CN111787787B - 用于丛枝菌根真菌在植物中的根定殖的叶标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定第一植物与丛枝菌根真菌(AMF)结合的方法，所述方法包括将所述第一植物的地上部分中布卢门醇的量与第二植物的地上部分中所述布卢门醇的量进行比较，其中所述第二植物属于与所述第一植物相同的物种，并且其中与所述第二植物相比，增加的量指示所述第一植物中结合增加，并且减少的量指示结合减少。

Description

用于丛枝菌根真菌在植物中的根定殖的叶标志物
本发明涉及测定第一植物与丛枝菌根真菌(AMF)(arbuscular mycorrhizalfungus)结合(association)的方法，所述方法包括将所述第一植物的地上部分中的布卢门醇(blumenol)的量与第二植物的地上部分中的所述布卢门醇的量进行比较，其中所述第二植物属于与所述第一植物相同的物种，并且其中与所述第二植物相比，增加的量指示在所述第一植物中结合增加，并且减少的量指示结合减少。
在本说明书中，引用众多文件，包括专利申请和生产商手册。这些文献的公开内容，虽然不认为其与本发明的可专利性相关，但通过引用的方式完整并入本文。更具体地，所引用的全部文献通过引用的方式以相同的程度并入，就如同具体且各自地指出通过引用的方式并入每份单独的文献。
认为真菌和植物之间的共生性相互作用(所谓的菌根(mycorrhiza))是允许植物定殖陆生生境的最重要因素之一(Brundrett和Tedersoo(2018)Evolutionary history ofmycorrhizal symbioses and global host plant diversity.New Phytologist doi:10.1111/nph.14976)。最突出形式之一是可以由许多高等植物(包括作物植物)形成的丛枝菌根(AM)。AM以被定殖的植物根的皮质细胞内的丛枝菌根真菌(AMF)形成的特征性菌丝结构而得名。这些所谓的丛枝吸胞是植物和真菌之间的资源交换的主要部位。在真菌促进摄取无机养分尤其磷(P)和氮以及水的同时，植物通过光合产物向真菌供应碳能量储备(Baier等人(2010)Knockdown of the symbiotic sucrose synthase MtSucS1 affectsarbuscule maturation and maintenance in mycorrhizal roots of Medicagotruncatula.Plant Physiology 152,1000-1014；Doidy等人(2012).The Medicagotruncatula sucrose transporter family:characterization and implication of keymembers in carbon partitioning towards arbuscular mycorrhizal fungi.MolecularPlant 5,1346-1358；Marschner和Dell(1994)Nutrient uptake and mycorrhizalsymbiosis.Plant and Soil 159,89–102)。P是陆生的、淡水的和海洋条件下植物生长的主要限制性因素(Elser等人(2007)Global analysis of nitrogen and phosphoruslimitation of primary producers in freshwater,marine and terrestrialecosystems.Ecology Letters 10,1135-1142)，并且甚至在植物的环境中以足够量存在时，它也经常处于植物不可利用的形式(Bieleski(1973)Phosphate pools,phosphatetransport,and phosphate availability.Annual Review of Plant Physiology 24,225-252；Schachtman等人(1998)Phosphorus uptake by plants:From soil tocell.Plant Physiology 116,447-453)。因此，大量P肥被用于高强度农业中(MacDonald等人(2011)Agronomic phosphorus imbalances across the world'scroplands.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 108,3086-3091)，这大大促进我们水体的富营养化(Smith和Schindler(2009)Eutrophication science:where do we go from here？Trends inEcology&Evolution 24,201-207)。另外，用于肥料的P衍生自磷酸岩，这是一种不可再生资源，并且预测这些储量不久将耗尽(Cordell等人(2009)The story of phosphorus:Globalfood security and food for thought.Global Environmental Change 19,292-305；Vaccari和Strigul(2011)Extrapolating phosphorus production to estimateresource reserves.Chemosphere 84,792-797)。众所周知，AMF可以在P受限条件下促进植物生长(Rooney等人(2009)Mycorrhizas and biomass crops:opportunities for futuresustainable development.Trends in Plant Science 14,542-549；Adolfsson等人(2015)Mycorrhiza symbiosis increases the surface for sunlight capture inMedicago truncatula for better photosynthetic production.PLoS ONE 10,e0115314；Nouri等人(2014)Phosphorus and nitrogen regulate arbuscularmycorrhizal symbiosis in Petunia hybrida.PLoS One 9,e90841)，因此，一种前进道路是通过用于增强AMF结合的育种，改进我们作物植物的P摄取效率(van de Wiel等人(2016)Improving phosphorus use efficiency in agriculture:opportunities forbreeding.Euphytica207,1-22)。尽管用于增强AMF结合的育种在基于廉价P的肥料时代尚不具有优先地位，并且驯化甚至导致作物植物中AMF共生效率的破坏(Martin-Robles等人(2017)Impacts of domestication on the arbuscular mycorrhizal symbiosis of27crop species.New Phytologist doi:10.1111/nph.14962)，但这种情况确实正在改变。还已知与AMF的结合增加植物针对疾病和非生物的胁迫如盐度、干旱或重金属的抗性，因此，用于AMF结合的育种可以为农业生产提供众多高价值的益处(Whipps(2004)Prospectsand limitations for mycorrhizas in biocontrol of root pathogens.CanadianJournal of Botany 82,1198-1227；Nadeem等人(2014)The role of mycorrhizae andplant growth promoting rhizobacteria(PGPR)in improving crop productivityunder stressful environments.Biotechnology Advances 32,429-448；Hohmann和Messmer(2017)Breeding for mycorrhizal symbiosis:focus on diseaseresistance.Euphytica 213,11)。为了改进AM在未来农业战略中的实施，有必要开发快速和容易操作的筛选方法，所述筛选方法提供关于植物与AMF相互作用的可靠信息。
不幸的是，分析AMF定殖是一个冗长和破坏性的过程。例如，需要根组织的显微镜分析或核酸分析(参见例如中国专利申请CN 106011256和CN106566869)。这些过程是费力、昂贵和费时的并且与育种程序的高通量(HTP)要求不相容。因此，开发出表征AMF结合的高效HTP方案是高价值目标。为了避免对根材料的冗长和破坏性的收获和分析，各种研究设法在更易取得的植物地上部分中鉴定AMF结合的合适标志物。Peipp等人((1997)Arbuscularmycorrhizal fungus-induced changes in the accumulation of secondary compoundsin barley roots.Phytochemistry 44,581-587)分析了菌根化和非菌根化的植物的根组织和枝条(shoot)组织中的代谢物并且报告：“从菌根化和非菌根化的植物的枝条提取物中未观察到明显差异”。稍后的研究发现多种与初级和次生代谢有关的代谢及转录变化(Taylor和Harrier(2003)Expression studies of plant genes differentiallyexpressed in leaf and root tissues of tomato colonised by the arbuscularmycorrhizal fungus Glomus mosseae.Plant Molecular Biology51,619-629；Kogel等人(2010)Transcriptome and metabolome profiling of field-grown transgenic barleylack induced differences but show cultivar-specific variances.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 107,6198-6203；Adolfsson等人(2017)Enhanced secondary-and hormone metabolism in leavesof arbuscular mycorrhizal Medicago truncatula.Plant Physiology 175,392-411)。但是，被发现响应于AMF相互作用而上调的枝条特征也已知响应于多种刺激物，使得这些特征不适宜作为AMF定殖的特异性和可靠的标志物：例如Aliferis等人发现的茉莉酸酯((2015)Metabolic responses of willow(Salix purpurea L.)leaves tomycorrhization as revealed by mass spectrometry and 1H NMR spectroscopymetabolite profiling.Frontiers in Plant Science 6,344)是对抗草食动物的经典防御调节物。Kogel等人((2010)Transcriptome and metabolome profiling of field-grown transgenic barley lack induced differences but show cultivar-specificvariances.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 107，6198-6203)的结果显示，代谢物分析比转录物分析可能更适合分析植物枝条中AM介导的变化。Schweiger和Müller((2015)Leaf metabolome inarbuscular mycorrhizal symbiosis.Current Opinion in Plant Biology 26,120-126)最近综述了已经实施的携带AMF共生的植物的叶代谢组学研究，得出以下结论：“AM介导的对叶代谢组学的影响具有高度多样性，在跨多个分类单位的众多植物物种中大量代谢物类别被特异性调节。甚至在更保守的初级代谢内，未发现针对AM的共同响应模式”。因此，迄今尚未鉴定到具有允许可靠的和特异性的检测AMF定殖程度的特性的枝条代谢物或分子标志物。
发现布卢门醇型代谢物在AMF定殖的植物的根中蓄积(综述见Strack和Fester(2006)Isoprenoid metabolism and plastid reorganization in arbuscularmycorrhizal roots.New Phytologist 172,22-34)。更早的报告提示了某些布卢门醇在植物地上部分中的组成型水平以及这些化合物还存在于已知已丧失其建立AMF相互作用能力的植物科中(十字花科(Brassicaceae)：Cutillo等人((2005)C13norisoprenoids fromBrassica fruticulosa.Natural Products Research 19,99-103)；荨麻科(Urticaceae)：Aishan等人((2010)Urticaceae:Aishan et al.((2010)The constituents of Urticacannabina used in Uighur medicine).Pharmaceutical Biology 48,577-583))。Adolfsson等人((2017)Enhanced secondary-and hormone metabolism in leaves ofarbuscular mycorrhizal Medicago truncatula.Plant Physiol 175，392-411)分析了有和没有AMF定殖的植物的叶中的布卢门醇积累以及其他代谢物，但是未观察到布卢门醇类或其生物合成的特有转录物的AMF特异性上调。甚至发现一些布卢门醇衍生物随AMF定殖而下调。
本发明要解决的技术问题可以在提供用于确定植物中根被AMF定殖的改进手段和方法中看到。这个技术问题由所附权利要求的主题解决。
因此，在第一方面，本发明涉及一种测定第一植物与丛枝菌根真菌(AMF)结合的方法，所述方法包括将所述第一植物的地上部分中布卢门醇的量与第二植物的地上部分中所述布卢门醇的量进行比较，其中所述第二植物属于与所述第一植物相同的物种，并且其中与所述第二植物相比，增加的量指示所述第一植物中结合增加，并且减少的量指示结合减少。
可以理解，术语“结合”指功能性结合。本领域已知，AMF穿透维管植物的根的皮质细胞。在真菌和植物之间形成功能性结合期间，皮质细胞改变其形态。这包括出现称作丛枝吸胞的结构。术语“结合”包括形成丛枝吸胞。
与上文有关，也在本文说明书中使用的术语“定殖”指形成所述结合的过程。一种给定的真菌能定殖于一种给定的植物的能力提示，在所述植物和所述真菌之间可以形成结合。
作为结合的指示物的本发明化合物类别是布卢门醇类。布卢门醇是类胡萝卜素类的分解产物。它们包含通常具有13个碳原子的含环己烯酮的部分。该部分可以进一步衍生化，例如，用糖衍生、羧化和/或羟化。如果布卢门醇被糖基化，则上文提到的含环己烯酮的部分通常称作苷元。本发明优选的布卢门醇是布卢门醇C和布卢门醇B以及它们的衍生物，优选的衍生物是糖基化、羧化和/或羟化的。另外，可能向布卢门醇C的丁基侧链引入双键。布卢门醇C是现有技术中已知的(4-(3-羟基丁基)-3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-酮)。布卢门醇B是现有技术中已知的(4-羟基-4-(3-羟基丁基)-3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-酮)。本发明优选的布卢门醇是下文进一步公开的优选实施方案的主题。不太优选布卢门醇A及其衍生物。
术语“测定”包括对所述结合的定性和定量评估。为了给出实例(下文给出其他实例和优选实施方案)，所述第二植物可以是已知完全不含任何与AMF结合的植物。在这类条件下，第一植物中所测定的增加的量表示存在结合。在另一方面，如果所述第二植物具有与AMF的结合，则第一植物中增加的量表示在所述第一植物中结合的程度较高，并且第一植物中减少的量表示在所述第一植物中结合的程度更低。本发明布卢门醇的不存在或不可检出通常表示不存在结合。
根据第一方面，第一植物和第二植物属于相同物种。所述第二植物中布卢门醇的量一般起到建立基线值或参照状态的作用。
一般而言，为了清楚的原因，引入术语“第一植物”和“第二植物”。应当指出，第一植物和第二植物可以是、但不必须是相同个体，例如处于不同时间点的相同个体。
术语“丛枝菌根真菌”具有其现有技术确定的含义。它指能够在维管植物的根中形成上文提到的丛枝吸胞的真菌。这些真菌属于球囊菌门(Glomeromycota)。优选的AMF是下文进一步公开的优选实施方案的主题。
所述的“比较”提示彼此将要比较的两个值是已知的。因此，除比较步骤之外，该方法还可以包括通过实验手段测定一个或两个彼此进行比较的值的步骤。然而，当实施第一方面的方法时，并不是必然地必须进行这种测定。为了进一步解释，可以例如从文献取得或在数据库中查询一个或两个彼此待比较的值。只要两个待比较的值取自这类来源，则优选第一方面方法在计算机中模拟实施。换句话说，该方法可以是计算机实施的方法。优选的实施需要确定布卢门醇在所述第一植物中的量，并利用文献或数据库或其他来源查询所述布卢门醇在所述第二植物中的量。
应当理解，所述第一植物和第二植物，只要二者均与AMF结合，则与相同的AMF物种(优选相同的AMF菌株)或与多个AMF物种的相同混合物(优选相同的AMF菌株)结合。
所述的量(或值)可以是单个测量值或多个测量值的平均值。在多个测量值的情况下，优选算术平均值或中位数。
如果提到“增加的量”和“减少的量”，应当理解，分别优选统计学显著的增加和减少。为了确定统计学显著性，可以使用关于方差的信息σ2。在单次测量的情况下，方差可以从其他来源(如文献和数据库)已知。可选地且在多个测量情况下(所述多个测量在实施第一方面方法的过程中进行或取自多个来源如文献和数据库)，可以从所考虑的相同数据系列确定平均值和方差。示例性或优选的统计学显著性指标是距离平均值的差异，其以标准差σ的倍数(如2或更大的σ的差异视为显著)或p值为0.05或更小来表示。
术语“量”具有其现有技术确定的含义并且涵盖质量(例如以g计)、物质的量(例如以mol计)和浓度(以现有技术确定的单位如mol/g植物组织和g/g植物组织进行测量)。另外，如果在本领域中以直接代表值来建立质量、物质的量和浓度的相对量值(例如，所用检测系统的信号强度)，则考虑这些相对量值。
术语“地上部分”具有其现有技术确定的含义并指暴露于空气的那些植物部分。因此，该术语不包括在土壤或土地中的植物部分。下文进一步公开优选的地上部分。
所述第一植物没有具体限制。它可以是能够建立与AMF结合的植物，但并不必须如此。
例如，如果第二植物是没有任何结合的植物，并且在应用第一方面的方法之前已经使第一植物与能够定殖的AMF接触足够时间，则不存在任何可检出的量的布卢门醇表示，所述第一植物有能力形成低于已确定的阈值的结合(包括不能够形成结合)。
否则，第一方面的方法的重要应用是在那些已知能够建立结合的植物中测定结合程度的领域。
在那些其中需要事先确定给定植物是否能够建立与AMF结合的情况下，通过现有技术建立的方法可以做到，所述方法包括显微镜检测(参见例如Vierheilig等人(2005)Anoverview of methods for the detection and observation of arbuscularmycorrhizal fungi in roots.Physiologia Plantarum 125,393-494)或分子检测(参见例如Park等人(2015)Hyphal branching during arbuscule development requiresreduced arbuscular mycorrhiza1.Plant Physiology 169,2774–2788；Alkan等人(2006)Analysis of quantitative interactions between two species of arbuscularmycorrhizal fungi,Glomus mosseae and G.Intraradices,by Real-Time PCR.Appliedand Environmental Microbiology 72,4192-4199；和Gutjahr等人(2008)Arbuscularmycorrhiza-specific signaling in rice transcends the common symbiosissignaling pathway.Plant Cell 20,2989-3005)在根中的AMF定殖。
在很多情况下，关于AMF易感性的知识可从文献获得。
在现有技术中，已经描述了具有AMF结合的植物的根中某些布卢门醇类出现。然而，现有技术未曾建立植物与AMF结合和叶或其他地上部分中布卢门醇存在情况之间的正相关关系。相反，例如在Adolfsson等人((2017)Enhanced secondary-and hormonemetabolism in leaves of arbuscular mycorrhizal Medicago truncatula.PlantPhysiology 175,392-411)中，描述某些布卢门醇的水平在AMF定殖后下降。
通常，不能预期代谢物和植物的一个部分中出现的代谢物反应也可存在于植物的其他部分(例如根相比于地上部分)。相反，代谢物的植物部分特异性的出现是常见和熟知的；参见例如Li等人((2016)Illuminating a plant's tissue-specific metabolicdiversity using computational metabolomics and information theory.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,113,E7610-E7618)和Lee等人((2017)What happens in the pith stays in the pith:tissue-localized defense responses facilitate chemical niche differentiationbetween two spatially separated herbivores.The Plant Journal,92,414-425)。
另外，现有技术中已经尝试将植物的叶中出现的代谢物的存在或量与菌根定殖相关联。然而，这些尝试失败了。尤其是，现有技术中不能找到以下提示：布卢门醇将有资格作为植物地上部分中出现的菌根化标志物(参见上文简介部分中的现有技术综述)。
尤其通过依赖高效分析方法和数据分析方法，发明人可以确立，不论现有技术中的阴性结果，布卢门醇的确有资格作为菌根结合的标志物，其中可以基于取自植物地上部分的样品测定所述结合。
这提供了显著的优点，注意的是，用于可靠确定菌根结合的已建立的方法需要从植物的根取得样品。这不仅繁琐而且不适应于接受快速和高通量分析。来自叶的样品是迅速和容易获得的并且可以通过直接采集叶或使用诸多手段如打孔获得。另外，该方法仅向相应的植物引入轻微损伤，而根采样通常是高度破坏性过程。
第一方面的方法的其他优点包括，布卢门醇是小且稳定的有机分子，所述有机分子在一方面适应于质谱仪中和通过光谱技术分析并且在另一方面在尺寸上足以被抗体特异性检测。布卢门醇可以通过提取(例如，用甲醇提取)而与植物地上部分的其他组分分离。
在一个优选的实施方案中，(a)第一植物和第二植物是导管植物，优选单子叶植物，更优选地选自小麦属(Triticum)，包括普通小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeumvulgare)、玉蜀黍(Zea mays)；葱属(Allium)，包括韭葱(Allium porrum)和洋葱(Alliumcepa)、梯牧草(Phleum pratense)、无芒雀麦(Bromus inermis)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、紫御谷(Pennisetum glaucum)；稻属(Oryza)，包括稻(Oryzasativa)；和高粱属(Sorghum)，包括两色蜀黍(Sorghum bicolor)和Sorghum drummondii，或双子叶植物，更优选选自向日葵(Helianthus annuus)、莴苣(Lactuca sativa)、刺菜蓟(Cynara cardunculus)、黄瓜(Cucumis sativus)、大豆(Glycine max)、草香豌豆(Lathyrus sativus)、兵豆(Lens culinaris)、白车轴草(Trifolium repens)、亚麻(Linumusitatissimum)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、芝麻(Sesamum indicum)、胡萝卜(Daucuscarota)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、蚕豆(Vicia faba)、黑果醋栗(Ribes nigrum)，长辣椒(Capsicum annuum)、松草莓(Fragaria X ananassa)；烟草属(Nicotiana)，包括渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata)和普通烟草(Nicotiana tabacum)；苜蓿属(Medicago)，包括蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和紫花苜蓿(Medicago sativa)，和茄属(Solanum)，包含番茄(Solanum lycopersicum)和马铃薯(Solanum tuberosum)；和/或(b)所述第一植物和所述第二植物属于相同的亚种、变种、亚变种、变型或亚变型。
导管植物也称作维管植物。认为约70-80％的维管植物可以被AMF定殖。如上文所示，关于形成结合的能力的知识不是植物进行第一方面的方法的要件。如果需要这点，可以用(上文所述的)现有技术确定的方法或下文进一步公开的本发明方法评估这点。
上述对属和种的逐条陈述仅是示例性的且非限制性的。从所附实施例可见，本发明已经用多种植物以及多种AMF付诸实施。
关于上文公开的优选实施方案的项(b)，我们指出，布卢门醇响应于AMF定殖而存在于给定的物种中是保守的并且因此还拓展至亚种等。
在进一步优选的实施方案中，(a)所述地上部分选自叶、枝条、花、茎、分生组织、果实、种子、蒴果、渗出物和花蜜；和/或(b)所述第一植物的地上部分和所述第二植物的地上部分是选自(a)的列表的相同部分和/或包含相同组织或由相同组织构成。
根据项(b)的相同部分指那些优选的实施方案，其中例如叶取自第一植物和第二植物二者，或茎取自第一植物和第二植物二者。如果植物呈现多个特定的地上部分(如幼叶和老叶或来自枝条上半部分和下半部分的叶)，优选从第一植物和第二植物的对应部分取得样品。
在进一步优选的实施方案中，所述布卢门醇是式(I)或(II)的化合物：
其中R1和R2各自独立地选自-CH3、-CH2OH、-COOH和-CH2-O-Glyc；R3是–H、-OH或-O-Glyc；R4是-H或-Glyc；Glyc是糖部分。
优选R4是Glyc。
在式(I)情况下，优选
R1是–CH3，R2是-CH3，并且R3是-H；
R1是-CH2OH，R2是-CH3，并且R3是-H；
R1是-COOH，R2是-CH3，并且R3是-H；
R1是-CH3，R2是-COOH，并且R3是-H；或
R1是-CH3，R2是-CH3，并且R3是-OH。
在式(II)的情况下，优选
R1是–CH3，并且R2是-CH3。
Glyc优选地选自-Glc、-Glc-Rha、-MalGlc-Api、-MalGlc、-Glc-Api、-Glc-(Glc)2、-HmgGlc、-Glc-Arb、-(Glc-GlcU)-Rha、-Hmg(MalGlc)、-Glc-GlcU、-Glc-Glc和-MalGlc-GlcU，其中Glc是葡萄糖，Rha是鼠李糖，Mal是丙二酰，Api是芹菜糖，Hmg是3-羟基3-甲基戊二酰，Arb是阿拉伯糖，并且GlcU是葡糖醛酸。
用于优选的糖部分的符号采用Strack和Fester((2006)Isoprenoid metabolismand plastid reorganization in arbuscular mycorrhizal roots.New Phytologist172,22-34)；Schliemann等人((2008)Accumulation of apocarotenoids in mycorrhizalroots of leek(Allium porrum).Phytochemistry 69,1680-1688)；和Hill等人((2018)Arbuscular mycorrhizal fungi and plant chemical defence:Effects ofcolonisation on aboveground and belowground metabolomes.Journal of ChemicalEcology https://doi.org/10.1007/s10886-017-0921-1)。这些出版物中给出的化合物还定义了本发明优选的布卢门醇。
特别地，优选下表1中命名为1至19的化合物(复制自Strack和Fester((2006)Isoprenoid metabolism and plastid reorganization in arbuscular mycorrhizalroots.New Phytologist 172,22-34))、表2中命名为1至11的化合物(复制自Schliemann等人((2008)Accumulation of apocarotenoids in mycorrhizal roots of leek(Alliumporrum).Phytochemistry 69,1680-1688)和表3中命名为1至7的化合物(复制自Hill等人((2018)Arbuscular mycorrhizal fungi and plant chemical defence:Effects ofcolonisation on aboveground and belowground metabolomes.Journal of ChemicalEcology https://doi.org/10.1007/s10886-017-0921-1)。
更优选糖基部分(缩写为Glyc)选自葡萄糖；6’-丙二酰葡萄糖；葡萄糖-(1”→4’)-葡萄糖；葡萄糖-(1”→6’)-葡萄糖；鼠李糖-(1”→6’)-葡萄糖；阿拉伯糖-(1”→6’)-葡萄糖；葡糖醛酸-(1”→2’)-葡萄糖；葡糖醛酸-(1”→2’)-(6’-丙二酰葡萄糖)；芹菜糖-(1”→2’)-葡萄糖；芹菜糖-(1”→2’)-(6’-丙二酰葡萄糖)；葡萄糖-(1”’→2’)-(葡萄糖-(1”→6’)-葡萄糖)；葡糖醛酸-(1”’→2’)-(鼠李糖-(1”→6’)-葡萄糖)；3’-(3-羟基-3-甲基戊二酰)葡萄糖；和3’-(3-羟基-3-甲基戊二酰)6’-丙二酰葡萄糖。优选苷元作为O-葡糖苷连接于第一个葡萄糖的1’位置。
表1：从多种植物的菌根分离的糖基化C13环己烯酮衍生物的结构
在列出的全部化合物中：Api是β-芹菜糖；Glc是β-葡萄糖；Rha是鼠李糖；GIcU是β-葡糖醛酸酯；Mai是丙二酰。
aAs是燕麦；Hv是大麦；Le是番茄；Lj是百脉根(Lotus japonicus)；Mt是蒺藜苜蓿；Nr是黄花烟草(Nicotiana rustica)；Nt是普通烟草；Ou是伞形虎眼万年青(Ornithogalumumbellatum)；Sc是黑麦(Secale cereale)；Ta是普通小麦(Triticum aestivum)；Zm是玉蜀黍(Zea mays)。
b根的AM特异性黄色色素的组分的水解产物。
c在燕麦族(Aveneae)、早熟禾族(Poeae)和小麦族(Triceae)的多种成员中也鉴定到的Blumenin，以及化合物10和偶发的化合物7。
dΔ7-8存在。
表2：来自韭葱(A.porrum)的菌根的环己烯酮衍生物的保留时间、HPLC-PDA和MS数据
化合物编号对应于图1中的峰编号。
aA：苷元。
表3：泽菊(ragwort)根中鉴定的在根内球囊霉(Rhizophagus irregularis)定殖后显著增加的代谢物
图2中给出的结构
r.t.＝保留时间
a倍数变化表示与对照植物中观察到的浓度相比时，AMF定殖的根中浓度升高
b在Bonferroni修正后使用t检验(c)或Mann-Whitney U检验(未标记)确定的显著性
*相同代谢物的[M+H]+和[M-H]-信号之间估计倍数变化的差异归因于存在在阳性ESI模式下与[M+H]+离子竞争的Na加合物
特别优选的布卢门醇是11-羟基-布卢门醇C 9-O-Glc、11-羧基布卢门醇C 9-O-Glc、布卢门醇B 9-O-葡糖苷、布卢门醇C 9-O-葡糖苷、羟基布卢门醇C双糖苷(含有己糖和戊糖)、布卢门醇C 9-O-葡糖苷-葡糖苷酸、11-羟基布卢门醇C 9-O-葡糖苷-鼠李糖苷、和布卢门醇C 9-O-葡糖苷-鼠李糖苷。
通常，可以发现一种以上的上述优选的布卢门醇与给定植物中的菌根定殖相关。然而，在一些情况下，已经发现特别优选的布卢门醇作为特定植物中菌根结合的标志物。下文给出这些。
渐狭叶烟草：11-羧基布卢门醇C 9-O-葡糖苷，11-羟基布卢门醇C 9-O-葡糖苷；马铃薯：11-羧基布卢门醇C 9-O-葡糖苷；番茄：11-羧基布卢门醇C 9-O-葡糖苷；二穗短柄草：11-羧基布卢门醇C 9-O-葡糖苷，布卢门醇B 9-O-葡糖苷，布卢门醇C 9-O-葡糖苷；蒺藜苜蓿：羟基布卢门醇C双糖苷(含有己糖和戊糖)，布卢门醇B 9-O-葡糖苷；普通小麦：11-羧基布卢门醇C 9-O-葡糖苷，11-羟基布卢门醇C 9-O-葡糖苷，布卢门醇C 9-O-葡糖苷-葡糖苷酸；大麦：11-羧基布卢门醇C 9-O-葡糖苷，11-羟基布卢门醇C 9-O-葡糖苷，11-羟基布卢门醇C 9-O-葡糖苷-鼠李糖苷，布卢门醇C 9-O-葡糖苷-鼠李糖苷；稻：11-羟基布卢门醇C 9-O-葡糖苷，11-羧基布卢门醇C 9-O-葡糖苷。
在进一步优选的实施方案中，所述AMF是球囊菌门(Glomeromycota)的真菌，并且优选选自根内球囊霉(Rhizophagus irregularis)、摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)、地表球囊霉(Glomus versiforme)、无梗囊霉属物种(Acaulospora sp.)、原囊霉属物种(Archaeospora sp.)、幼套球囊霉(Claroideoglomus etunicatum)、异配盾孢囊霉(Dentiscutata heterogama)、微白巨孢囊霉(Gigaspora albida)和极大巨孢囊霉(Gigaspora gigantea)。
其他关于AMF、尤其球囊菌门真菌的信息可以见于MaarjAM数据库，所述数据库在以下出版物中描述：等人((2010)The online database MaarjAM reveals globaland ecosystemic distribution patterns in arbuscular mycorrhizal fungi(Glomeromycota).New Phytologist 188,223-241)。
在又一个优选的实施方案中，(i)所述第二植物没有任何与AMF的结合；(ii)所述第二植物具有与AMF的结合；(iii)所述第一植物和所述第二植物是在不同时间点的相同个体；(iv)所述方法包括测定所述布卢门醇在所述第一植物中的量；(v)所述方法包括测定所述布卢门醇在所述第二植物中的量；和/或(vi)所述比较以计算机实施方式实现。
以上优选实施方案的项(i)限定了第一方面的方法的优选基线值，所述优选基线值允许测定第一植物中AMF结合的存在或不存在(至少低于测定阈值，所述测定阈值是正在使用的分析方法的检测阈值)。
项(ii)涉及不同的优选基线值，即其中第二植物的确具有与AMF的结合。而且，该类型的比较有实践价值，尤其当涉及优化植物-AMF结合时。例如，所述第二植物可以与通常存在或(例如由育种者或农业领域内)通常上使用的特定AMF结合。为了检验目的，可以使新类型的AMF与第一植物(优选地属于与第二植物相同的物种、亚种、变种、亚变种、变型或亚变型)接触并且在形成功能性结合的足够时间已经过去后，可以确定布卢门醇在所述第一植物中的水平并将其与所述第二植物比较。如果新类型的AMF产生较高的布卢门醇水平，则所述新类型AMF是替换已建立的AMF的候选物或额外提供新类型的AMF。可以进行这种替换以改进资源获取、改进胁迫抗性和/或在某些情况下改进所述植物的产量。关于本发明这类用途的进一步详情，我们参考下文公开的本发明其他方面。
项(iii)涉及那些其中相同的个体植物用来限定基线值的优选实施方案。
可以理解，可以反复地应用第一方面的方法。换句话说，可以记录时间系列，其中时间系列指示随时间推移的结合程度。换言之，本发明允许监测植物的菌根化状态。
项(iv)和(v)强制性地实际测定了第一植物和/或第二植物中的布卢门醇水平。下文给出优选的测定手段。
项(vi)涉及第一方面的方法的计算机实施。基本上，无论项(iv)和/或(v)是否与项(vi)组合，该方法可以通过计算机实施。如果第一植物和第二植物中的量均取自文件、出版物或数据库，则优选项(vi)。
只要技术上有意义，项(i)至(vi)中两者或更多者可以彼此组合。优选的组合是项(i)与项(iv)组合以及项(ii)与项(iv)组合。在这两种情况下，优选地可以向这些特别优选的组合添加项(vi)。另外，在这两种情况下以及与项(vi)组合的情况下，所述第二植物中的量优选地取自知识库例如出版物或数据库。
在进一步优选的实施方案中，所述测定所述布卢门醇的量受到选自质谱法、光谱法和基于抗体方法的分析方法影响。
在质谱法领域，特别优选四极杆质谱法、飞行时间质谱法、离子阱质谱法、扇形场质谱法以及其组合。在光谱法领域，优选UV吸收光谱法、拉曼光谱法以及光散射光谱法。优选的基于抗体方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。
特别优选质谱法。我们指出，发明人使用质谱法不仅出于第一方面的方法的目的，而且是为了确立布卢门醇是合适的标志物。
为了完整性，我们指出，在质谱分析过程中，不仅可以检测和定量布卢门醇本身，还可以检测和定量其加合物和/或分解产物。
在一个特别优选的实施方案中，在所述分析方法之前，将取自所述地上部分的样品提取、浓缩和/或纯化。
优选的提取方法是用甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、吡啶、其混合物以及这些溶剂中的一种或多种与水的混合物、优选80％甲醇与20％水的混合物提取。
优选的纯化方法是色谱法如液相色谱(LC)和固相萃取(SPE)。色谱法可以偶联质谱法(MS)、优选在线偶联，例如在线LC/MS。
在第二方面中并且涉及第一方面，本发明提供布卢门醇作为植物与AMF结合的标志物的用途。
在作出必要修正的情况下，第一方面的优选实施方案限定了第二方面的优选实施方案。举例而言，优选的布卢门醇是如上文公开的式(I)和(II)的那些。类似地，优选的地上部分是上文公开的那些。另外，优选的植物和优选的AMF分别地是上文公开的那些。
通常，在作出必要修正的情况下，第一方面的优选实施方案限定了本发明全部其他方面的优选实施方案。
在第三方面，本发明涉及测定植物是否具有AMF接受性、改进的资源获取或改进的胁迫抗性的方法；或对所述接受性、所述改进的获取或所述改进的抗性进行定量的方法；
所述方法包括：
(a)使所述植物与已知能够定殖的AMF接触；并且
(b)将布卢门醇的量和参照比较，以获得所述量和所述参照之间的差异；
其中所述的量是在第二时间点时或之后在所述植物的地上部分中的量，所述第二时间点是在所述接触后其中已经形成或应当已经形成所述结合的最早时间点；和
所述参照是下述植物的地上部分中所述布卢门醇的量：
(i)第一时间点之前的所述植物，所述第一时间点是其中可以形成结合的最早时间点；或
(ii)与AMF没有任何结合的第二植物；
其中与所述参照相比，较高的量指示具有所述接受性、所述改进的获取或所述改进的抗性；并且所述差异是所述接受性和/或所述获取或所述抗性的改进的指标。
第三方面的方法涉及评估给定植物对接触AMF的响应行为。响应行为可以是AMF接受性，即，植物建立结合的能力。建立结合赋予了植物益处，所述益处包括改进的资源获取以及改进的胁迫抗性。资源包括磷。下文详细描述其他的优选资源。
为了第三方面的方法的目的，使用已知能够定殖的AMF。AMF是否能够定殖是事先已知的或可以确定的，例如采用确定AMF是否具有本发明所述定殖能力的方法(下文进一步公开)或如现有技术所做那样，通过使候选AMF与能够建立结合的植物接触并随后分析这类植物的根来确定。
与本发明的第一方面有关，第三方面的方法也可以以定性(在第三方面的情况下称作“确定”)和定量(“定量”)的方式使用。
可以例如通过将植物转移至含有AMF的土壤(例如事先与市售接种物混合)，通过用含有AMF的溶液(例如，孢子溶液)浇水、向土壤添加保育植物(AMF感染的植物)、将分离的孢子置于根上或通过向土壤添加另一种含有AMF的介质(例如含有AMF的琼脂片、含有AMF的根碎片)，进行所述接触。
根据第三方面的方法的步骤(b)的待确定的差异定义如下：量减去参照。
可以理解，术语“量”、“参照”和“数量”均指相同物理性质，所述性质优选地是浓度、质量或物质的量(进一步参见上文)。另外，如果在本领域中确立质量、物质的量和浓度的相对量值作为直接代表(例如所使用的检测系统的信号强度)，则考虑它们。
第三方面的方法引入两个时间点的观念。第一时间点的实例与参照状态相关。优选地，并且这在下文进一步公开，所述第一时间点是在进行步骤(a)的接触之前。但是，并且指出功能性结合的发生需要耗费时间，所述第一时间点也可以是稍后的，即在步骤(a)的所述接触之后，但在其中功能性结合可能已经形成的那个特定时间点之前。对于强的相互作用，检测功能性结合的常见时间跨度在两周和十周之间，优选地在六周和八周之间。八周通常是对最相关的植物与AMF配对而言已经形成结合的时间跨度。
功能性结合的首批迹象可能出现在数天后；例如，Alexander等人((1985)Adevelopmental study of the early stages in vesicular-arbuscular mycorrhizaformation.Canadian Journal of Botany 63 184-194)发现首批丛枝吸胞在接触后第三到第四天之间形成。结合关系的形成可能根据具体所用植物、AMF、接种类型和环境参数(例如温度、施肥、土壤养分含量)而变动。
因此，选择结合已经形成(或应当已经形成)的所述第二时间点。由短语“应当已经形成”表述的备选项指那些情况，其中已经过去足够的时间以便结合形成，但尚未形成，例如因为受检植物无AMF接受性。
优选的布卢门醇是上文进一步定义的那些。
优选的地上部分是上文进一步定义的那些。特别优选叶。
第三方面的方法为参照提供了两种备选。可以使用处于较早时间点的相同植物作为参照，或第二植物，优选地属于相同物种，其不含任何与AMF的结合。
与第一方面的方法相似，参照值可以取自知识库如出版物或数据库。
如上文所示，本发明的方法特别地适合于高通量。
就此而言，在第四方面，本发明提供对植物筛选AMF接受性、改进的资源获取或改进的胁迫抗性的方法；
所述方法包括：
(a)对多株植物应用第三方面的方法；
或
(b)(i)使多株植物中的每一个与已知能够定殖的AMF接触，并且
(ii)测定以下时间点之后在每株植物的地上部分中布卢门醇的量，所述时间点是其中已经形成或应当已经形成所述结合的最早时间点；
其中所述植物属于相同物种；
其中所述布卢门醇的量越高，所述接受性、所述资源获取或所述胁迫抗性越高。
在本申请的植物中，如本文所用的术语“多株”指二、三、四、五、十、二十、一百或更多株。
第四方面的方法的备选项(a)提供第三方面的方法的反复使用。从第三方面的方法描述中显而易见，在每种情况下这都需要参照值。
然而，在那些其中评估属于相同物种的几株植物的情况下，用于每次比较的参照值不是必要的。这是第四方面的方法的备选项(b)的主题。这里评估相同物种的多株植物，可以例如分选所观测的量并且具有最高布卢门醇量的植物是具有最高AMF接受性、最高资源获取和/或最高胁迫抗性的植物。可以理解“更高”和“最高”，在其最广泛含义上是相对术语。然而，它们提供了实际用途，例如对植物和/或AMF进行排序。
另外，定量信息可能用于推进遗传学方法，例如数量性状基因座(QTL)定位法，以发现与植物接受性相关的遗传区域；参见例如图4。
出于本发明的目的，“较高程度的接受性”和“较高程度的结合”的特征在于植物和AMF之间较高的代谢物交换潜力。
在第五方面，本发明提供对植物筛选改进的资源获取或改进的胁迫抗性的方法，所述方法包括对多株植物的地上部分中布卢门醇的量进行比较，其中所述植物属于相同物种，并且其中所述布卢门醇的量越高，所述资源获取或所述胁迫抗性越高。
通常而言，在本申请的植物中，如本文所用的术语“多株”指二、三、四、五、十、二十、一百或更多株。
与第四方面的方法相比，第五方面的方法提供对接触步骤的要求。尽管第五方面的方法不排除接触，但也可以通过使用取自例如文件、出版物或数据库的值实施第五方面的方法。
在第三、第四和第五方面的方法的优选实施方案中，所述方法还包括选择分别具有最高量或(a)预定量的所述布卢门醇的植物，或分别具有最高差异或(a)预定差异的植物。
对于预定差异，注意的是，根据生长条件、植物物种和所涉及的AMF，维持AM的成本可能超过益处。因此，有时较低的接受性可能有利。
第三、第四和第五方面的上述方法与检验一株植物或多株植物有关。与之类似，本发明还提供检验AMF或多种AMF的方法。
因此，在第六方面，本发明提供一种确定AMF是否具有定殖能力、向植物供应资源的能力或向所述植物提供胁迫抗性的能力的方法；或定量所述能力的方法；所述方法包括：
(a)使所述AMF与已知可接受定殖的植物接触；并且
(b)将布卢门醇的量和参照比较，以获得所述量和所述参照之间的差异；
其中所述量是在第二时间点时或之后在所述植物的地上部分中的量，所述第二时间点是在所述接触后其中已经形成或应当已经形成所述结合的最早时间点；和
所述参照是下述植物的地上部分中所述布卢门醇的量：
(i)第一时间点之前的所述植物，所述第一时间点是其中可以形成结合的最早时间点；或
(ii)与AMF没有任何结合的第二植物；
其中与所述参照相比，更高的量指示具有所述能力并且所述差异是所述能力的指标。
第六方面的方法是第三方面的方法的对应副本。在出于检验植物的目的设计第三方面的方法的同时，第六方面的方法用于检验AMF。待检验的性质是定殖能力和尤其是定殖向植物提供益处、向植物供应资源的能力以及向植物提供胁迫抗性的能力。
在第七方面，本发明提供筛选AMF的定殖能力、向植物供应资源的能力或向所述植物提供胁迫抗性的能力的方法，所述方法包括
(a)对多种AMF应用第六方面的方法；
或
(b)(i)使多种AMF的每一个与已知可接受定殖的植物接触；并且
(ii)确定以下时间点之后每株植物的地上部分中布卢门醇的量，所述时间点是其中已经形成或应当已经形成所述结合的最早时间点；
其中所述植物属于相同物种；其中所述布卢门醇的量越高，所述能力越高。
在已作必要的修正情况下，与第四方面的方法有关的解释适用于第七方面的方法。
在第八方面，本发明提供筛选AMF向植物供应资源的能力或向所述植物提供胁迫抗性的能力的方法，所述方法包括对所述植物的个体的地上部分中布卢门醇的量进行比较，所述个体与AMF结合，其中所述布卢门醇的量越高，所述能力越高。
第八方面的方法是第五方面的方法的对应副本。
在第六、第七和第八方面的方法的优选实施方案中，所述方法还包括选择分别产生最高量或(a)预定量的所述布卢门醇的AMF，或分别产生最高差异或(a)预定差异的AMF。
在进一步优选的实施方案中，(a)所述资源选自磷、氮和水；或(b)所述胁迫选自干旱、重金属暴露、病原体感染和草食动物扰害。
在许多情况下，优化植物和AMF之间的结合也是优化植物产率的手段。尤其是在资源例如磷不丰富或稀缺的条件下，植物将显著地从该结合获益，不仅在资源获取和胁迫抗性方面，还在产量方面。换句话说，上文公开的第三、第四、第五、第六、第七和第八方面的方法也可以用来确定植物是否具有(或将具有)改进的产量(第三、第四和第五方面的方法)，以及AMF是否具有改进植物产量的能力(本发明第六、第七和第八方面的方法)。优选地，所述改进的产量发生或预期发生于资源例如磷不丰富或稀缺的条件下。
与此相关，预期植物的菌根化状态影响植物及其部分(包括地上部分)的风味。因此，本发明的方法和用途也可以用来调节或优化植物的风味。
通常而言，育种和农业领域中需要产生包括植物和所结合AMF的结合关系。鉴于植物的地上部分中的布卢门醇水平适合于容易和便利的测定，本发明促进产生这类结合，尤其是较高水平或所需程度的结合。
与上述考虑相符，因此，在第九方面，本发明提供产生植物与AMF结合的方法，所述方法包括：
(a)(i)使所述植物与AMF接触；
(ii)将布卢门醇的量和参照比较，以获得所述量和所述参照之间的差异；
其中所述量是在第二时间点时或之后在所述植物的地上部分中的量，所述第二时间点是在所述接触后其中已经形成或应当已经形成所述结合的最早时间点；和
所述参照是下述植物的地上部分中所述布卢门醇的量：
(1)第一时间点之前的所述植物，所述第一时间点是其中可以形成结合的最早时间点；或
(2)与AMF没有任何结合的第二植物；并且
(iii)如果所述量如与所述参照相比增加或约等于所述布卢门醇的预定量，则获得所述结合；
(b)(i)使所述植物与多种AMF的每一个接触；
(ii)在每种情况下确定以下时间点之后所述植物的地上部分中布卢门醇的量，所述时间点是其中已经形成或应当已经形成所述结合的最早时间点；且
(iii)选择具有最高量或预定量的所述布卢门醇的结合；
或
(c)(i)使多株植物与AMF接触；
(ii)确定以下时间点之后每株植物的地上部分中布卢门醇的量，所述时间点是其中已经形成或应当已经形成所述结合的最早时间点；且
(iii)选择具有最高量或预定量的所述布卢门醇的结合。
项(a)、(b)和(c)各自定义产生结合的独立方法。
在第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九方面的方法的优选实施方案中，(i)所述第一时间点在所述接触之前；(ii)在所述接触之前或在所述第一时间点之前，所述植物没有所述结合；(iii)所述方法包括在所述第一时间点时或之前确定布卢门醇的量；(iv)所述方法包括在所述第二时间点时或之后确定布卢门醇的量；和/或(v)所述比较以计算机实施的方式实现。
只要在技术上有意义，项(i)至(v)中两者或更多者可以组合。
优选的组合是：(i)、(ii)和(iv)，其中优选在所述第一时间点的量取自知识库；和(i)和(iv)，其中优选在所述接触之前或在所述第一时间点之前，所述植物具有结合。还优选项(v)的(附加)用途。
用于接触给定植物的AMF优选以下述形式提供：(i)单一AMF；(ii)AMF的混合物；(iii)根的孢子分离物或菌根化植物的土壤；和/或(iv)未消毒的土壤。在(iv)的情况下，土壤优选先前被具有AMF的植物栖居。所述植物的物种没有特别的限制。
在第十方面，本发明提供通过第九方面的方法获得的植物与AMF的结合。
在第十一方面，本发明提供了设置为定量分析如上文定义的式(I)或式(II)的布卢门醇的质谱仪。所述质谱仪可以配备计算机程序，其通过分析在质谱分析过程中从布卢门醇形成的母体离子、加合物离子和碎片离子而鉴定并定量本发明的布卢门醇。
在第十二方面，本发明提供对式(I)或(II)的布卢门醇特异性的抗体。
在第十三方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含一个、多个或全部以下内容或由其组成：(a)小瓶，其含有适合于从植物的地上部分提取布卢门醇的溶剂，所述溶剂优选地是甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、吡啶、其混合物以及这些溶剂中一种或多种与水的混合物；(b)第十二方面的抗体；(c)与所述抗体连接或与针对第十二方面抗体的第二抗体连接的酶；(d)所述酶的底物；(e)第十一方面的质谱仪；和/或(f)用于进行根据前述权利要求中任一项所述的方法的手册。
优选的试剂盒包含(b)和(c)；(a)、(e)和(f)；或(a)、(b)、(c)、(d)和(f)，或由其组成。
就本说明书中、尤其是权利要求中表征的实施方案而言，从属权利要求中提到的每个实施方案意欲与所述从属权利要求所引用的每项权利要求(独立或从属权利要求)的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1陈述了3个备选项A、B和C，从属权利要求2陈述了3个备选项D、E和F并且权利要求3引用权利要求1和2并陈述3个备选项G、H和I的情况下，除非另外特别地提到，否则应当理解，本说明书毫无疑义地公开了与以下组合相对应的实施方案：A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I。
类似地，并且还在其中独立权利要求和/或从属权利要求未陈述备选项的那些情况下，可以理解，如果从属权利要求重新提及多个前述权利要求，则由其涵盖的主题的任何组合由此认定为予以明确公开。例如，在独立权利要求1的情况下，从属权利要求2引用权利要求1，且从属权利要求3引用权利要求2和1二者，则明确和毫无疑义地公开了权利要求3和1的主题的组合，而权利要求3、2和1的主题的组合也已公开。如存在引用权利要求1至3中任一项的进一步的从属权利要求4，则明确和毫无疑义地公开了权利要求4和1的主题组合、权利要求4、2和1的主题组合、权利要求4、3和1的主题组合以及权利要求4、3、2和1的主题组合。
附图显示：
图1：组合的定向和非定向代谢组学鉴定了布卢门醇衍生物作为渐狭叶烟草植物的根和叶中的指示AMF的植物内指纹。
A实验建立。将EV和irCCaMK植物共培养并且用或不用根内球囊霉接种。接种后六周(wpi)，收获根样品用于代谢物谱分析。B来自UHPLC-qTOF-MS非定向分析(n＝8)的可视化m/z特征的协方差网络。已知的化合物，包括烟碱、苯丙氨酸和各种酚类，和未知物质(Unk.)由划虚线的椭圆形注释。C使用STEM聚类法，对归一化的Z评分的m/z特征聚类；8个显著的聚类中有5个以不同灰度级显示并且定位到协方差网络上。条形图中显示2个选定特征(化合物1和2)的强度变异(平均值+SE)(n.d，未检测)。D具有或没有AMF接种的植物的根和叶中化合物1和2的代表性色谱图，如通过定向的UHPLC三重四级杆-MS代谢组学分析。
图2：化合物1和2是渐狭叶烟草中根AMF定殖的叶标志物。
A在具有AMF(EV+)或没有AMF(EV-)接种的EV植物和具有AMF接种的irCCaMK植物(irCCaMK+)的叶中的化合物1和2随时间的积累(平均值±SE，n≥6)。B用不同接种物浓度接种的植物的化合物1和2的叶丰度(5wpi)(平均值+SE，n＝8)；不同字母表示显著差异(p<0.05，单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后Fisher氏LSD检验)。C有(+)或无(-)分离自植物天然栖息地的AMF接种物接种的EV植物和irCCaMK植物的叶样品中的化合物1和2(6wpi)；不同字母表示显著差异(p<0.05，单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后Tukey氏HSD检验，n＝10)。D田间实验(大盆地沙漠，犹他州，USA)：种植后8周采样的EV(n＝20)植物和irCCaMK(n＝19)植物的叶样品中的化合物1和2。(Student t检验：***，p<0.001)。E在B中所示植物的WGA-488染色的根的代表性图像(短线段＝100μm)。F通过相同植物的菌丝、丛枝吸胞、囊泡和总根长度定殖确定的相对于根定殖百分比的叶化合物1和2(线性回归模型)。G在6wpi收获的有(+AMF，n＝3，左侧对齐的标度)或无(-AMF，n＝1，右侧对齐的标度)AMF接种的植物的17种不同组织中的化合物1和2。
图3：枝条中指示AMF的化合物1和2的积累源自根。
A来自甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)和(脱辅基)类胡萝卜素生物合成基因的RNA-seq的转录物丰度的层次聚类分析。B AMF接种的i-irPDS植物和EV植物中的化合物1、2和6(非AMF特异性)。在每株植物上，将单个茎部叶(stem leaf)(叶0)用100μM含DEX的糊剂激发3周；收获处理的和毗邻的未处理对照叶(叶-1和叶+1)。显示代表性叶(白化表示PDS沉默)；(平均值+SE，n＝9)。通过Student t检验比较i-irPDS植物和EV植物中的相同叶位置。C幼苗的根和枝条中化合物1、2和6的含量，所述幼苗的根蘸入具有或没有指示AMF的布卢门醇的水溶液中1天。D有(右小图)和无(左小图)AMF定殖的植物中布卢门醇分布的模型。该模型显示组成型布卢门醇类(例如，渐狭叶烟草中的化合物6)和指示AMF的那些布卢门醇类(例如，渐狭叶烟草中的化合物1和2)及其推断的转运。
图4：植物地上部分中指示AMF的布卢门醇类变化是在高通量筛选多种植物和AMF种类中提供对功能性AMF结合准确评估的有价值的研究工具。
A两个渐狭叶烟草材料(UT/AZ)之间的根定殖分析。H：菌丝；A：丛枝吸胞；V：囊泡；T：总定殖(n＝8；Student t检验，*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001)。B台盼蓝染色的根的代表性图像(6wpi；短线段＝100μm)。C有和无AMF接种的UT植物和AZ植物的根和叶中的化合物2(平均值+SE，n＝8)。D在7,200m2田间小区上来自UT-AZ RIL群体(728株植物)的植物的叶化合物2的归一化的丰度的热图。E来自D的数据的QTL定位分析。除其他基因之外，连锁群3上的QTL基因座含有AMF相关基因NaNOPE1。LOD，比值比的对数。F有和无AMF接种的不同作物植物的布卢门醇含量。使用如所指示的不同植物和AMF物种(平均值+SE；n.d，未检测)。
图5：植物地上部分中指示AMF的布卢门醇类变化是对多种植物和AMF种类的功能性AMF结合提供准确评估的有价值的研究工具(续自图4F)。
有和无AMF接种的不同作物植物的布卢门醇含量。使用如所指示的不同植物和AMF物种；平均值+SE，n.d，未检测。
图6：没有(假的)或具有用粗制物或纯培养(平板)根内球囊霉接种物接种的野生型Nipponbare(NB)和ccamk-2突变体植物中11-羟基布卢门醇C葡糖苷(化合物1)信号的比较。
图7：没有(假的)或具有用粗制物或纯培养(平板)根内球囊霉接种物接种的野生型Nipponbare(NB)和ccamk-2突变体植物中11-羧基布卢门醇C葡糖苷(化合物2)信号的比较。
图8：化合物1和2是稻中的根AMF定殖的叶标志物。
在没有(假的)或具有用粗制物或纯培养(平板)根内球囊霉接种物接种的稻野生型Nipponbare(NB)、ccamk-1和ccamk-2突变体植物中定量AMF标志物化合物的叶丰度。
实施例举例说明本发明：
实施例1
材料和方法
植物生长和AMF接种
对于我们采用渐狭叶烟草(Torr.ex S.Wats.)的实验，我们使用来自近交‘UT’系第31近交代植物irCCaMK(A-09-1212-1；Groten等人(2015)Silencing a key gene of thecommon symbiosis pathway in Nicotiana attenuata specifically impairsarbuscular mycorrhizal infection without influencing the root-associatedmicrobiome or plant growth.Plant,Cell&Environment 38,2398-2416)的植物(其借助RNAi在CCaMK中稳定沉默)、携带LhGR/pOp6系统用于化学诱导型RNAi介导的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因沉默的i-irPDS植物(A-11-92-4x A-11-325-4；等人(2013)“Real time”genetic manipulation:A new tool for ecological field studies.ThePlant Journal 76,506-518)，和相应的空载体(EV)转化的植物(A-04-266-3；Bubner等人(2006)Occurrence of tetraploidy in Nicotiana attenuata plants afterAgrobacterium-mediated transformation is genotype specific but independent ofpolysomaty of explant tissue.Plant Cell Reports 25,668-675)作为对照。转化和筛选irCCaMK植物的详情由Groten等人((2015)Silencing a key gene of the commonsymbiosis pathway in Nicotiana attenuata specifically impairs arbuscularmycorrhizal infection without influencing the root-associated microbiome orplant growth.Plant,Cell&Environment 38,2398-2416)描述，并且关于i-irPDS植物的详情由/>等人((2013)“Real time”genetic manipulation:A new tool forecological field studies.The Plant Journal 76,506-518)描述。在Gamborg B5上萌发种子，如Krügel等人所描述((2002)Agrobacterium-mediated transformation ofNicotiana attenuata,a model ecological expression system.Chemoecology 12,177-183)。通过使源自美国亚利桑那州(AZ)和犹他州(UT)收集的材料的两个渐狭叶烟草近交系杂交，形成所用的高代互交重组近交系(RIL)群体(Glawe等人(2003)Ecological costsand benefits correlated with trypsin protease inhibitor production inNicotiana attenuata.Ecology 84,79-90；Zhou等人(2017)Tissue-specific emissionof(E)-alpha-bergamotene helps resolve the dilemma when pollinators are alsoherbivores.Current Biology 27,1336-1341)。另外，我们使用番茄‘Moneymaker’、大麦‘Elbany’和普通小麦‘Chinese Spring’植物。
对于温室实验，根据Groten等人((2015)Silencing a key gene of the commonsymbiosis pathway in Nicotiana attenuata specifically impairs arbuscularmycorrhizal infection without influencing the root-associated microbiome orplant growth.Plant,Cell&Environment 38,2398-2416)处理植物。简言之，将它们转移到用膨胀粘土(尺寸：2–4mm)1:10稀释的死接种物(在121℃持续30分钟高压灭菌两次；无接种的对照)或活接种物(根内球囊霉，Biomyc Vital,www.biomyc.de，接种的植物)。花钵覆盖一薄层细砂。对植物用蒸馏水浇水7天并且随后每两日以全浓度的水培溶液(对于1L：0.1292g CaSO4×2H2O、0.1232g MgSO4×7H2O、0.0479g K2HPO4、0.0306g KH2PO4、2mL KNO3(1M)、0.5mL微量营养素，0.5mL Fe二乙三胺五乙酸)或以仅含有1/10常规P浓度(0.05mM)的低P的水培溶液施肥。如果未另外陈述，将植物分别在1L花钵中培育。在配对设计中(图1)，将irCCaMK植物与EV植物一起在2L花钵中培育，并且浇水方案在植物开始伸长后变成1/4常规P浓度。在中间围隔系统(4个箱，每箱2对EV植物和irCCaMK植物)中实施采用天然接种物的温室实验(图2C)。在标准温室条件下(16小时光照，24-28℃，和8小时黑暗，20-24℃和45-55％湿度)维持植物，补充光由高压钠灯(Son-T-Agro)提供。
根据Schuman等人所描述((2012)Herbivory-induced volatiles function asdefenses increasing fitness of the native plant Nicotiana attenuata innature.Elife1,e00007)实施田间试验。将幼苗转移入Jiffy钵并植入大盆地沙漠中的Lytle Ranch Preserve处的田间小区(美国犹他州：N 37.1412,W 114.0275)。田间季节2016(图2D)：田间试验依据美国农业部动植物卫生检验局(APHIS)输入许可编号10-004-105m(irCCaMK)和07-341-101n(EV)和APHIS放行许可编号16-013-102r实施。将EV植物和irCCaMK植物栽种于基因型相同的或数目相等的两个基因型的六株植物的小区。
在其他实验室设施制备样品：
蒺藜苜蓿样品(图4和5)和二穗短柄草样品(图4和5)在Boyce Thompson植物研究所(Ithaca，NY，USA)的Maria Harrison教授的实验室制备。
番茄‘Moneymaker’样品(图5)和马铃薯样品(图4)在Philipp Franken教授的实验室由来自Leibniz蔬菜和观赏作物研究所(IGZ，Groβbeeren/Erfurt，德国)的MichaelBitterlich博士制备。
诱导的PDS沉默
为了时间和空间上限制PDS基因沉默，我们用含100μM地塞米松的羊毛脂糊剂(1％v/v DMSO)处理接种AMF和未接种AMF的i-irPDS植物和EV植物的第二最老的茎叶的叶柄。根据等人.((2013)“Real time”genetic manipulation:A new tool forecological field studies.The Plant Journal 76,506-518)描述，制备并施用羊毛脂糊剂。处理在盆栽后3周启动并实施3周。羊毛脂糊剂每周更换两次。在每株植物上收获已处理的叶和毗邻的未处理的叶供分析。
样品采集
在收获期间，洗涤根并用纸巾短暂干燥。随后，将它们切成1cm小片并混合。将植物组织在采集后立即于液氮中快速冷冻，研磨成细粉末并储存在-20℃(短期储存)或-80℃(长期储存)直至提取为止。从根样品中，将等分试样在4℃储存于根保存液(在水中25％乙醇和15％乙酸)供显微分析。来自IGZ的番茄样品和马铃薯样品作为干物质提供。
为了采集茎部汁液，将渐狭叶烟草植物的枝切成1.5cm长的小片并置于端头带小孔的0.5mL小反应管，将其置于1.5mL的较大反应管中。将管在10,000x g离心15分钟。采集来自较大反应管的茎部汁液并储存在-20℃。
胁迫处理
通过在植物上放置源于自有种群的新生烟草天蛾(Manduca sexta)，实施食草处理。在饲喂2周后收获莲座丛叶。作为对照，我们从未处理的植物收获叶。
对于细菌和病毒感染，植物是用携带烟草脆裂病毒的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接种的植物。通过使用注射器以细菌溶液浸润叶子来实施接种。按照对病毒诱导的基因沉默所述那样实施处理，所述基因沉默由Ratcliff等人((2001)Technical Advance.Tobacco rattle virus as a vector for analysis ofgene function by silencing.The Plant Journal 25,237-45)以及Saedler和Baldwin((2004)Virus-induced gene silencing of jasmonate-induced direct defences,nicotine and trypsin proteinase-inhibitors in Nicotiana attenuata.Journal ofExperimental Botany 55,151-157)描述。在培育后3周，收获已处理植物和未处理的对照植物的茎部叶。
用灰葡萄孢(Botrytis cinerea)进行真菌感染。在每株植物上，通过施加6滴各自含有10μL灰葡萄孢孢子悬液(106个孢子/mL，在马铃薯提取物葡萄糖培养液中，Carl RothGmbH)的液滴至叶表面来处理三片叶。以相同方式用无孢子的培养液处理对照植物。4天培育后采集样品。
通过停止浇水4天诱导干旱胁迫。随后，收获干旱胁迫的植物和连续浇水的对照植物的茎部叶。与胁迫实验的其他样品不同，将叶在分析之前干燥以补偿含水量变化引起的重量差异。
样品制备-提取和纯化
为了提取，将样品等分入含有两粒钢球的反应管。记录重量以用于稍后的归一化。每100mg植物组织，向样品添加大约1mL 80％MeOH，之后在GenoGrinder 2000(SPEXSamplePrep)中以1150次冲击min-1振摇60秒。在离心后，收集并分析上清液。对于三重四极杆MS定量，向提取缓冲液加入10ng稳定同位素标记的脱落酸(D6-ABA，HPC StandardsGmbH)作为内标。
将茎部汁液以1:1用以D6-ABA作为内标物的MeOH稀释。在离心后，收集并分析上清液。
使用Chromabond HR-XC 45μm苯磺酸阳离子交换柱(Machery-Nagel)去除大量组分如烟碱和酚酰胺类，通过固相萃取法(SPE)纯化渐狭叶烟草的叶提取物用于高分辨MS。在纯化后，将样品蒸发至干燥并复溶于80％甲醇中。
通过NMR用根提取物和叶提取物的纯化组分实施化合物鉴定。从渐狭叶烟草的根组织提取化合物1、3和4并通过HPLC纯化(Agilent-HPLC 1100系列；Grom-Sil 120ODS-4HE，C18，250×8mm，5μm；配备Gilson 206Abimed流分收集器)。从来自不同植物物种(蒺藜苜蓿、玉蜀黍、番茄和渐狭叶烟草)的叶组织的混合物提取化合物2和7。使用Chromabond HR-XC45μm苯磺酸阳离子交换柱(Machery-Nagel)，通过SPE实施第一纯化步骤，以去除亲水性和阳离子组分。通过HPLC(Agilent-HPLC 1100系列；Phenomenex Luna C18(2)，250x 10mm，5μm；配备Foxy Jr.样品收集器)和UHPLC(Dionex UltiMate 3000；Thermo Acclaim RSLC120C18，150×2.1mm，2.2μm；使用自动进样器用于收集流分)实施额外的纯化步骤。
基于非定向MS的分析
对于高分辨质谱法(MS)、非鉴别串联质谱法(idMS/MS)、串联MS(MS2)和伪MS3，我们开发了一种使用溶剂A(含0.1％乙腈和0.05％甲酸的水(Milli-Q，Merck，http://www.emdmillipore.com))和溶剂B(含0.05％甲酸的乙腈)的混合物的色谱方法。使用与Thermo Acclaim RSLC 120C18，150×2.1mm，2.2μmμm柱组合的Dionex UltiMate 3000快速分离LC系统(Thermo Fisher，http://www.thermofisher.com)进行超高效液相色谱法(UHPLC)。溶剂组成以线性梯度从高A％变成高B％，随后是柱平衡步骤以及返回初始条件。流速设定为0.3mL/分钟。使用配备阳离子模式下运行的电喷雾电离(ESI)源的micrOTOF-QII MS系统(Bruker Daltonics，http://www.bruker.com)进行MS检测。micrOTOF-Q II系统的ESI条件是端板偏移电压500V，毛细管电压4500V，毛细管出口电压130V，干燥温度180℃和干燥气体流量10L min-1。使用甲酸钠(500mL水中的250mL异丙醇、1mL甲酸、5mL 1M NaOH)进行质量校准。使用Bruker高精度校正算法校准数据文件。使用HyStar 3.1(BrukerDaltonics)进行仪器对照、数据采集和再处理。
实施idMS/MS旨在得到关于总体的可检测代谢谱的结构信息。为此目的，首先使用单一MS模式(产生由源内碎裂所致的低碎片)，从m/z 50至1400以5000次扫描/秒的速率扫描，通过UHPLC-ESI/qTOF-MS分析样品。使用氮气作为碰撞气体并涉及在以下4个不同的碰撞诱导解离(CID)电压：20、30、40和50eV下独立测量，实施MS/MS分析。从m/z 50至1400在测量期间自始至终采用最大质量分离窗口运行四极杆。在m/z 50至1400之间以5000次扫描/秒的速率扫描质量碎片。为了idMS/MS装配，我们使用了以前设计的前体与产物分配线(Li等人(2015)Navigating natural variation in herbivory-induced secondarymetabolism in coyote tobacco populations using MS/MS structuralanalysis.Proceedings of the National Academy of Sciences 112,E4147-E4155；Li等人(2016)Illuminating a plant’s tissue-specific metabolic diversity usingcomputational metabolomics and information theory.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 113,E7610-E7618)，使用输出结果用于R软件包XCMS和CAMERA处理。
在多种CID电压下对分子离子进行额外的MS/MS实验。为了通过伪MS3断裂所建议的苷元，我们施加60eV的源内-CID转移能，其产生反映全部糖部分均丢失的谱图。
通过NMR阐明结构
将纯化的组分完全干燥并复溶于MeOH-d3中之后，在Avance AV700 MD NMR光谱仪(Bruker-Biospin，卡尔斯鲁厄，德国)上在298K使用1.7mm TCI CryoProbeTM通过核磁共振光谱法(NMR)分析。化学位移值(δ)相对于分别在δH3.31和δC 49.05的残余溶剂峰给出。从1H-13C HSQC和HMBC谱间接地确定碳位移。
定向的代谢物分析
为了色谱分离，使用UHPLC(Dionex UltiMate 3000)以短运行时间提供最大分离。这减少其他提取物组分的扰动(基质效应)，增加方法的特异性并且符合HTP分析的要求。将自动进样器冷却至10℃。作为固定相，我们使用适于分离中等极性化合物的反相柱(Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18，50x 3.0mm，1.8μm)。柱温设定至42℃。作为流动相，我们使用：A，在H2O中的0.05％HCOOH、0.1％ACN，和B，MeOH，其组成针对短运行时间范围内有效分离布卢门醇型化合物而优化。我们在该方法中纳入在100％B的净化区段以及允许结果在大样品集中可重复的平衡区段。梯度程序如下：0–1分钟，10％B；1–1.2分钟，10-35％B；1.2–5分钟，35-50％B；5–5.5分钟，50-100％B；5.5–6.5分钟，100％B；6.5–6.6分钟，100-10％B和6.6–7.6分钟，10％B。流速设定至500μL min-1。在配备HESI(加热电喷雾电离)离子源的Bruker Elite EvoQ三重四极杆MS上进行分析。源参数如下：喷雾电压(+)，4500V；喷雾电压(-)，4500V；锥孔温度，350℃；锥孔气体流量，35；加热探头温度，300℃；探头气体流量，55；和雾化器气体流量，60。样品以多重反应监测(MRM)模式分析(表4)。
表4：用于定向的布卢门醇分析的MRM设置
RT：保留时间
CE：碰撞能量
Glc：葡萄糖
GlcU：葡糖醛酸
Rha：鼠李糖
Hex：己糖
Pen：戊糖
a分辨率：0.7
b[M+H]+或[M-H]-，如果没有不同地陈述
c分辨率：2
d定量符以粗体描述
e[M+H-Glc]+
f通过高分辨MS核实
g通过NMR核实
h用市售标准品优化i基于结构相似的化合物和文献信息预测跃迁
渐狭叶烟草中针对布卢门醇的分析的调整方法
已经分析了渐狭叶烟草中指示AMF的标志物，即化合物1和2，和内标物(D6-ABA)。因此，梯度程序调整如下：0–1分钟，10％B；1–1.2分钟，10-35％B；1.2–3分钟，35-42％B；3–3.4分钟，42-100％B；3.4–4.4分钟，100％B；4.4–4.5分钟，100-10％B和4.5–5.5分钟，10％B。表5中显示了MRM设置。
表5：分析渐狭叶烟草中选定的布卢门醇的MRM设置
RT：保留时间
CE：碰撞能量
Glc：葡萄糖
Hex：己糖
Pen：戊糖
a分辨率：0.7
b[M+H]+或[M-H]-，如果没有不同地陈述
c分辨率：2
d定量符以粗体描述
e[M+H-Glc]+
f通过高分辨MS核实
g通过NMR核实
h用市售标准品优化
AMF定殖率测定
为了确定真菌定殖率和菌根结构，将根样品染色并通过显微术分析。对于WGA-Alex Fluor 488染色，将根首先用蒸馏水洗涤并且随后浸泡于50％(v/v)乙醇中过夜。随后将根在10％(w/v)KOH溶液中煮沸10分钟。用水淋洗后，将根在0.1M HCl溶液中煮沸5分钟。用水淋洗并随后以1x磷酸盐缓冲盐水溶液淋洗后，将根在含有0.2mg mL-1WGA-Alex Fluor488的1x磷酸盐缓冲盐水缓冲液中于黑暗下染色过夜。蔡司共聚焦显微术(LSM 510META)用来检测WGA-Alex Fluor 488(在约495/519nm最大激发/发射)信号。如Brundrett等人((1984)A new method for observing the morphology of vesicular–arbuscularmycorrhizae.Canadian Journal of Botany 62,2128-2134)所述那样进行台盼蓝染色，以可视化菌根结构。为了计数菌根化，将15个各自约1cm长的根片段用台盼蓝或WGA-488染色，随后封片。用20x物镜放大率，观察每张切片超过150个视域并且将这些视域划分成5个组：无定殖、仅有菌丝(H)、菌丝兼有丛枝吸胞(H+A)、菌丝兼有囊泡(V+H)以及菌丝兼有丛枝吸胞和囊泡(A+V+H)。依据每个组的数目除以总视域，计算每个组的比例。
为了定殖率的分子生物学分析，根据生产商的说明，使用RNeasy植物微量制备试剂盒(Qiagen)或RNA Plant(Macherey-Nagel)从根提取RNA，并使用PrimeScript RT-qPCR试剂盒(TaKaRa)通过逆转录合成cDNA。使用含有SYBR Green的反应混合物(Eurogentec,http://www.eurogentec.com/；SYBR Green I No ROX的qPCR核心试剂盒)，在Stratagene Mx3005P qPCR仪上进行定量(q)PCR。我们分析了根内球囊霉特异性持家基因Ri-tub(GenBank：EXX64097.1)，以及AMF诱导的植物标志物基因RAM1、Vapyrin，STR1和PT4的转录物。相对于NaIF-5a(NCBI参考序列：XP_019246749.1)归一化信号丰度。
脱辅基类胡萝卜素途径的转录物分析
基于RNA-seq，通过使用接种或不接种根内球囊霉的渐狭叶烟草的根实施甲基赤藓醇4-磷酸(MEP)和(脱辅基)类胡萝卜素途径的转录物分析。数据分析方法基于Ling等人((2015)Insect herbivory elicits genome-wide alternative splicing responses inNicotiana attenuata.The Plant Journal 84,228-243)先前公开的管线。转录物丰度的代表值是TPM(每百万个映射读数每千碱基外显子模型的转录物)。
布卢门醇转移实验
为了分析布卢门醇的根至枝条转移潜力，我们将三株事先在含GB5琼脂的皮式培养皿上萌发大约10天的渐狭叶烟草幼苗置入0.5mL反应管。将根置于管中，同时枝条从管中伸出。将管小心地用石蜡膜覆盖，其将幼苗固定就位并将根与枝条分离(参见图3C)。用补充了0.5％v/v富含化合物1或2(浓度未知；纯化组分)或市售标准化合物6(25ngμL-1终浓度；Roseoside；Wuhan ChemFaces Biochemical Co.,Ltd.)的植物提取物的自来水填充管。通过甲醇提取，随后通过SPE(Chromabond HR-XC柱)和HPLC(Agilent-HPLC 1100系列；Phenomenex Luna C18(2)，250x 10mm，5μm；配备Foxy Jr.组分收集器)纯化，从来自不同植物物种(蒺藜苜蓿、玉蜀黍、番茄和渐狭叶烟草)的叶组织的混合物制备化合物1或2。作为对照，我们使用补充相应量MeOH的自来水。在Percival气候室中培育幼苗1天(在28℃光照16小时，和在26℃黑暗8小时)。在样品采集期间，将根和枝条分离并且在水中淋洗根(以减少培育介质的表面沾染)。尽管分别地分析枝条，但汇总来自相同处理的全部幼苗的根。如上文所述进行样品提取。
QTL分析
为了数量性状基因座(QTL)定位，我们使用Zhou等人((2017)Tissue-specificemission of(E)-alpha-bergamotene helps resolve the dilemma when pollinatorsare also herbivores.Current Biology 27,1336-1341)描述的AZ-UT RIL群体。2017年实施田间试验。如所述那样用D6-ABA作为内标掺入的80％MeOH提取采集的叶样品，并且采用‘渐狭叶烟草中针对布卢门醇的分析的调整方法’下所述的方法分析。化合物2的峰面积依据已提取组织的量、内标物和对数变换进行归一化。除去遗失基因型或表型信息的样品。总计728份样品用于QTL定位分析。根据Zhou等人((2017)Tissue-specific emission of(E)-alpha-bergamotene helps resolve the dilemma when pollinators are alsoherbivores.Current Biology27,1336-1341)实施QTL分析。
统计结果
用R版本3.0.3(http://www.R-project.org/)进行数据的统计分析。图注中显示所用的统计方法和重复数。
实施例2
结果
我们在钙依赖性和钙调蛋白依赖性蛋白激酶(irCCaMK)沉默的渐狭叶烟草转基因系和与或不与根内球囊霉共培养的空载体(EV)植物中进行根组织的非定向代谢组学分析(图1A)。通过使用不能建立功能性AMF结合的irCCaMK植物(Groten等人(2015)Silencing akey gene of the common symbiosis pathway in Nicotiana attenuata specificallyimpairs arbuscular mycorrhizal infection without influencing the root-associated microbiome or plant growth.Plant,Cell&Environment 38,2398-2416)，我们能够从那些由更普遍的植物-真菌相互作用导致的变化中剖析AMF结合特异性的代谢反应。使用液相色谱(LC)偶联飞行时间质谱法(qTOF-MS)对根的非定向代谢组学谱分析，产生由943个质量特征(在某些保留时间检测出的m/z信号)组成的衔接数据矩阵。实施共表达网络分析，其中节点代表m/z特征并且边线连接从相似的源内碎裂起源衍生的并具有生物化学关系的代谢物质量特征(Li等人(2015)Navigating natural variation in herbivory-induced secondary metabolism in coyote tobacco populations using MS/MSstructural analysis.Proceedings of the National Academy of Sciences 112,E4147-E4155；Li等人(2016)Illuminating a plant’s tissue-specific metabolicdiversity using computational metabolomics and information theory.Proceedingsof the National Academy of Sciences 113,E7610-E7618)。例如，公知的化合物如烟碱和苯丙氨酸的特征被紧密地连接(图1B)。执行STEM聚类线以识别基因型x处理数据矩阵[分别是(EV/irCCaMK)x(-/+AMF接种)]中的代谢积累的模式。结果，8个计算机处理的不同表达模式中有5个映射到图1B中的协方差网络(以不同灰度级显示)上。一个紧密聚集的未知代谢物聚类(图1B，左上)占据一个不同的代谢空间。这个聚类中聚集的代谢物在EV中菌根化时被高度激发，但在irCCaMK植物中未激发(图1C)。还值得注意的是，这组化合物似乎是从头合成的，因为在未接种的植物中无一检出(图1C)。这个聚类的化合物的结构基于串联-MS和NMR数据解析。五种代谢物解析为布卢门醇类：11-羟基布卢门醇-C-9-O-Glc(图1C；化合物1)、11-羧基布卢门醇-C-9-O-Glc(图1C；化合物2)、11-羟基布卢门醇-C-9-O-Glc-Glc(化合物3)、布卢门醇-C-9-O-Glc-Glc(化合物4)和布卢门醇-C-9-O-Glc(化合物5)。
为了在整株植物中追踪这些化合物，我们使用基于LC三重四极杆-MS的更灵敏和特异性定向的代谢组学方法。五种布卢门醇-C-糖苷的丰度随着菌根发育连续地增加，并且与根据经典标志物基因(真菌持家基因Ri-tubuline；植物内标志物基因Vapyri、RAM1、STR1和PT4；Park等人(2015)Hyphal branching during arbuscule development requiresReduced Arbuscular Mycorrhiza1.Plant Physiology 169,2774-2788)的转录物丰度所确定的菌根化率高度相关。
化合物1和2在叶中显示与根中观察到的相似的AMF特异性积累(图1D)。其他分析的布卢门醇类未在叶中检出(化合物3和4)或显示不太一致的AMF特异性积累(化合物5；归因于其组成型背景水平)。在需要额外的样品纯化和浓缩步骤的方法中通过高分辨qTOF-MS验证叶中化合物1和2的身份，原因在于其在叶中的低丰度和高基质效应，这可能是为何先前非定向的代谢组学尝试遭遇失败而未检出这些特征标识的原因。
接下来，我们确定指示AMF的叶化合物1和2的含量和根定殖率之间的相关性。在动力学实验中，两种化合物在接种根内球囊霉的植物的叶中增加其积累(图2A)。相反，通常在根中分析的经典AMF标志物基因在叶中无响应。在使用渐增的接种物浓度的接种物梯度实验中，观察到按比例较高的化合物1和2水平(图2B)，这准确反映在各处理间根的差异性定殖(图2E)。除了单一AMF物种(根内球囊霉)接种之外，我们还测试了最初从植物的天然栖息地(美国犹他州大盆地沙漠)采集的菌根接种物，其主要由摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)和根内球囊霉组成。用这种‘天然接种物’接种的EV植物也在叶中积累化合物1和2，而irCCaMK植物则不积累(图2C)。当种植在犹他州的植物天然环境时，EV植物和irCCaMK植物均可以明确地通过其叶化合物1和2的含量区分。来自化合物2的特征标识在这些田野长成的植物中提供了更好质量标志物(图2D)。这两种化合物的叶含量与根中丛枝吸胞(AMF相互作用的核心结构)的百分数高度相关(图2F)。相反，其他生物性或非生物胁迫，包括食草、病原体感染和干旱胁迫，没有诱导化合物1和2的叶积累，如已经描述的根的情况(Maier等人(1997)Accumulation of sesquiterpenoid cyclohexenone derivatives inducedby an arbuscular mycorrhizal fungus in members of the Poaceae.Planta202,36-42)。对多种植物组织(包括不同叶位置、茎片、花和蒴果)的分析揭示，这些AMF特异性标识在整个枝条中积累(图2G)。综上，我们得出结论，植物地上部分中特定布卢门醇类的含量可稳定反映渐狭叶烟草植物中菌根化的程度。
布卢门醇类是源自类胡萝卜素途径侧支的脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)(Hou等人,(2016)Synthesis and function of apocarotenoid signals inplants.Trends in Plant Science 21,792-803)。可能与布卢门醇生物合成相关的大部分基因在根中上调，但在响应于菌根化的渐狭叶烟草植物的叶中不上调(图3A)。我们推定，指示AMF的叶脱辅基类胡萝卜素从其已定殖根中的合成部位转运至其他植物部分。这与布卢门醇出现于通过离心小茎片所采集的茎部汁液中一致。为了澄清这些指示AMF的叶布卢门醇的来源(局部生物合成还是转运)，我们以遗传方式操作渐狭叶烟草植物的类胡萝卜素生物合成。为了最小化受干扰的类胡萝卜素生物合成对AMF-植物相互作用的影响，我们使用地塞米松(DEX)诱导型pOp6/LhGR系统来沉默在单一DEX处理的叶位置中的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的表达(等人(2013)“Real time”genetic manipulation:A newtool for ecological field studies.The Plant Journal 76,506-518)。处理的叶显示了指示PDS沉默的明确的白化特征(图3B)，但指示AMF的化合物1和2的水平不受影响，这与它们从其他组织(可能是高度积累的根)转运相符。作为对照，我们分析了非AMF诱导型的化合物6，在地上组织中显示组成型水平。在DEX处理的叶中，化合物6浓度降低几乎40％，这与其局部产生相符(图3B)。为了证实布卢门醇的植物内运输潜力，我们将幼苗的根浸入化合物1或2的水溶液。在温育过夜后，布卢门醇衍生物不仅在根中、还在枝条中明确地检出(图3C)。我们提出，指示AMF的布卢门醇类(例如化合物1和2)在定殖的根中产生并运输至枝条，而其他的AMF非依赖性的布卢门醇类(例如化合物6)源自局部产生及枝条内运输(图3D)。
为了检验这些叶代谢物作为筛选工具的潜力，我们在正向遗传学实验(用经典的根染色或核酸分析筛选工具进行挑战的实验)中对其定量。我们将分析重点放在化合物2上，原因在于野外长成的植物的叶中其特征标识的质量很好。该实验由两个渐狭叶烟草材料的重组近交系群体组成(犹他州，UT和亚利桑那，AZ)(Zhou等人(2017)Tissue-specificemission of(E)-alpha-bergamotene helps resolve the dilemma when pollinatorsare also herbivores.Current Biology 27,1336-1341)，所述材料差异在于温室中的菌根化(图4A-B)和叶化合物2积累(图4C)。对涵盖7200m2田间小区(图4D)培育的728株植物的QTL分析揭示了映射于连锁群3上单基因座的化合物2的丰度(图4E)，所述单基因座具有先前显示为玉蜀黍和稻中启动AMF共生所需的NOPE1的同源物(Nadal等人(2017)An N-acetylglucosamine transporter required for arbuscular mycorrhizal symbiosesin rice and maize.Nature plants 3,17073-17073)。尽管明确地需要额外的追踪工作，但这些结果凸显了这些特征标识代谢物对HTP筛选的价值，所述筛选构成大部分作物改进计划的基础。
布卢门醇C衍生物在根中的AMF特异性积累是高等植物内部的普遍现象(Strack和Fester(2006)Isoprenoid metabolism and plastid reorganization in arbuscularmycorrhizal roots.New Phytologist 172,22-34)；然而，地上部分中观察到的布卢门醇变化在植物和AMF物种的不同组合间有多普遍？我们分析了有和无AMF接种的番茄植物、普通小麦植物和大麦植物，并且再次发现根和叶中AMF特异性布卢门醇响应重叠，这与所述转运假设相符。其他分析导致在蒺藜苜蓿、马铃薯和二穗短柄草的叶中鉴定到另外的指示AMF的布卢门醇。我们鉴定了在枝条中显示AMF特异性积累的多种类型布卢门醇，包括布卢门醇-B(化合物7)，这些布卢门醇先前尚未在AMF依赖性背景下报道(图4F)。如对根所报道，特定布卢门醇类型是物种依赖性的，但通用模式在不同研究机构实施的实验中在单子叶植物和双子叶植物中是普遍的。在采用不同真菌物种(根内球囊霉、摩西管柄囊霉和地表球囊霉)的试验中，发现观测的效果不限于特定AMF分类单位(图4F和图5)。简而言之，本方法是稳定的。
实施例3
稻(Oryza sativa)植物的AMF标志物分析的优化
已经在(i)稻野生型Nipponbare(NB)和(ii)两个不能形成功能性AMF结合的钙依赖性蛋白激酶和钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CCaMK)缺陷型突变体基因型(ccamk-1和ccamk-2)中分析了布卢门醇标志物。
从以下三种不同AMF接种处理法处理的植物的两个叶位置即叶4(L4)和叶5(L5)收获样品：无AMF(假的)、具有从定殖的万寿菊(Tagetes)根(粗制物)制备的根内球囊霉接种物、或来自无菌胡萝卜根上纯培养物(平板)的根内球囊霉接种物。研磨冷冻的组织样品(100mg)并用含有10ng D6-ABA作为内标物的0.8mL提取缓冲液(80％甲醇)提取。
在初始筛选布卢门醇相关化合物后，我们鉴定到指示稻植物被根内球囊霉定殖的合适标志物(图6和图7)。
如Wang等人2018中所述，在三重四极杆UPLC-MSMS上，使用化合物特异性的多重反应监测(MRM，表A)，对所鉴定的AMF标志物化合物进行定量。
表A.用于稻叶中特定布卢门醇衍生物定量的MRM设置。
RT：保留时间[分钟]；CE：碰撞能；IS：内标物
类似于其他的植物-AMF系统(即渐狭叶烟草)，11-羧基-和11-羟基布卢门醇C葡糖苷的丰度可指示AMF定殖。另外，羧基布卢门醇葡糖苷的丙二酰化衍生物显示在野生型NB稻植物中相似的AMF诱导的积累模式，其在两个ccamk突变体中被消除(图8)。

Claims (9)

1.测定第一植物与丛枝菌根真菌(AMF)结合的方法，所述方法包括将所述第一植物的地上部分中布卢门醇的量与第二植物的地上部分中所述布卢门醇的量进行比较，其中所述第二植物属于与所述第一植物相同的物种，并且其中与所述第二植物相比，增加的量指示所述第一植物中结合增加，并且减少的量指示结合减少，其中，所述第一植物和第二植物选自渐狭叶烟草、番茄、普通小麦、大麦、蒺藜苜蓿、马铃薯、二穗短柄草和稻。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述布卢门醇是式(I)或(II)的化合物：
其中
R1和R2各自独立地选自-CH3、-CH2OH、-COOH和-CH2-O-Glyc；
R3是–H、-OH或-O-Glyc；
R4是H或Glyc；
Glyc是糖部分，选自-Glc、-Glc-Rha、-MalGlc-Api、-MalGlc、-Glc-Api、-Glc-(Glc)2、-HmgGlc、-Glc-Arb、-(Glc-GlcU)-Rha、-Hmg(MalGlc)、-Glc-GlcU、-Glc-Glc和-MalGlc-GlcU，其中Glc是葡萄糖，Rh是鼠李糖，Mal是丙二酰，Api是芹菜糖，Hmg是3-羟基3-甲基戊二酰，Arb是阿拉伯糖，并且GlcU是葡糖醛酸。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中
(i)所述第二植物与AMF没有任何结合；或
(ii)所述第二植物具有与AMF的结合；和/或
(iii)所述第一植物和所述第二植物是在不同时间点的相同个体；和/或
(iv)所述方法包括确定所述第一植物中所述布卢门醇的量；和/或
(v)所述方法包括确定所述第二植物中所述布卢门醇的量；和/或
(vi)所述比较以计算机实施方式实现。
4.确定植物是否具有AMF接受性的方法；或对所述接受性定量的方法；
所述方法包括：
(a)使所述植物与已知能够定殖的AMF接触；并且
(b)将布卢门醇的量和参照比较，以获得所述量和所述参照之间的差异；
其中所述量是在第二时间点时或之后在所述植物的地上部分中的量，所述第二时间点是在所述接触后其中已经形成或应当已经形成结合的最早时间点；和
所述参照是下述植物的地上部分中所述布卢门醇的量：
(i)第一时间点之前的所述植物，所述第一时间点是其中可以形成结合的最早时间点；或
(ii)没有任何与AMF的结合的第二植物；
其中，所述植物属于相同物种并且选自渐狭叶烟草、番茄、普通小麦、大麦、蒺藜苜蓿、马铃薯、二穗短柄草和稻；并且
其中与所述参照相比，较高的量指示具有所述接受性；并且所述差异是所述接受性的改进的指标。
5.对植物筛选AMF接受性的方法；
所述方法包括
(a)对多株植物应用根据权利要求4所述的方法；
或
(b)(i)使多株植物中的每一个与已知能够定殖的AMF接触，并且
(ii)确定以下时间点之后每株植物的地上部分中布卢门醇的量，所述时间点是其中已经形成或应当已经形成结合的最早时间点；
其中所述植物属于相同物种并且选自渐狭叶烟草、番茄、普通小麦、大麦、蒺藜苜蓿、马铃薯、二穗短柄草和稻；其中所述布卢门醇的量越高，所述接受性越高。
6.确定AMF是否具有定殖能力或定量所述能力的方法；所述方法包括：
(a)使所述AMF与已知可接受定殖的植物接触；并且
(b)将布卢门醇的量和参照比较，以获得所述量和所述参照之间的差异；
其中所述的量是在第二时间点时或之后在所述植物的地上部分中的量，所述第二时间点是在所述接触后其中已经形成或应当已经形成结合的最早时间点；和
所述参照是下述植物的地上部分中所述布卢门醇的量：
(i)第一时间点之前的所述植物，所述第一时间点是其中可以形成结合的最早时间点；或
(ii)与AMF没有任何结合的第二植物；
其中，所述植物属于相同物种并且选自渐狭叶烟草、番茄、普通小麦、大麦、蒺藜苜蓿、马铃薯、二穗短柄草和稻；并且
其中与所述参照相比，更高的量指示具有所述能力，并且所述差异是所述能力的指标。
7.筛选AMF的定殖能力的方法，所述方法包括
(a)对多种AMF应用根据权利要求6所述的方法；
或
(b)(i)使多种AMF中的每一个与已知可接受定殖的植物接触；并且
(ii)确定以下时间点之后每株植物的地上部分中布卢门醇的量，所述时间点是其中已经形成或应当已经形成结合的最早时间点；
其中所述植物属于相同物种并且选自渐狭叶烟草、番茄、普通小麦、大麦、蒺藜苜蓿、马铃薯、二穗短柄草和稻；其中所述布卢门醇的量越高，所述能力越高。
8.产生植物与AMF结合的方法，所述方法包括：
(a)(i)使所述植物与AMF接触；
(ii)将布卢门醇的量和参照进行比较，以获得所述量和所述参照之间的差异；
其中所述量是在第二时间点时或之后在所述植物的地上部分中的量，所述第二时间点是在所述接触后其中已经形成或应当已经形成结合的最早时间点；和
所述参照是下述植物的地上部分中所述布卢门醇的量
(1)第一时间点之前的所述植物，所述第一时间点是其中可以形成结合的最早时间点；或
(2)与AMF没有任何结合的第二植物；并且
(iii)如果所述量与所述参照相比增加，则获得所述结合；
(b)(i)使所述植物与多种AMF的每一个接触；
(ii)在每种情况下确定以下时间点之后所述植物的地上部分中布卢门醇的量，所述时间点是其中已经形成或应当已经形成结合的最早时间点；并且
(iii)选择具有最高量的所述布卢门醇的结合；
或
(c)(i)使多株植物与AMF接触；
(ii)确定以下时间点之后每株植物的地上部分中布卢门醇的量，所述时间点是其中已经形成或应当已经形成结合的最早时间点；并且
(iii)选择具有最高量的所述布卢门醇的结合；
其中，所述植物属于相同物种并且选自渐狭叶烟草、番茄、普通小麦、大麦、蒺藜苜蓿、马铃薯、二穗短柄草和稻。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中
(i)所述第一时间点在所述接触之前；
(ii)在所述接触之前或在所述第一时间点之前，所述植物没有所述结合；
(iii)所述方法包括在所述第一时间点时或之前确定布卢门醇的量；
(iv)所述方法包括在所述第二时间点时或之后确定布卢门醇的量；和/或
(v)所述比较以计算机实施方式实现。
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Quantification of Blumenol Derivatives as Leaf Biomarkers for Plant-AMF Association;Elisabeth Mindt等;《Bio-protocol》;20190720;第9卷(第14期);第1-9页 *
代谢组学在植物代谢研究中的应用;淡墨等;《中国中药杂志》;20071130;第32卷(第22期);第2337-2341页 *
盐胁迫下丛枝菌根真菌对植物影响的研究现状与发展趋势;高崇等;《北方园艺》;20131231(第10期);第180-184页 *

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