CN106011256A - 基于实时荧光定量pcr 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法 - Google Patents

基于实时荧光定量pcr 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法 Download PDF

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CN106011256A
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仇剑波
赵晶晶
邢宇俊
史建荣
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Abstract

本发明提供一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，首先提取小麦根际土壤样本总DNA作为PCR扩增的模板，然后以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物扩增获得129bp的特异性片段，经连接、转化后，再以qPCR扩增；本发明方法法不仅鉴定了丛枝菌根，并且可以准确的对其进行绝对定量，得到在转基因小麦各个生育期丛枝菌根真菌的拷贝数，在小麦生长发育阶段，丛枝菌根拷贝数的变化总体呈现逐渐增加的趋势，本发明建立了快速、简便而精确的鉴定方法，为后续试验提供了理论和试验依据，对进一步评价转基因作物的安全性具有重要意义，与现有方法相比，本发明方法敏感性高，特异性强，重复性好，操作方便，结果直观。

Description

基于实时荧光定量PCR检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数 量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法。
背景技术
丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza, AM）真菌是一类备受关注的植物共生菌，它能与绝大部分农作物根系形成互惠共生体。AM真菌不仅能刺激植物对磷、氮等矿质元素的有效吸收，在增强植物的抗病、抗逆等方面也有积极的作用。
近年来，转基因作物的大面积种植引发人们对环境问题的担忧，其中，转基因作物对土壤生态系统（微生物种类、种群、数量和生物多样性）的影响是目前备受关注的研究热点。因此在评价转基因植物的环境影响时，对土壤中的微生物尤其是具有重要指示作用微生物如丛枝菌根等进行监测是非常有必要的。
目前常规的菌落数量研究通常采用平板菌落计数法，但是，由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3个或更多细胞。且对于绝大部分微生物来说，目前为止还没有合适的离体培养方法，因此平板菌落计数法存在很大的局限性。而丛枝菌根真菌具有专性共生的性质，因此目前无法对其进行无菌纯培养，只能依赖活体植物进行繁殖，因此常规平板菌落计数法难以确切反映环境中丛枝菌根真菌的数量。
实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）技术是近几年新发展起来的一种用于微生物定量研究的方法，该方法具有高度特异、灵敏、快速等特点。在建立标准曲线的基础上可以对相应的细菌、真菌进行绝对定量研究，其结果与传统计数方法相比也更为准确，而且免除了较为繁琐的培养过程。目前，尚未见qPCR技术应用于丛枝菌根真菌计数中的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明针对常见真菌核糖体DNA的序列，设计丛枝菌根真菌特异的PCR建立基于Real-time qPCR的根际土壤中丛枝菌根真菌拷贝数定量检测方法，并将其应用于转基因小麦不同生育期根际土壤中丛枝菌根真菌数量的检测研究，进而研究转基因小麦根际土壤微生物群落演化规律，为转基因小麦环境安全评价提供技术支撑。本发明是这样实现的：
一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，其具体步骤如下：
A）提取小麦根际土壤样本总DNA，溶于ddH2O中；
B）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以小麦根际土壤样本总DNA为模板，进行PCR扩增，获得长度为129bp的特异性片段；
C）对步骤B）获得的129bp特异性片段切胶回收，然后与T4载体连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布于氨苄抗性平板，置于37℃环境中培养24小时，然后挑选单克隆于液体LB培养基培养24小时，提取质粒；以质粒为模板进行PCR扩增，所获得的阳性质粒即为目标质粒。
D）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以目标质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增，根据标准曲线计算即可获得小麦根际土壤样本中丛枝菌根真菌的含菌量；
所述标准曲线为Y=-3.327X+42.913，R2=0.99874，其中Y为荧光时实定量PCR反应的Ct值，X为丛枝菌根真菌的标准质粒拷贝数对数值。
所述液体LB培养基：在950ml ddH2O中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L；121℃，20min高压灭菌，4℃储存；
氨苄抗性平板：向1L液体LB培养基加入15g琼脂粉，121℃，20min高压灭菌，冷却至50-60℃时加入氨苄青霉素至期终浓度为50-100mg/L，然后用培养皿制备平板，即得。
进一步，本发明所述基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，其步骤D）所述荧光定量PCR扩增，具体步骤如下：PCR扩增体系：共20µL，2×Master mix（Takara公司）10µL；ddH2O 8µL；SEQ ID No.1 （浓度10µM）0.5µL ；SEQ ID No.2（浓度10µM）0.5µL；DNA模板1µL；
PCR反应步骤：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，40个循环。
本发明根据丛枝菌根真菌28s rDNA保守序列，应用BioEdit软件进行比对进而设计出特异扩增丛枝菌根特异片段的引物，应用该引物以小麦根际土壤DNA为模板获得长度为129bp的片段，对该片段切胶回收；将该片段与T4载体连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布含有氨苄的LB固体培养基，37℃培养24小时，挑选单克隆进行液体LB培养基培养24小时，提取质粒；以质粒为模板进行PCR扩增，确定该质粒中是否含有目的片段；将阳性质粒送测序公司测序，保证阳性质粒中目的片段序列正确；最后含有正确目的序列的阳性质粒即为需要构建的目标质粒。应用公式计算出质粒浓度（拷贝数/微升）将此质粒梯度稀释构建不同浓度下的Real-time qPCR扩增标准曲线，以该标准曲线计算出未知土样中丛枝菌根的数量。将该方法应用于转基因小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量检测，研究转基因抗旱小麦对土壤微生物群落的影响，该方法不仅可以定性，也可以定量研究微生物群落结构组成及数量变化，深入探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程。
本发明以特异性引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行PCR扩增，其扩增曲线、熔解曲线以及标准曲线均达到Real-time qPCR反应的理想条件。扩增过程中无引物二聚体及非特异性扩增出现，具有良好的特异性。且由于Real-time qPCR绝对定量是建立在模板的初始浓度与Ct值关系的基础上，因此为保证样本定量分析具有稳定可重复的结果，所获得的标准曲线具有一致的重复反应、高的线性( R2> 0. 99)和高扩增效率( E: 90~ 105%)。
本发明的优点还在于，应用分子生物学手段研究转基因作物的安全性，建立了快速、简便的鉴定方法。转基因作物对土壤生物的影响是安全性评价的一个重要方面。本发明采用对土壤总DNA进行提取，采用PCR方法对丛枝菌根真菌的28s rDNA基因片段进行扩增，再经连接、转化后，获得目标片段为129bp的克隆载体，再以Real-time qPCR扩增此片段。此方法不仅鉴定了丛枝菌根，并且可以准确的对其进行绝对定量，得到在转基因小麦各个生育期丛枝菌根真菌的拷贝数。在小麦生长发育阶段，丛枝菌根拷贝数的变化总体呈现逐渐增加的趋势。本实验立足于国际转基因作物发展现状，应用分子生物学手段研究转基因作物的安全性，建立了快速、简便而精确的鉴定方法。为后续试验提供了理论和试验依据，对进一步评价转基因作物的安全性具有重要意义。与现有方法相比，本发明方法敏感性高，特异性强，重复性好，操作方便，结果直观。
附图说明
图1 Real-time qPCR扩增曲线图（从左到右依次为1*108 copies/µL~ 1*103copies/µL）。
图2 Real-time qPCR标准曲线（Y= -3.327X+42.913，R2= 0.99874）。
图3 不同浓度梯度标准质粒Real-time qPCR熔解曲线（从上到下依次为1*108copies/µL~ 1*103copies/µL浓度梯度标准质粒）。
图4 Real-time qPCR灵敏度检测的扩增曲线（1,2,3,4,5,6,7,8依次代表标准质粒原液，10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍稀释）。
图5 Real-time qPCR灵敏度检测结果的琼脂糖凝胶电泳结果（M:DL 2000 maker，1,2,3,4,5,6,7,8依次代表标准质粒原液，10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍稀释）。
图6转基因小麦根际土壤根系土丛枝菌根真菌拷贝数。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例中使用的荧光定量PCR仪采用Corbett公司（Australia）生产的RotorGene 6000；
大肠杆菌感受态细胞TOP10购自大连宝生物生物工程有限公司；
UltraCleanTM soil DNA Isolation Kit试剂盒购自MoBio公司,USA；
实施例涉及培养基配制方法：
液体LB培养基：在950ml ddH2O中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L；于121℃，20min高压灭菌，4℃储存；
氨苄抗性平板：向1L液体LB培养基加入15g琼脂粉，于121℃，20min高压灭菌，冷却至50-60℃加入氨苄青霉素至其终浓度为50-100mg/L，然后用培养皿制备平板，即得氨苄抗性平板。
实施例涉及的引物序列：
SEQ ID No.1：TTGGGATTGCAGCTCAAAATGG ；
SEQ ID No.2：TCACGTACTGTTTAACTCTC；
扩增产物序列（SEQ ID No.3）：TCACGTACTGTTTAACTCTCTTTCCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCCTCACGGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCTATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCATTTTGAGCTGCAATCCCAA。
实施例1
（1）构建目标质粒
根据NCBI网站上丛枝菌根各科及土壤中常见真菌核糖体DNA的28s rDNA保守序列，应用BioEdit软件进行比对进而设计出特异扩增丛枝菌根特异片段的上下游引物如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。
申请人从江苏省农业科学院六合转基因试验基地取样，获取转基因小麦及其受体根际土壤，利用UltraCleanTM soil DNA Isolation Kit试剂盒，提取土壤总DNA，并将总DNA溶解于ddH2O中；以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别做为上下游引物，以土壤总DNA为模板，进行目的条带扩增：
PCR反应体系为25 μL，其中rTaq酶0.125 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mM） 2 μL，MgCl2（25mM） 1.5 μL，上下游引物（10μM）各1 μL，模板1 μL，去离子水补足体积；
PCR反应条件为：94℃预变性5分; 94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环; 72℃延伸10分；
PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物为129bp左右的特异性条带，利用胶回收试剂盒切胶回收特异性条带，回收产物与T载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，利用氨苄抗性平板37℃培养24小时，挑选单克隆进行液体LB培养基培养24小时，提取质粒；以质粒为模板进行PCR扩增（PCR扩增方法与前述PCR扩增相同），以定该质粒中是否含有目的片段；将阳性质粒送测序公司测序，保证阳性质粒中目的片段序列正确。
对测序所得的序列进行分析，如果目标片段长度为129bp且在NCBI号上的比对结果为丛枝菌根序列，则对相对应的克隆进行扩大培养并应用质粒提取试剂盒提取质粒，本实施例获得的扩增产物序列如SEQ ID No.3所示，使用微量紫外分光光度计测定质粒浓度，按照公式计算得到质粒拷贝数，将已知拷贝数的质粒作为标准质粒，用于下一步定量。
（2）标准质粒浓度的计算
提取经过测序验证的阳性克隆的质粒，将获得的质粒计算拷贝数。
质粒拷贝数的计算方法为：
质粒拷贝数（copies/µl）=质粒浓度（g/µl）×6.02×1023（copies/mol）/质粒分子量（g/mol），其中质粒分子量=[（克隆载体长度+目的片段长度）（bp）]×[324×2（g/mol）]/bp。
本实施例获得的阳性质粒浓度为61µg/ml,经计算其拷贝数浓度为2.0×1010copies/µl。
（3）检测体系建立
取构建好的质粒（2.0×1010 copies/µl）进行108-103copy/µl系列梯度稀释，以稀释好的质粒为模板，进行荧光定量PCR分析，同时设置阴性对照（即不含目标序列的空载体）。
PCR反应体系（20 µl）：2×Master Mix 10 µL，正向引物SEQ NO.1 （10 µM） 0.5 µL，反向引物SEQ NO.2（10 µM） 0.5 µL，模板DNA(20ng/µl) 1.0 µL，ddH2O 8补足至20µL；
PCR反应条件为：94℃预变性 5分，94℃变性 10 秒， 58 ℃退火 10 秒，72℃延伸20秒，共进行40个循环。
反应在Rotor Gene 6000仪器（Corbett，Australia）上进行，标准曲线、扩增曲线及熔解曲线由仪器自动生成。
Rotor-Gene 6000 Series实时荧光定量分析软件绘制出反应的扩增曲线如图1所示，图1中，从左至右 6条曲线依次代表标准品的1:108、1:107、1:106、1:105 、1:104、1:103的梯度稀释液的扩增曲线，从左到右依次为1*108 copies/µL~-1*103copies/µL，可见 6个质粒标准品扩增曲线较光滑，呈现典型的S型曲线，且各循环阈值(CT值)间隔均匀。
根据扩增曲线提供的标准品各梯度浓度及反应的循环阈值(CT值)，Rotor-Gene6000 Series软件自行绘制出反应的标准曲线(如图2所示) Y= -3.327X+42.913，该标准曲线的相关系数R2= 0.99874，斜率为 -3.327，计算其扩增效率E=100%，符合荧光定量分析对标准曲线的要求。
测定各浓度稀释梯度的标准质粒在PCR过程中的熔解温度并绘制熔解曲线如图3所示，图3中，从上到下依次为1*108 copies/µL-1*103copies/µL浓度梯度标准质粒，由图3可见，标准质粒的熔解曲线峰型单一，且不同浓度梯度标准质粒熔解温度相同(81.0±0.3℃ )，表明扩增反应产物熔解温度较均一，特异性好且无引物二聚体影响。
实施例2荧光定量PCR检测体系灵敏度检测
对实施例1构建的标准质粒（2.0×1010copies/µl）进行10倍稀释，依次为1*108copies/µL-1*103 copies/µL，使用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行荧光定量扩增，以检测其扩增的敏感性，具体反应体系和反应条件参照实施案例1。
得到扩增曲线如图4所示，图4中，1,2,3,4,5,6,7,8依次代表标准质粒原液，10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍稀释；对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图5所示，图5中，M:DL 2000 maker，1,2,3,4,5,6,7,8依次代表标准质粒原液，10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍稀释；由图4可见，在对标准质粒进行10-6倍稀释前其扩增曲线依然呈现“s”型，且扩增曲线间隔均匀，由图5可见，在琼脂糖凝胶电泳后也呈现明显梯度及较好的亮度，在10-6稀释后，扩增曲线“s”型不明显，此时灵敏度下降。由此说明，此反应体系灵敏度较高，可以满足对根系土壤中丛枝菌根真菌进行定量扩增的要求。
实施例3转基因小麦主要生育期根际土壤中丛枝菌根真菌生长动态分析
转基因小麦及其受体种植于江苏省农业科学院六合转基因试验基地，每个品种（系）4个重复，随机区组设计，每个小区的面积为10（长）×6（宽）m2。
分别于小麦生长的播种期、拔节期、灌浆期及成熟期在相同地点，以对角线五点取样法采集小麦根际土壤，提取DNA，利用实施例1提供的特异引物及扩增体系进行扩增，根据标准曲线计算即可获得土壤样本中初始丛枝菌根真菌的含菌量。
应用已建立的Real-time qPCR，对小麦整个生长期根际土壤中的丛枝菌根真菌的数量进行检测，结果如图6所示，由图6可见，2015年转基因小麦根际土壤中丛枝菌根真菌的数量与非转基因小麦无显著差异，生育期之间差异较为显著，这种差异的构成原因是多方面的，可能与土壤湿度，PH值，采样时温度差异有关。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ttgggattgc agctcaaaat gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcacgtactg tttaactctc 20
<210> 3
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcacgtactg tttaactctc tttccaaagt gcttttcatc tttccctcac ggtacttgtt 60
cgctatcggt ctctcgccta tatttagctt tagatggaat ttaccaccca ttttgagctg 120
caatcccaa 129

Claims (2)

1.一种基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，其特征在于，具体步骤如下：
A）提取小麦根际土壤样本总DNA，溶于ddH2O中；
B）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以小麦根际土壤样本总DNA为模板，进行PCR扩增，获得长度为129bp的特异性片段；
C）对步骤B）获得的129bp特异性片段切胶回收，然后与T4载体连接，转化进入大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布于氨苄抗性平板，置于37℃环境中培养24小时，然后挑选单克隆于液体LB培养基培养24小时，提取质粒；以质粒为模板进行PCR扩增，所获得的阳性质粒即为目标质粒；
D）以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以目标质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增，根据标准曲线计算即可获得小麦根际土壤样本中丛枝菌根真菌的含菌量；
所述标准曲线为Y=-3.327X+42.913，R2=0.99874，其中Y为荧光时实定量PCR反应的Ct值，X为丛枝菌根真菌的标准质粒拷贝数对数值；
所述液体LB培养基：在950ml ddH2O中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L；
氨苄抗性平板：向1L液体LB培养基加入15g琼脂粉，121℃，20min高压灭菌，冷却至50-60℃时加入氨苄青霉素至期终浓度为50-100mg/L，然后用培养皿制备平板，即得。
2.根据权利要求1所述基于实时荧光定量PCR 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，其特征在于，步骤D）所述荧光定量PCR扩增，具体步骤如下：
PCR扩增体系： 2×Master mix 10µL，0.5µL浓度为10µM 的SEQ ID No.1，0.5µL浓度为10µM 的SEQ ID No.2， DNA模板1µL，ddH2O 补足至20µL；
PCR反应步骤：95℃ 预变性10 min；95℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72℃延伸20 s，40个循环。
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