸收率和水溶性碳水化合物WSC。
·鉴定来自育种区的植物同龄群，其将进行多系杂交。
·进行杂交，采收种子并计数，然后种子发芽。
·然后进行PG one50对比PG one50亚选择，以及LP443对比LP443亚选择的试验。
·更成功地用于许多性状的应用可能具有更高的遗传性。
成果
1.建立了对来自叶组织样品的共生体进行基因型分型的方法。
2.建立了对来自种子批次样品的共生体进行基因型分型的方法。
3.建立了用于选择优质个体同时保留种群的遗传多样性的计算育种工具。
实施例23——饲料植物物种中的基因组选择
摘要
基因组选择(GS)是通过根据分布于整个基因组范围的所有标记物预测育种值，在家畜和作物植物改良中利用DNA序列多态性的一种强有力的新方法。饲料用禾本科植物和豆科植物(其支持全球大范围的畜牧业)为基因组选择的实施提供了重要的目标，因为许多用 于改良的关键靶性状的测定困难或昂贵，并且在选择候选物的生命周期后期才能被测定。在候选物种范围内存在差异(如生殖方式和多倍体基因组结构)的许多生物因子，给基因组选择同时带来挑战与机遇。描述了饲料育种程序的一般特征以及代表性物种组(黑麦草)的基因组资源的情况。描述了包含基因组选择的黑麦草育种计划，其允许在之前进行单独一轮选择所需时间内对关键的农艺性状进行两轮选择，可能使对上述特征的遗传获得量的比率加倍。解决了连锁不平衡(LD)的范围极其受限的问题，其为在黑麦草育种中实施基因组选择的主要挑战。此策略还吸收了在DNA测序技术方面的最新进展，以使成本最低。
一个替代方法是在被称为基因组选择(GS)的方法中同时使用在全基因组范围分布的所有标记物，以预测育种值(Meuwissen et al.2001)。GS使用一组标记物，所述标记物组足够密集以使得所有的数量性状基因座(QTL)被预期与至少一个标记物基因座处于连锁不平衡(LD)。与分子标记辅助选择(MAS)相比，GS具有两个优势。首先，所有的遗传变异均可能被所述标记物捕获，因为为了能被用来预测育种值，标记物效应不需要超过显著阈值。第二，多次测量不会使标记物效应向上偏移。这不同于从全基因组关联分析(GWAS)获得的标记物效应：由于测试数量较大，超过显著阈值的有可能是那些具有有利误差项的标记物(Beavis 1994)。
为了实施GS，同时具有已知基因型和表型的参考个体种群被用来获取预测方程，其从标记物基因型预测基因组估计育种值(GEBV)。然后此预测方程能用来估计选择候选物的估计育种值，其基因型已获得，但表型可能未获得。在模拟研究中，选择候选物的基因组估计育种值GEBV的准确性(基因组估计育种值与真实育种值的相关性，其决定遗传获得量)可高达0.85(Meuwissen et al.2001)。在实际操作中，高达这一数值的准确性值尚未有报道，尽管在荷斯坦-弗里生奶牛中已有基因组估计育种值准确性最高达0.71的报道(Van Raden et al.2009)。
基因组估计育种值的有效性对于改良程序的影响意义深远。GS使得能够在靶生物的生命周期的早期做出准确的选择决策，其代价仅为用所述标记物组进行基因型分型。对于以下任一种性状来说，GS 对遗传获得量的比率的影响最大：
·测定昂贵或困难，如饲草的牧草品质或谷物的谷物品质；
·只有通过明显损坏或摧毁个体才可测量，如谷物的线虫感染抗性，因此阻止了随后用该个体的育种；
·在生命周期的后期才表达，如作物粮食产率，或在个体被选择用于育种后才表达，如存活或植物持续性。
GS对作物植物育种的潜在价值已被意识到(Heffner et al.2009；Janninck et al.2010)。在饲料中，牧草的产率和品质是饲料改良的关键性状，并且支持饲料转化为单位量的肉或乳。这些特征为GS提供了良好的候选物，因为它们需要昂贵的和/或破坏性的生命后期测定。诸如野外持续性的性状也具有明显价值。本文提供了对关于GS在饲料中的前景的现有知识的总结，并描述了可能的实施策略。
靶物种的生物学
考虑到将GS原理应用到饲料物种的前景，必须考虑相关的生物学方面，如生殖模式、多倍体情况和共生相互作用。这些因子可与所述方法被倡导用于的那些进行异型杂交、双倍体动物物种的性质明显不同。根据表63中的上述多种生物因子将目前和未来用于澳大利亚草地农业中的主要牧草物种分类，并且在随后的部分中对每个因子对GS应用的影响做出了评论。
表63影响饲料物种中GS实施可行性的生物因子的总结信息
1.1分类学分类 
许多植物物种对全球草地农业是重要的，其大部分属于禾本科(Poaceae)或豆科(Fabaceae)。禾本科植物和豆科植物或者被分开栽培，或者在一块混合型草地上作为伴生物种被结合栽培。最重要的温带牧场禾本科植物物种是黑麦草属-羊茅属(Lolium-Festuca)物种复合体(黑麦草和羊茅)的成员，其为两个密切相关的属，归类于冷季禾本科植物早熟禾亚科(Pooideae)的早熟禾族(Poeae tribe)。相反，多种温季牧场禾本科植物物种(臂形草属、雀稗属(Paspalum)、画眉草属(Eragrostis)和狼尾草属(Pennisetum)成员)属于黍亚科(Panicoideae)的若干族。
关键的冷季物种主要属于豆科进化枝豆科(Fabaceae clade Hologalegina)的车轴草族(Trifolieae tribe)的苜蓿属(Medicago)(苜蓿属植物，包括紫花苜蓿(Medicago sativa L.))和三叶草属(Trifolium)(三叶草，包括白三叶草(Trifolium repens L.)和红三叶草(Trifolium pratense L.))。还有许多农业经济上重要的温季牧场豆科植物，包括鹧鸪豆属(Chamaecrista)、大翼豆属(Macroptilium)、笔花豆属(Stylosanthes)、距瓣豆属(Centrosema)和山蚂蝗属(Desmodium)的成员。
1.2生殖模式
大部分温带饲料物种(除了地三叶草(T.subterraneum L.))都表现出专性的依靠异花授粉的远系繁殖(异花授粉)。实例包括多年生黑麦草、意大利黑麦草、高羊茅、草地羊茅(Festuca pratensis Huds.syn.L.pratense)、白三叶草和紫花苜蓿。抑制同系繁殖是由于遗传上控制的自交不亲和性(SI)系统——由于雄性和雌性生殖组织中的SI基因座等位基因的特定配对产生不亲和的花粉-柱头相互作用。
配子体SI(GSI)系统(其中雄性配子的表型仅由其自身单倍体基因型决定)为饲料禾本科植物和豆科植物所特有。对于牧草物种如多年生黑麦草而言，SI促使了高水平的杂合性和异质性，使得种群内多样性典型地超过了种群间的变异性(Guthridge et al.2001:Wang et al.2009)。这对于GS在这些物种中的成功应用的前景是重要的，如下所述。对具体基因型的SI等位基因含量的所知有限是靶向品种 开发的一个可能的障碍，特别是对基础受限的栽培品种(Guthridge et al.2001)——其是基于少数基础克隆——来说。在自花受精或近亲繁殖的基因型之间的杂交(如全同胞杂交)情况下，对生殖能力和种子产率的影响，以及对有益遗传变体的交换的限制最为严重。在GS实施的背景下，专性远系繁殖导致高水平的基因型杂合性和多态性比率，其可能比在已成功应用GS的牲畜物种(如，The Bovine HapMap Consortium 2009)中更高。
单性生殖代表另一种不同的生殖模式，其中胚发育在没有父本贡献的情况下从一个未减小的卵细胞开始进行。单性生殖的产物因此是母本基因型的克隆。单性生殖繁殖系统对于植物育种者来说是非常有吸引力的，因为保留优秀基因型并使其增加的能力(Spielman et al.2003)。单性生殖通常与杂交性和/或多倍性有关，并且此性状的表达通常是不完全的，使得从单个植物可获得有性和无性受精产物的混合物。变异还可在物种内观察到，在单独一个种群内具有完全有性生殖的双倍体基因型和兼性单性生殖的多倍体基因型。单性生殖的暖季禾本科植物(其为育种改良的目标)包括臂形草属(信号草)、雀稗属(雀稗草)、狼尾草属(栽培的珍珠黍的近亲)的若干物种，以及弯叶画眉草(Eragrostis curvula(Schrad.)Nees)(Pessino et al.1999)。对于GS而言，在异体受精的有性二倍体水平选择最佳基因型能够和基于向多倍体单性生殖水平转变的大范围繁殖非常有效地联系起来。
目标物种还有一年生或多年生生长习性的差异，大部分是短期或长期存活的多年生植物。此特性对GS而言可能是有益的，因为从单个完整被基因型分型的个体而来的克隆复制体可在多种不同环境中针对多个性状被评估，为表型评估中GEBV的偏差(derivation)提供更多的置信度。单一基因型的单性生殖可允许获得类似品质的信息。
1.3多倍性
对于异源多倍体(其来自不同分类群之间的杂交)，对GS可行性的最重要的影响是双重的：对SNP的发现和确认过程提出了挑战；以及如果与原因多态性有关的SNP仅从单一亚基因组分离，需要对 此突变进行可靠地测定(Kaur et al.2012)。前者的产生是由于需要区分真正的SNP(在一个亚基因组中等位基因之间的同源变体)、部分同源的序列变体(HSV)(在每个亚基因组中对应的基因座之间产生)和旁系同源序列变体(PSV)(在亚基因组内部和之间的重复基因间产生)(Hand et al.2008；Lawless et al.2009)。根据测序深度(Margulies et al.2005)和用于预测亚基因组结构的与双倍体(2X)祖先分类群(progenitor taxa)的对比，已对异源四倍体(2n＝4x＝32)白三叶草(Hand et al.2008)和异源六倍体高羊茅(2n＝6x＝42)(Hand et al.2010)建立了此问题的部分解决方案。
同源多倍体的饲料物种(其典型来自单一分类群内的染色体加倍事件)包括紫花苜蓿和人工产生的黑麦草品种，以及如鸭茅(Dactylis glomerata L.)、百脉根(Lotus corniculatus L.)和无芒雀麦(Bromus inermis L.)的物种。尽管在同源多倍体中SNP的发现可能不如异源多倍体中的复杂，但是由于需要进行定量基因型分型(确定同源基因剂量)、准确单体型重建和确认标志性状基因连锁，预计GS研究中可出现其他挑战。
1.4植物-微生物共生联合体
牧场禾本科植物和豆科植物都与无性生殖的微生物物种形成互益的共生联合体。实施GS的计划因此可被设计成靶向经适应性改造的共生体的共选择，以优化联合体的相容性和稳定性。最充分表征的禾本内生菌是子囊菌目(Ascomycota)和麦角菌科(Claviceptaceae)的真菌物种。在温带禾本科植物中，由于存在和不存在有性生殖状态，在内生真菌属和香柱菌属的成员中观察到无性型和有性型的关系。内生真菌属内生菌通过阻止无脊椎动物食草性和改善非生物胁迫耐受，赋予宿主禾本科植物有益影响，并获得物理保护和营养作为回报。
豆科植物物种与一系列变形菌物种(大多数属于根瘤菌目)形成共生相互作用。根瘤菌被隔离在豆科植物的根特化的根瘤中，并在氧气有限的环境中进行大气的氮(N2)向铵(NH4 +)的生物固氮(Sessitsch et al.2001)。
1.5靶性状
对饲料物种而言，牧草产率和品质是主要的生产性状。后者主要是通过用于食草动物的能量供应的寡糖碳水化合物的消化率(与细胞壁中的纤维素和木质素聚合物含量有关)和可利用率来控制(Cogan et al.2005)。品质的其他方面包括减少反刍动物的胃气胀，其与富含蛋白质的豆科植物饮食有关，可通过浓缩鞣酸的存在而得到改善。生物胁迫抗性特征包括对病毒、细菌、真菌病原体，以及对无脊椎害虫的反应。实例包括紫花苜蓿和白三叶草的苜蓿花叶病毒(AMV)，以及黑麦草的花冠病原体(禾冠柄锈菌黑麦草专化型(Puccinia coronata f.sp.lolii))(Dracatos et al.2010)。非生物胁迫相关性状包括饲草对水涝(Pearson et al.2010)和干旱的耐受，以及三叶草对铝毒性、磷缺乏和盐胁迫的耐受。对于禾本科植物和牧场豆科植物品种而言，产生足够数量的可育性种子的能力是重要的。由于需要费力、昂贵、破坏性或生命周期后期测定，上述所有性状都是GS的好目标。
牧场植物育种程序的结构和目标
已有许多不同形式的育种程序在牧场植物物种上完成。一般计划(其描述了大多数此类育种程序的相关特征)记载于图168中。大多数商业活动是基于这样一种策略，其首先建立多达10000个体的基础种群，然后在家系中进行种子繁殖，产生用于混合选择的100000个体。对在放牧压力下的持久性评估或目视评估(作为在野外被间隔开的植物)被用于亚选择，将所评估的基因型数量减少为1/10。幸存下来的多达1000个可能的亲代克隆接受针对关键性能特征的进一步评估，如产率和持久性。亲本育种值的确定可通过使用许多实验方法而获得(Vogel and Pedersen 1993)。在半同胞子代测试(HSPT)中，来自已选基因型的母本衍生子代在重复的表型试验中被评估，以使混杂的环境变量最小，获得亲本的一般配合力(GCA)的信息。全同胞子代测试(FSPT)通过对优良成对杂交衍生的家系的鉴定，测定亲代基因型的具体配合力(SCA)。家系内和家系间选择(WBFS)包括建立多重多系杂交(在所选个体之间随机交配)、采收并分装来自每一个母本植物的相等种子数量，以及建立并评估重复的间隔植物半同胞子代育种区的关键生产特征。
在选择基础(Syn0)基因型之后，通常通过多系杂交，较少通过双等位基因结构的每个亲本之间杂交而获得的F1种子的组合，产生合成1(Syn1)种群。基础个体的数量可存在差异，从在多年生黑麦草中的低至4(尽管在意大利黑麦草中更高)，到在多倍体物种(如高小麦草和紫花苜蓿)中的50-100(Bray and Irwin 1999)。然后通过以从在单个普通花粉云中受精的母本采收的种子进行的Syn1繁殖获得合成2(Syn2)种群。然后在多种环境中评估Syn2种群的关键性状，导致选择一个用于商业发布品种的种群。
实施此一般计划的具体版本的商用育种程序典型包括在6-9年的时间内的两轮选择性遗传重组和随后选择/评估(图168)。考虑到上述阶段的较长时间范围，有较大机会基于GS策略加速遗传获得量。但是，在商业饲料育种程序中实施GS时，要完全利用这种技术，有可能需要较大的结构改变，至少是在现在的基因组技术发展阶段。在目前的系统中，基础克隆很少被保留，并且谱系结构的细节一般未被记录，阻止了基于系谱的估计育种值的计算。在此模式中，个体基因型的值相对较低，限制了应用依赖昂贵基因型分型分析和/或表型表征的策略的机会。因此，通过具体基因型的克隆育种区评估，向基于系谱的育种的转变(或至少使用标记物信息来捕获系谱结构)是在牧场植物育种中实施GS的重要步骤。
将GS应用到黑麦草育种的需求
在主要的饲草物种中，黑麦草和紫花苜蓿现在拥有开发得最好的一套遗传和基因组资源。但是，由于黑麦草的遗传系统富有争议地与家养动物的遗传系统更为相似(远系繁殖，二倍体分类群)，这些物种提供了用于在饲料中开发GS策略的可能的测试例。为了实现这一目的，必须克服一些关键限制。
1.6序列多态性的可利用性
GS需要分布于整个基因组范围的一组序列多态性，其能够以合理成本用于大量个体的基因型测定。鉴于SNP在基因组中较高的丰度，以及精确而价廉的检测技术的可利用性，其已被确立为大多数物种中应用GS的选择标记物。但是，其他类型的分子标记物在理论上也可用于GS受试者以满足上述标准。
与主要谷物物种(如稻、玉米、小麦和大麦)相比，多年生黑麦草基因组资源的开发一直相对缓慢。多年生黑麦草的最初大规模SNP发现是通过基因序列的功能选择、来自全同胞图谱绘制家系亲本的扩增子产生，以及之后的克隆、测序、比对和利用孟德尔传递测试的确认而实现(Cogan et al.2006)。此方法被应用于来自多种功能类别的基因，检测来自有限数量的取样单体型的高水平的核苷酸多样性。来自多个SNP发现研究(Cogan et al.2006；Xing et al.2007；Dracatos et al.2008；Dracatos et al.2009；Brazauskas et al.2010；Fiil et al.2011)的一致意见是，SNP频率典型在1/20-150bp之间变化，取决于基因同一性和基因型数量。来自多种基因型(约500基因型)的混合基因特异性扩增子的DNA测序还表明高“整体”平均值为1/20-25bp之间(Cogan et al.2010a)。
多种方法被用来产生数量更多的在整个基因组分布的SNP。在早期的一种方法中，几组候选基因被选择，并且利用第二代罗氏GS FLX平台对来自上述区域的混合扩增子进行测序。所得到的SNP被格式化，以用于使用Illumina GoldenGateTM寡核苷酸连接扩增384-plex测定法(Cogan et al.2010c)进行的基因型分型。一种允许发现具有更宽范围基因组覆盖度的数量更大的SNP的方法，是基于比较基因组学——以选择通常分布于整个黑麦草基因组的外显子区域用于混合测序。此工作(activity)的“概念验证”来自于对SI基因座的小规模遗传和物理作图(Shinozuka et al.2010)。一个更为普遍的策略需要利用来自面包小麦(其与多年生黑麦草的保守的同线性之前已被确定(Jones et al.2002a))的物理图谱数据，以与二穗短柄草(B.distachyon)的草图基因组比对并且因此使用通常分隔开的短柄草属(Brachypodium)基因模板，以选择正向同源的黑麦草表达序列标签(EST)用于扩增子设计和混合测序(Cogan et al.2010d)。
复杂性降低的方法还可用于使用如C0t过滤和低甲基化的方法来调查整个基因空间(Forster et al.2010)。总体上，上述发现工作得到约20000个预测的SNP基因座，足够支持对一块基于集成的高密度寡核苷酸的基因型分型芯片的初始设计，其类似于用在牲畜GWAS和GS分析中的那些芯片。但是，当前测序技术能力的飞速发展表明，现在对于基因组范围的SNP发现来说，整个基因组测序本身，再加 上不同基因型之间的对比，是更具成本效益的途径。对于二代平台而言，复杂的禾本科基因组的完整拼接仍是高度挑战性的(Gupta 2008)。但是，基于使用Illumina Hi-Seq的测序，现在将基因空间拼接为unigene重叠群是可行的，其已得到多年生黑麦草的约60X的覆盖度(Cogan et al.2011)。
在不远的未来，诸如黑麦草的物种中的SNP发现和随后的基因型分型可能通过从基因型分型本身向“基于测序的基因型分型(GBS)”方法的转变而会聚到一起(Huang et al.2009,Elshire et al.2011)。例如，限制性位点相关DNA(RAD)法(Baird et al.,2008)通过对来自特定基因型的复杂性降低代表的第二代测序，提供了获得基本上无限的序列多态性组的机会(Wang et al.2011)。在黑麦草和其他饲草物种的种群结构和目前作物的育种实践情况下，为了获得大量必要的标记物和低成本基因型分型，此方法对于黑麦草和其他饲草物种而言可能是必不可少的。
1.7黑麦草中有限的连锁不平衡(LD)的挑战
为了以有用的准确性预测选择候选物的基因组估计育种值(GEBV)，任何GS实验设计的两个关键问题是，所需SNPs的数量，以及必须在参照种群中进行基因型分型和表型分型的个体数量。这两种情况的答案关键取决于目标物种中连锁不平衡(LD)的程度。连锁不平衡(LD)通常是通过r2统计值来测定，其还可被理解为通过与数量性状基因座(QTL)相关的单核苷酸多态性(SNP)来解释的方差比例。基因组范围的连锁不平衡(LD)程度主要由过去有效种群大小(Ne)决定，特别是在该值较大的远系繁殖物种中。r2的期望值是其中Ne为有效种群大小，c为基因座之间的图距，以“摩”为单位(Sved 1971)。Meuwissen(2009)通过模拟证明，为了获得非常准确的基因组估计育种值(GEBV)，需要10*Ne*L标记物，其中L是基因组长度，以“摩”为单位。如果无法获得Ne的估计值，并且标记物之间的r2已被估计，Calus等(2008)证明，只要相邻标记物之间r2平均在0.27以上，则预测的基因组估计育种值(GEBV) 的准确度大于0.7。以此阈值作为指导，GS在多年生黑麦草中的前景如何？
多项连锁不平衡(LD)研究(Ponting et al.2007；Auzanneau et al.2007；Xing et al.2007,Fiil et al.2011)结果已揭示出在1kb以内典型的衰减模式。例如，Ponting et al.(2007)证明，在大多数种群类型中(包括生态型和栽培品种)，通过r2测定的连锁不平衡(LD)在1000bp内衰减到0.27以下。Fiil et al.(2011)也发现，连锁不平衡(LD)在代表性基因内快速衰减，尽管某些基因表现出慢得多的衰减率。
多态性非常高的频率和连锁不平衡(LD)的快速衰减都表明，多年生黑麦草具有非常大的过去Ne值。相比之下，人类的连锁不平衡(LD)在约25kb衰减到0.27，因此黑麦草的Ne可能比人类种群估计值大几万倍(如Tenesa et al.2007)。在牛中，连锁不平衡(LD)在约50kb衰减到0.27，且原始种群大小在2000-3000数量级(Bovine Hap Map Consortium 2009)。这些对比表明，要在黑麦草中实施GS，非常密集的标记物是必要的。下面将讨论解决这一问题的策略。
应当注意的是，黑麦草中连锁不平衡(LD)的模式与如玉米的作物中观察到的模式非常不同，其中杂种优势群中、甚至是高度不同的种质中LD是广泛的(Van Inghelandt et al.2011；Yan et al.2009)。此特性允许对基因组估计育种值(GEBV)的准确估计；例如，Riedelshiemer et al.(2012)报道，使用一组56110单核苷酸多态性时，玉米生物量的基因组估计育种值(GEBV)的准确率为0.72；Albrecht et al.(2012)报道，使用仅1152单核苷酸多态性时，在测试杂交后代中谷物产率的基因组估计育种值(GEBV)的准确率为0.72-0.74。
GS实验设计的第二个要素是，确定参考种群中所需要的完全表型分型和基因型分型的个体数量。在自身不具有表型的个体中，基因组估计育种值的准确率是决定性地源自并取决于参考种群中进行基因型分型和表型分型的个体数量、性状遗传率和影响性状的基因座数量(Goddard 2008；Daetwyler et al.2008)。考虑到对影响大多数农业经济上的重要性状的基因座数量所知甚少，种群中基因座数量和独立染色体片段数量之间的对等是一个保守性的假设，并且可以从Ne和L计算得到。此决定性预测表明需要用较大的参考种群来预测准确的基因组估计育种值(GEBV)，特别是对低遗传率性状而言(图169)， 并且与在奶牛育种实验中实现的准确率非常相符(Hayes et al.2009)。再次，考虑到Ne在黑麦草种群中可能非常大，决定性预测将表明，在缺少任何降低连锁不平衡(LD)的策略的情况下，要在黑麦草中实施GS需要非常(且不切实际)大的参考种群。此类策略因此成为在黑麦草中实施GS的关键要素。此外，重要是认识到即便标记物密度没有建议值高，且参考种群的大小低于所需的，只要种群内存在某些结构(例如，如果全同胞和半同胞交配是常见的)，GS可带来收获。单核苷酸多态性(SNP)标记物还可用来追踪种群的谱系和来自父母和其他最近祖先的大染色体块的遗传。Habier et al(2008)证明，基因组估计育种值(GEBV)准确率的相当大一部分实际上是来自于上述来源，特别是在Ne最近已被缩小时，如在大多数饲料育种程序中必然发生的情况。在以下概述的策略中，特别利用了人工减小Ne并因此提高连锁不平衡(LD)程度。
GS应用至饲草育种程序的策略
如上所述，实验证据表明，在多年生黑麦草中连锁不平衡(LD)是有限的，为了有效实施GS，需要策略来减缓这种效应。一个策略是考虑家系(其内部Ne非常小)内存在的连锁不平衡(LD)，其等同于使用连锁信息预测基因组估计育种值(GEBV)。同时使用连锁不平衡(LD)和连锁来预测基因组估计育种值(GEBV)的算法已经可以获得(Meuwissen and Goddard 2004)。此外，尽管需要明确的论证，由于对在育种程序中使用特定种质池的关注，Ne值最近的减小被提前用于饲草物种。这对GS而言是优势，因为需要在参考种群中评估更少的染色体片段(但是近亲繁殖效应必须被小心地处理)。是否Ne值减小已足够大到允许使用实用大小的参考种群，只能通过实验数据的解释来回答，这是当全基因组单核苷酸多态性(SNP)数据可获得时将被解决的首批问题之一。不管结果如何，本文所述方案首先要进一步减小Ne。
现在描述一个可能的用于黑麦草的GS方案，其主要利用家系内信息来进行基因组预测(图170)。本发明人的方案的关键特征是减小世代间隔，其在现存育种程序中通常非常长，因为通常只有完整品种或新获得的种质池被用于产生第一阶段杂交的世代(参见图168)。利用GS，通过缩短世代间隔来加速遗传获得量的机会能够通过从第 一轮选择将优质基因型直接引入第二轮或随后轮的选择中而实现。在此阶段包括的优质基因型的同一性是基于性状(如草本植物产率、品质和持续性)的基因组估计育种值(GEBV)。
本方案的另一个特征是使用基于测序的基因型分型(GBS)。尽管对目前已知的SNP基因座进行基于芯片的格式化以用于高度多路传输基因型分型，在逻辑上是可行的，但是设计的建立成本(由于国际研究和开发团体的规模相对较小)和目前的处理成本(相当于每个样品几百美元)对饲草物种而言是不可能被接受的。相反，在Illumina Hi-Seq平台上标有条形码的多路传输样品可能以降低约一个数量级的成本(例如，每个样品约20美元)交付高密度SNP数据，其成本在不久之后还可能继续降低(Elshire et al.2011)。在从如此“开放”的基因型分型系统获得数据的情况下，GS实施的必要的大量多态性将能够便利地获得。
基础种群的建立
1.所述方案首先评估所获得的优质种质。这是通过建立间隔的植物内野(in-field)育种区而实现，其包含来自多个优质种质来源的个体基因型(约1000个)，具有中度水平的克隆重复(例如，4倍)，以获得约4000无性系分株。在育种区内进行产率、草本植物品质和其他能够在此阶段测定的性状的基因型的直接表型分型评估(图170，框A)。由于目前多年生黑麦草的许多优质品种具有有限的基础，其来自少量亲本(4-6)，因此包含商用种质将倾向于从最初减小Ne。
2.根据育种区数据选择150株最佳表现植物，通过用于成对杂交(paircrossing)的优质基因型表现和最大多样性指数的历史数据放大，以减小Ne。在这些所选优等个体之间，进行一系列成对的“顶级杂交”(topcorss)。为了允许子代组之间更准确的育种值预测，并进一步减小Ne，分配50个基因型作为“双配”亲本，每一个都同两个分别选择的“单配”亲本交配。此过程获得50对F1家系，每对都是基于共同“双配”亲本的半同胞(图170，框B)。
3.根据复杂性降低测序法(如Baird et al.2008；Elshire et al.2011)对150个亲本进行基于测序的基因型分型(GBS)，以鉴定在亲本组内全基因组SNP变异(图3，框B)。
小型草地评估和选择
4.来自每一个全同胞家系的种子被采收，用于建立小型草地，以评估1草地环境中的持久性、疾病抗性和性能(为了允许对竞争效应的估计)。留间隔的植物小型草地被建立，其包含来自每一个家系的100个F1基因型，在1m2的面积上有10cm间隔，对应总计10000个植物基因型2。依靠逻辑上的限制，每一块F1家系特异性草地可被重复以用于额外的评估。例如，3倍重复需要在小型草地上建立30000个不同的植物基因型。在小型草地上，对F1家系进行针对目标性状(如产率、品质、疾病抗性和持久性)的表型评估(图3，框C)。在小型草地中的大量植物可仅需要利用低密度SNP测定(如384-plex Illumina GoldenGateTM测定)进行表型分型，因为能够根据在步骤3中鉴定的SNP使用估算来推断其基因型。Habier et al.(2009)证明，如果对亲本的密集分布的标记物进行了基因型分型，那么此过程能够被非常准确地实现，这正是此实例中的情况(已通过基于测序的基因型分型(GBS)，对其亲本的非常大量的基因座进行了基因型分型)。
5.利用估算数据和小型草地上每株植物的性能数据，更新持续性、竞争效应和其他性状的SNP估算方程(图170，框C)。
6.从第一轮中，有150个基因型的新亲本种群被选择(使用所有性状的基因组估计育种值(GEBV))(从30000个中选择，选择频率为0.5％)，其被保持在最低重复，以减少植物损失(图170，框D)。对这些个体进行步骤3中所述的基于测序的基因型分型(GBS)。
育种区评估步骤
7.为了产生4000个无性系分株的全部取代育种区物种，在下一轮选择中对所选个体进行杂交(图170，框B)。使用低密度标记物组，对这些个体进行基因型分型，估计基因型并计算持久性和疾病抗性的基因组估计育种值(GEBV)。将上述数据同产率和禾本科植物品质的基因组估计育种值(GEBV)结合(其包括来自个体自身记录的信息)，并选择150个体，产生小型草地步骤的子代。
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1获得足够的用于建立小型草地的种子的能力是基于以下估算：通过单个繁殖分蘖产生的种子数量＝50；每株植物繁殖分蘖的数量可高达50(大型盆栽植物)或低至4，当制备克隆用于杂交时，合理的 最小期望值约为10；所以每株植物生产的种子数量约为500；所以通过典型成对杂交产生的种子数量＝1000；最小发芽率＝75％；所以可获得约500-750个可能的萌芽。
2由于明显的边缘效应的可能性，对约每个10×10阵列建立来自一般品种的一组植物。
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重复上述步骤4-7并定期评估遗传获得量。当遗传获得量已足够明确区分某一新的“预先品种”(pre-variety)时，则能发生从150个所选基因型的亚组到合成种群发展的转移。根据预测的性能和遗传距离，总共有16个基因型(约10％选择强度)被选择，以获得4个亲本基因型每一个的4个多系杂交组，来产生限制性基础的预先品种。多位点评估将被用来测定上述合成种群的表型特征，如产率、品质和持久性(图3，框E)。
此方案计划通过基于GS预测值的杂交活动的快速循环，得到最大遗传获得量，特别是对持久性和疾病抗性而言。不同于图1中所示方案，重组和选择作为每个循环的一部分而发生，而非在一个更长的时期内间歇发生。主要的逻辑需求(其用于小型草地建立和评估)，可通过更加激进的策略——其中来自所有初始成对杂交的种子被混合并在单个大规模封闭空间试验中被播种——来降低。然后优质个体通过表型评估被鉴定，并通过低密度的基于SNP的基因型分型被指定至起点杂交(cross-of-origin)。
尽管基因组估计育种值(GEBV)的引出(derivation)会降低对全面表型分型的需求，除了在第一轮选择中，可预料的是，亲本基因型的保留和间隔植物育种区的维护会允许通过对其他性状的评估或对之前测定性状的长期监测而使预测得到改善。间隔植物育种区系统的价值还可通过评估基因型×环境(G×E)效应得到加强。此目标理想地可通过在不同目标环境中建立克隆重复而实现，并且在每个环境中都能产生基因组估计育种值(GEBV)。
此建议方案的关键目标之一是，在育种实践过程中加强单个基因型的重要性，其在传统上与种群整体相比一直受到忽视。保留、集中的表型表征和在完全被记录(基于SNP基因型)的谱系结构中使用将至少部分获得此价值。
结论
尽管与其他主要的作物植物相比，饲草物种在分子育种方面是相对未开发的，GS实施具有实现主要优势的潜力，主要通过在传统用于单轮选择的时间内完成多轮选择的能力。如果能对如持久性和疾病抗性的此类性状进行基因组估计育种值(GEBV)的准确预测，上述结果是可能实现的。关于此类性状的信息目前仅在可能的候选者长到5年之后才能获得。但是，如果要在饲草物种中实施GS，许多挑战必须被克服。DNA标记物资源的相对缺乏和一些物种中多倍体基因组结构的影响构成了首要的挑战。随着基于测序的基因型分型(GBS)越来越便宜，标记物可获得性的障碍将迅速消失，同时用于多倍体基因组基因型分型的强化方法也将被开发(Gidskehaug et al.2011)。
仍存在的两个主要挑战是，在饲草物种(如黑麦草)中程度非常有限的连锁不平衡(LD)，以及在目前育种程序中实施GS的机会受限。在本综述中，第一个因素是通过同时使用家系内连锁信息以提高基因组估计育种值(GEBV)预测的准确率和通过优质品种的育种长期减小种群中的Ne而设法解决。在这些方案中不想要的近交衰退的相关效应能通过将基因组多样性的测定纳入选择标准而得到解决(如Pryce et al.2012)。为了解决第二个因素，已提出一个育种方案，其允许GS通过压缩每轮选择的持续时间而加速遗传获得量。但是，此方案的实施需要对目前的育种方案进行明显的重建。
尽管主要使用可见评估标准的基于野外和基于温室的评估系统迄今为止足够用来进行品种改良，但是分子育种系统的有效使用仍依赖于获得更准确、更具体的表型值(Furbank et al.2009；Houle et al.2010)，例如，通过对来自自动化温室和图像分析表型组学平台的植物生长和性能的“整个生命周期”测定而获得的这些表型值。对于饲草物种育种而言，利用下一代技术对表型变异的准确量化是主要的挑战和机会(Walter et al.2012)。
实施例24——植物-共生生物联合体的基因组选择
人工选择方法依赖于两步方法：首先，重组以产生遗传组分的新排列，第二，以优质表型选择为基础，对新产生的基因型的差别化取样。无性生殖的共生生物(如内生菌、细菌)不参与宿主植物有性生 殖过程中的重组事件。因此在宿主-共生生物对中的变异性产生是自然组合的，对共生联合体有利表达的基因组选择的全部能力将取决于在宿主基因型和共生生物基因型之间产生范围尽可能宽的配对组合的能力。与共生生物的共选择的潜在多样性空间可被估算为：(目标种质池的数量)×(不同共生生物基因型的数量)。因为此数字非常大，使用遗传算法对最大共生物多样性的选择取样是合乎需要的。
进行有性生殖的共生生物(如一些真菌)为在种群中选择对宿主植物有最有益影响的共生生物提供了其他机会。此处需要对共生生物的基因组表征和随后的基因组选择。组合性质将至少保持复杂，但其可潜在地增加到：(目标种质池的数量)×(不同共生生物基因型的数量)×(共生生物基因型组内变体的数量)。
此方法还可应用于吸引共生生物种群的潜力不同的宿主(在数量和多样性两方面)的情况中。因此，基因组选择可用来确定对共生生物范围、多样性和数量的宿主亲和性。
此方法还可应用于豆科植物-根瘤菌共生体、菌根共生体、有利的宿主-共生生物基因组相互作用和宿主-共生生物-环境相互作用的共选择。
实施例25——温季禾本科植物——多年生黑麦草中叶和根微生物组
具有和不具有内生真菌标准毒性多年生黑麦草内生真菌(Neotyphodium lolii)的克隆多年生黑麦草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液(hydrophonic solution)中。不存在碳源，因此内生菌必须依靠来自植物的碳生长。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，植物被冲洗以除去残留的培养液，根和叶在液氮中被速冻。每次处理从5个重复植物的叶和根中提取RNA(120个样品)。
该RNA被用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过RNA seq分析(Illumina HiSeq测序)来分析。使用blastn分析所述文库，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列(hit)。查询的数据库包含植物细胞核基因、具代表性的植物叶绿体和线粒体基因组、内生真菌细胞核和线粒体基因组，以及代表其他真菌、细菌、藻类、昆虫和有孔 虫的序列。第二个数据库包含约120000个经命名的16S序列。命中的序列被记录为超过80％同一性和40bp重叠区的截止值，并根据其来源进行分类。
大多数读段比对定位至植物数据库序列。但是重要的读段比对定位至其他生物种类。图171表示比对定位至完全培养液中无内生菌和包含内生菌的植物的叶和根中的藻类、细菌、真菌(内生菌除外)、昆虫和有孔虫的总读段的百分比。这表明与叶相比，与根相关的微生物水平更高。
实施例26——多年生黑麦草中微生物组的16S分析
具有和不具有标准毒性多年生黑麦草内生真菌的克隆多年生黑麦草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵(counts matrix)。如果有在至少10个不同的文库中被记录的命中序列，则选取数据库序列。
使用核糖体数据库项目分类器(Ribosomal Database Project classifier)(http://rdp.cme.msu.edu/)对上述数据库序列进行分类学上的归类，并分组以示出多年生黑麦草微生物组中代表性微生物在分类学上的分布。由于植物叶绿体是微生物起源的，植物叶绿体序列存在于16S序列数据库中。比对定位至上述序列的读段未包括在分类学总结中。
图172示出了被计数的配对(在>40bp的重叠区上16S blastn命中序列>98％同一性；比对定位>10样品)。每个样品有11000-164000个读段被指定为16S。2774个细菌门(非植物叶绿体)的分布。
实施例27——多年生黑麦草中叶和根微生物组
具有和不具有标准毒性多年生黑麦草内生真菌的克隆多年生黑麦草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵。在10个或更多文库中有命中序列的16S序列的16S计数矩阵被分析，关于来自植物器官的每个数据库序列的计数总和。这些总和本身是通过细菌分类学上的类别总计而得。
图173对分别来自叶和根的读段计数的细菌分类的总和作图。这表明，某些种类的细菌被发现在叶(如蓝细菌属(Cyanobacteria))或根(如鞘脂杆菌属(Sphingobacteria))占优势，而另外一些类别同时被发现在叶和根(如γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria))中占优势。470个16S序列在至少10个叶和10个根文库中命中序列。
实施例28——多年生黑麦草中叶和根微生物组。宏基因组学揭示出幼苗和根微生物组中细菌物种优势的差异。
具有和不具有标准毒性多年生黑麦草内生真菌的克隆多年生黑麦草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的 命中序列的计数矩阵。此矩阵中的计数值(在至少10个样品中存在)被转化为以2为底的对数，并将此矩阵输入MultiExperimentViewer软件(TM4软件套件的一部分，www.tm4.org)。通过用皮尔逊相关的类平均法，所述被转化为对数的矩阵被用于样品组的层次聚类，并且样品的次序得到优化。
由此产生了图174中的样品树。所述聚类证明，来自根的细菌计数矩阵包含能够对植物-微生物组联合体(即共生体)的营养状况分类的标记。此外，叶细菌微生物组清楚地将根和叶区分开(即，在不同的器官(如叶对比根)不同的细菌占优势)。但是叶细菌微生物组未对营养状况进行分类(细菌计数的层次聚类对根处理进行分类，但未对叶处理进行分类)。
实施例29——多年生黑麦草中叶和根微生物组。细菌物种优势的差异取决于共生体的营养状况。
具有和不具有标准毒性多年生黑麦草内生真菌的克隆多年生黑麦草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵。此矩阵中的计数值被转化为以2为底的对数，并将此矩阵输入MultiExperimentViewer软件(TM4软件套件的一部分，www.tm4.org)。然后通过皮尔逊相关和0.75的阈值，16S序列被用于聚类亲和性搜索技术(Cluster Affinity Search Technique)分析。然后通过用皮尔逊相关的类平均法，对生成的聚类分别进行层次聚类，并且16S序列的次序得到优化。
由此产生1036个聚类。在这些聚类中，11个聚类包含矩阵中10个以上基因并包含所述矩阵中47％的基因。此11个聚类中的2个的 实例如图175和图176所示。这些实例显示了(聚类5)细菌序列，其丰度响应于低氨培养液处理而增大；以及(聚类2)细菌序列，其丰度响应于低氨和低硝酸盐处理而减小。
实施例30——多年生黑麦草中叶和根微生物组。共生体中细菌微生物组的宏基因组分析揭示出已知为禾本科植物的固氮菌和植物刺激菌的细菌物种的范围。
具有和不具有标准毒性多年生黑麦草内生真菌的克隆多年生黑麦草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵。
所述矩阵被过滤，以示出比对定位至注释为固氮螺菌属(Azospirillum)种的序列的读段。每个文库中比对定位至此12个序列的计数如图177所示。固已知氮螺菌属种与单子叶植物相关，并且固定大气中的氮和产生植物激素(禾本科植物的植物刺激菌)。12个物种中至少一个能被看到具有在全部低氨样品中增加的计数，在这种情况下大气氮的固定对于与固氮细菌相关的植物而言是有用的。因此，在低氮条件下，固氮螺菌属种被大量诱导。
实施例31——南极洲发草中叶和根微生物组。宏基因组学揭示出多样化的植物细菌微生物组。
来自两个不同种质(accessions)(Da2和Da17)的南极洲发草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同培养液中。它们被用来通过宏基因组学检查叶和根微生物组中丰富的细菌。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被合并并且用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定在不同营养方案下生长的植物中的细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵。如果每个被分析的文库的命中序列计数大于或等于100次计数，则提取数据库序列。
使用核糖体数据库项目分类器(http://rdp.cme.msu.edu/)对上述数据库序列进行分类学上的归类，并分组以示出南极洲发草的叶和根微生物组中代表性微生物按照细菌门的分类学分布(图178)。在7109个鉴定的序列中有203个16S序列。
实施例32——南极洲发草中叶和根微生物组。宏基因组学揭示出幼苗和根微生物组中细菌物种优势的差异。
来自两个不同种质(accessions)(Da2和Da17)的南极洲发草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个复制植物的叶和根提取RNA。该RNA被合并并且用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵。如果每个被分析的文库的命中序列计数大于或等于100次计数，则提取数据库序列。
该计数矩阵被修改，其每个文库中每个数据库序列的计数值除以在所有文库中此序列的平均计数值。将修改后的矩阵输入 MultiExperimentViewer软件(TM4软件套件的一部分，www.tm4.org)，并通过用皮尔逊相关的类平均法，被用于16S序列的层次聚类。
图179所示的热图显示了在幼苗和根中细菌物种优势的差异。
实施例33——南极洲发草中叶和根微生物组。在幼苗和根微生物组中细菌物种优势的差异取决于共生体的营养状况。
来自两个不同种质(accessions)(Da2和Da17)的南极洲发草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被合并并且用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵。如果每个被分析的文库的命中序列计数大于或等于100次计数，则提取数据库序列。
该计数矩阵被修改，其每个文库中每个数据库序列的计数值除以在所有文库中此序列的平均计数值。将修改后的矩阵输入MultiExperimentViewer软件(TM4软件套件的一部分，www.tm4.org)，并通过用皮尔逊相关的类平均法，被用于16S序列的层次聚类。
图180表示所述热图的一个放大区域，显示了响应于根样品中的差异化营养状况的细菌物种优势的差异。
实施例34——南极洲发草中叶和根微生物组。在幼苗和根微生物组中细菌物种优势的差异取决于共生体的营养状况。
来自两个不同种质(accessions)(Da2和Da17)的南极洲发草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被合并并且用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵。如果每个被分析的文库的命中序列计数大于或等于100次计数，则提取数据库序列。
该计数矩阵被修改，其每个文库中每个数据库序列的计数值除以在所有文库中此序列的平均计数值。将修改后的矩阵输入MultiExperimentViewer软件(TM4软件套件的一部分，www.tm4.org)，并通过用皮尔逊相关的类平均法，被用于16S序列的层次聚类。
图181表示所述热图的一个放大区域，显示了响应于叶样品中的差异化营养状况的细菌物种优势的差异。在叶微生物组中，优势细菌物种主要是蓝细菌属。在叶中，所述细菌物种对氮的反应不同(即低氮)。
实施例35——南极洲发草中叶和根微生物组。共生体中细菌微生物组的宏基因组分析揭示出已知为禾本科植物固氮菌和植物刺激菌的细菌物种的范围。
来自两个不同种质(accessions)(Da2和Da17)的南极洲发草植物被种植在6种代表不同营养条件的不同溶液培养液中。
在处理3周(每两周补充培养基以保持离子浓度)之后，每次处理从5个重复植物的叶和根提取RNA。该RNA被合并并且用来构建cDNA RNA seq文库，其是通过Illumina HiSeq测序被分析。
使用blastn分析来自上述文库的读段，并且每个序列读段记录单个数据库命中序列。在本实施例中，所述数据库由117101个16S rRNA序列组成。此rRNA序列被用来从分类上鉴定细菌。对超过98％同一性和40bp的阈值的命中序列进行计数。每个文库的每个数据库序 列的命中序列被计数，并生成每个被分析的文库的每个数据库序列的命中序列的计数矩阵。如果每个被分析的文库的命中序列计数大于或等于100次计数，则提取数据库序列。
上述计数矩阵被修改，其每个文库中每个数据库序列的计数值除以在所有文库中此序列的平均计数值。将修改后的矩阵输入MultiExperimentViewer软件(TM4软件套件的一部分，www.tm4.org)，并通过用皮尔逊相关的类平均法，被用于16S序列的层次聚类。
图182表示所述热图的一个放大区域，显示了被聚类到一起的固氮螺菌属种。这些细菌已知与单子叶植物相关，并且固定大气中的氮和产生植物激素(禾本科植物刺激菌)。这些细菌被证明在根样品的低氮营养液中更占优势。因此，在低氮条件下，固氮螺菌属种被大量诱导。
实施例36——总结
这些实施例表明，禾本科植物共生体的宏基因组学揭示出复杂的内生/附生微生物组和禾本科植物微生物组的物种多样性。在禾本科植物物种之间、根和幼苗之间，以及环境条件之间微生物组存在差异。微生物组特征揭示出物种多样性，可用于共生体性能加强、在不同基因型和环境中的微生物组分析、微生物组监测和微生物组接种。
实施例37——通过对个体反刍动物基因组和瘤胃微生物组特征之间最佳相互作用的基因组选择，使反刍动物性能达到最大程度。
在将低品质的饲料转化为肉、乳和纤维的能力方面，反刍动物是独特的。此独特能力是瘤胃——消化道器官之一，其是大量细菌和其他微生物的宿主——所带来的结果。瘤胃微生物表征可通过取瘤胃液体样品或者替代地分析粪便，并计算物种丰度(例如，通过宏基因组测序)而获得。此特征在反刍动物物种之间和个体之间存在差异。瘤胃微生物特征的差异可能与饲料转化率、乳组分和健康结果的差异有关。因此，进行选择使反刍动物的表型性能达到最大程度，这可通过采用瘤胃特征对最佳的个体反刍动物基因组的基因组选择而实现。考虑到瘤胃中微生物的数量非常庞大，并且反刍动物基因组中的基因数 约为20000，需要遗传算法以使基于多样性的样品组合优先进行。
实施例38——多年生黑麦草中内生菌接种方法
本实施例描述了用皮下注射用的针头穿刺分离的多年生黑麦草胚，然后通过方法1(直接接种)或方法2(用包含内生菌的海藻酸钙层包覆)进行接种，以此来提高内生菌接种频率。
利用方法1或方法2，用内生菌NEA11接种从多年生黑麦草种子分离出的胚，其中内生菌悬液具有不同的稀释率(1/4、1/8、1/16；参见图183)，使用皮下注射用的针头对胚造成或未造成损伤。在接种前穿刺胚大大增加了接种效率，其是通过在从来自接种后胚的人工种子回收的6周龄的共生体中进行基于SSR的内生菌检测来证明(参见表64)。
检测的内生菌
方法1：在海藻酸钙包覆前用内生菌悬液直接接种分离的胚
方法2：用含内生菌的海藻酸钙层直接包覆分离的胚
表64按照不同的内生菌接种处理方法，回收的接种内生菌的多年生黑麦草植物的数量和频率(frequency)。
实施例39——多年生黑麦草和高羊茅中内生菌接种方法
本实施例描述了用皮下注射用的针头穿刺分离的多年生黑麦草和高羊茅(F.arundinacea)胚，然后通过方法1(直接接种)或方法2(用包含内生菌的海藻酸钙层包覆)进行接种，以此来提高内生菌接种频率。
方法1：用内生菌悬液直接接种分离胚，然后用海藻酸钙包覆。
方法2：用包含内生菌的海藻酸钙层直接包覆分离的胚。
利用方法1或方法2，用不同的内生菌(NEA11和NEA17)接种来自不同品种的种子分离出的胚，其中使用皮下注射用的针头对胚 造成或未造成损伤。在接种前穿刺胚大大增加了接种效率，其是通过在从来自接种后胚的人工种子回收的6周龄的共生体中进行基于SSR的内生菌检测来证明(参见表65)。
表65按照不同的内生菌接种处理方法，回收的接种内生菌的多年生黑麦草和高羊茅植物的数量和频率。
实施例40——在奶牛中通过微生物组特征相互作用发现宿主基因型的方法
本实施例描述了一种绘制影响瘤胃微生物特征的宿主基因组区域的方法，并通过实例来说明。
方法
本方法包括有效测试宿主的大量DNA多态性对瘤胃微生物组特征的影响。
对每头奶牛而言，瘤胃微生物组特征包括来源自瘤胃样品的比对定位至所述物种或瘤胃宏基因组拼接的重叠群或16S序列比对的序列读段的计数(例如，参见Brulc et al.2009,Hess et al.2011)。
在与宿主自身基因组DNA多态性的全基因组关联分析中，比对定位至n个重叠群或物种或物种的部分拼接中的每一个的每头奶牛的计数矩阵可被视为基因型(表型)，因此可使一个模型与数据相匹配：
y＝mu+Xb+e
在上式中，对每个重叠群/物种/部分物种拼接而言，y是m头牛 计数的向量，mu是平均值，X是将宿主基因型指定至所述记录的m×1设计向量，e是随机残存效应的向量。
由于重叠群/物种/部分物种拼接的数量n可能较大，鉴定宿主基因组中DNA多态性的能力可通过考虑与重叠群/物种/部分拼接的关联而提高。其可通过以下方式有效完成：对每个重叠群进行全基因组关联分析，然后通过选取每个重叠群最重要的区域积累不同重叠群的信息，再然后评估所述区域最为重要的所有重叠群的次数比例。这可鉴定出对瘤胃微生物组特征的主要宿主调节因子。考虑到奶牛种群中高度变化的连锁不平衡效应，这可在100kb的滑动窗口(sliding window)内完成。
实例
数据来自在DPI Ellinbank研究站吃草的15头荷斯坦-弗里生奶牛。根据Illumina Bovine HD阵列，每头奶牛具有624930个SNP的基因型。
在甲烷测定实验中，从每头奶牛取瘤胃样品。从每个样品中提取DNA，制备300bp随机片段的文库。然后在Illumina HiSeq上进行双端测序。将序列读段与Hess et al.2011中所述的瘤胃宏基因组拼接(8092个重叠群)比对定位。
5项示例全基因组关联研究(对5个不同的重叠群)如图184所示。
在21号染色体上的一个区域被鉴定，其可能是瘤胃微生物组特征的主要调节因子，因为其在5个重叠群中的3个中，与序列读段计数相关联。
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Claims (24)

1.一种用于产生改良生物的方法，包括：
(i)提供生物的种质的文库，以及共生生物的文库；
(ii)用一种或多种选自所述共生生物文库的共生生物接种所述种质文库，以产生共生体；
(iii)培育、选择、筛选和/或评估经接种的种质或共生体的所需共生体特征；和
(iv)随后鉴别、培养又或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良生物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述生物是植物或动物。
3.根据权利要求2的方法，其中所述共生生物能够与所述植物或动物形成共生联合体。
4.根据权利要求3的方法，其中所述共生生物选自真菌、病毒、细菌和其他微生物中的一种或多种。
5.根据权利要求4的方法，其中所述共生生物包含选择用于增强共生生物的性状渐渗的遗传变异。
6.根据权利要求5的方法，其中所述遗传变异是通过随机突变、二-多倍体化、定向诱变、同源转基因、异源转基因、内源转基因中的一种或多种而导入。
7.根据权利要求2的方法，其中所述生物是与内生菌具有共生相容性的植物。
8.根据权利要求7的方法，其中所述植物种质以胚形式存在。
9.根据权利要求8的方法，其中所述胚是用含共生生物的包衣层包覆，以形成人工种子。
10.根据权利要求9的方法，其中所述胚被处理以产生一个或多个所述共生生物的进入点。
11.根据权利要求1的方法，其中将一群植物种质用一群共生生物接种，使得可鉴别有利的宿主-共生生物联合体。
12.根据权利要求1的方法，其中所述筛选步骤(iii)包括通过加速老化筛选人工种子和/或其后代的相容性和/或稳定性，以及选择表现出所需特征的共生体。
13.根据权利要求12的方法，其还包括对所选择的共生体进行快速内生菌生活力测定。
14.根据权利要求2的方法，其中所述生物是植物，所述方法包括：
(i)提供了植物种质的文库；以及内生菌和/或附生植物和/或与植物联合的微生物组的文库；
(ii)用一种或多种选自所述文库的内生菌和/或附生植物和/或与植物联合的微生物组接种所述植物种质文库，以产生共生体；
(iii)培育、选择、筛选和/或评估所述共生体的所需共生体特征；和
(iv)鉴别、培养又或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良植物。
15.根据权利要求14的方法，其中所述植物是禾本科植物或豆科植物。
16.根据权利要求2方法，其中所述生物为动物，此方法包括：
(i)提供了动物种质的文库；以及共生生物的文库；
(ii)用一种或多种选自所述共生生物文库的共生生物接种所述动物种质文库，以产生共生体；
(iii)培育、选择、筛选和/或评估所述共生体的所需共生体特征；和
(iv)鉴别、培养又或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良动物。
17.根据权利要求13的方法，其包括对表现出所需特征的动物共生体进行分子基因型分型和/或表型分型。
18.一种具有共生生物的改良生物，其是使用根据权利要求1-17任一项的方法而产生。
19.根据权利要求18的改良生物，其中所述生物为植物。
20.衍生自根据权利要求19的植物且被内生菌稳定感染的植物、植物种子或其他植物部分。
21.一种生物-共生生物联合体的基因组选择方法，所述方法包括：
(i)提供了来自所述生物或所述生物-共生生物联合体的核酸样品的文库；
(ii)使用宏基因组学分析所述样品，获得每个样品的遗传特征；
(iii)选择具有所需遗传和代谢特征的生物-共生生物联合体。
22.根据权利要求21的方法，其包括下述预先步骤：
(i)提供一种生物-共生生物联合体；
(ii)使所述生物-共生生物联合体受到一种或多种环境条件的处理；和
(iii)从每种经过环境条件处理的生物-共生生物联合体制备核酸样品的文库。
23.根据权利要求21或22的方法，其中所述生物是植物，并且所述共生生物是细菌微生物组。
24.根据权利要求1或21的方法，其基本上如前文所述，参照任一个附图和实施例。
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