CN109371159B - 一种鉴定小麦赤霉病抗性的分子标记及其应用 - Google Patents
一种鉴定小麦赤霉病抗性的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鉴定小麦赤霉病抗性的分子标记及其应用,该分子标记是以小麦品种苏麦3号的DNA为模板,核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对PCR扩增后电泳获得的大小为600bp的DNA条带;该分子标记可以应用于小麦赤霉病抗性材料筛选和分子标记辅助选择育种,若待测小麦含有该分子标记,则判定小麦品种赤霉病抗性至少达到中抗水平;反之,则判定为感赤霉病小麦品种;利用该分子标记检测可缩短育种时间,宜于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于小麦遗传育种和分子生物学领域,特别是一种鉴定小麦赤霉病抗性的分子标记及其应用。
背景技术
赤霉病(Fusarium Head Blight)是由禾谷镰刀菌引起的小麦真菌病害,是我国长江中下游麦区和东北春麦区小麦的主要病害。由于耕作模式和气候的变化,小麦赤霉病已迅速向黄淮麦区、北方麦区等其他麦区扩展,造成减产。此外,感染病菌的麦粒会携带大量的真菌毒素,食用后,对人和牲畜的消化系统和神经系统等产生一定程度的毒害。培育抗病品种是减轻小麦赤霉病危害的重要途径。
利用与赤霉病抗性基因或QTL紧密连锁的分子标记可以在植株生长早期对赤霉病抗性进行筛选,降低田间鉴定的成本,加快育种进程。在“苏麦3号”、“望水白”和“宁7840”等抗病小麦品种(系)的3B染色体短臂上发现了一个主效的抗赤霉病位点Fhb1,可解释表型变异率超过20%。小麦赤霉病是多个基因控制的复杂数量性状,在Fhb1区域也发现了多个抗性相关基因如钙离子结合蛋白前体、凝集素和GDSL脂肪酶等。基因TaPFT编码一个含有2个凝集素结构域和ETX/MTX2毒结构域的融合蛋白,参与小麦赤霉病的抗性反应,但在含有不同抗性水平的种质资源中验证TaPFT的效应时,发现TaPFT不是参与赤霉病抗性的唯一基因,初步推测Fhb1区域的多个变异位点或基因参与了赤霉病抗性。
与Fhb1连锁的SSR标记Xgwm533离抗性QTL的物理距离较大,在不同的材料中此标记和抗性QTL存在分离,因此标记Xgwm533在分子标记辅助选择中的选择效率有限。Liu等(2008)开发的一个与赤霉病抗性QTL紧密连锁的分子标记UMN10虽然在高通量检测上优势较明显,但是需要昂贵的测序分析仪进行分析,价格较高,不适合我国大多数小麦遗传育种实验室。王磊等(2013)年将UMN10标记转化成为利用琼脂糖凝胶电泳即可检测的SNAP标记,能够在小麦遗传育种早期世代中进行赤霉病抗性选择。由于亲本间抗性位点序列的变异,利用新的变异序列设计的分子标记可以进一步提高赤霉病分子标记辅助选择的准确性。
发明内容
为了提高利用分子标记辅助选择小麦赤霉病抗性的准确性,本发明利用新的差异序列设计了分子标记JAASM273,通过JAASM273引物对的PCR检测结果可以来判定小麦的赤霉病抗性,进一步可以应用于小麦赤霉病抗性材料筛选和分子标记辅助选择育种。
为实现上述目的,本发明首先提供了一种鉴定小麦赤霉病抗性的分子标记,该分子标记是以苏麦3号的DNA为模板,以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为引物进行PCR扩增,扩增产物在质量百分数为1%的琼脂糖凝胶上电泳后,获得的大小为600bp的DNA片段;申请人将该分子标记自命名为JAASM273。
其次,本发明还提供了分子标记JAASM273在预测小麦赤霉病抗性中的应用,其具体步骤为:以样品小麦DNA为模板,SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增,扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳后,若出现大小为600bp的DNA片段(JAASM273),则判定小麦品种赤霉病抗性至少达到中抗水平;反之,则判定为感赤霉病小麦品种。
所述PCR扩增体系:10×buffer 1μl,浓度为25mM的MgCl20.5μl,浓度为2.5mM的dNTP0.5μl,浓度为10μM的引物SEQ ID NO.10.1μl,浓度为10μM的引物SEQ ID NO.2 0.1μl,浓度为5U/μl的Taq聚合酶0.2μl,模板DNA 50ng,ddH2O补足至10μl;
PCR反应程序:94℃ 3分钟;94℃ 15秒,55℃ 30秒,72℃ 40秒延伸,30个循环;72℃延伸5分钟。
本发明中:小麦赤霉病抗性检测方法是按照中华人民共和国农业行业标准NY/T2954-2016《小麦区域实验品种抗赤霉病鉴定技术规程》进行的,所述中抗或抗小麦品种是指:采用穗部单花滴注接种,平均严重度小于3的小麦品种;中感或高感赤霉病小麦品种是指平均严重度大于等于3的小麦品种。
第三,本发明还提供了一对用于预测小麦对赤霉病抗性的引物对,所述引物对的核苷酸序列分别如NO.1和SEQ ID NO.2所示。
第四,本发明还提供了上述引物对在预测小麦赤霉病的抗性中的应用,其具体步骤如下:以样品小麦DNA为模板,SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增,扩增产物在质量百分数为1%的琼脂糖凝胶上电泳后,若扩增产物中含有600bp条带,则判定小麦品种赤霉病抗性至少达到中抗水平;反之,则判定为感赤霉病小麦品种。
本发明还提供了一种预测小麦赤霉病抗性的方法,其具体步骤为:以样品小麦DNA为模板,SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增后电泳,若扩增产物中含有600bp条带,则判定小麦品种赤霉病抗性至少达到中抗水平;反之,则判定为感赤霉病小麦品种;所述PCR扩增体系:10×buffer 1μl,浓度为25mM的MgCl20.5μl,浓度为2.5mM的dNTP0.5μl,浓度为10μM的引物SEQ ID NO.10.1μl,浓度为10μM的引物SEQ ID NO.2 0.1μl,浓度为5U/μl的Taq聚合酶0.2μl,模板DNA 50ng,ddH2O补足至10μl;PCR反应程序:94℃ 3分钟;94℃ 15秒,55℃ 30秒,72℃ 40秒延伸,30个循环;72℃延伸5分钟。
在小麦抗赤霉病育种中,在早期世代即可以通过本分子标记的检测结果对小麦的赤霉病抗性进行选择,加快育种进程,与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明中的分子标记引物对通过人工比对和校正而来,人工比对保证了扩增序列的特异性,人为调整引物末端位置锚定变异位点保证了扩增产物的准确性和有效性,因此PCR扩增效率较高,扩增结果特异性好,结果判定准确有效。
2、与已发表的单个标记的检测结果相比,本发明利用分子标记JAASM273引物对的PCR检测结果鉴定小麦的赤霉病抗性的方法可以进一步提高小麦赤霉病抗性分子标记辅助选择的准确性,从而提高分子标记辅助选择效率。
附图说明
图1为软件设计分子标记P1和P2引物对在抗感品种中的扩增结果;
其中,M:分子量标准DL2000,1-6泳道分别为小麦品种苏麦3号、望水白、台湾小麦、宁麦8号、宁麦9号、宁麦13号,7-12泳道分别为安农8455、济麦22、扬麦4号、邯6172、小偃22号、皖麦55号。
图2为分子标记JAASM273引物对在抗感品种中的扩增结果;
其中,M:分子量标准DL2000,1-6泳道分别为小麦品种苏麦3号、望水白、台湾小麦、宁麦8号、宁麦9号、宁麦13号,7-12泳道分别为安农8455、济麦22、扬麦4号、邯6172、小偃22号、皖麦55号。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例涉及的核苷酸序列:
SEQ ID NO.1:GTGGTAAGGACTCAAAGGGTGG;
SEQ ID NO.2:CTGCTGCTCGCTTTCTCCTCC;
SEQ ID NO.3:GGGTACAAAAGGGAGGAGAAAG;
SEQ ID NO.4:TTTCTTCCTCCGCCTCCTGTTT;
SEQ ID NO.5:GGGTACAAAAGGGAGGAGAA;
SEQ ID NO.6:TGGGTGACGACGATGTAGGTGA。
实施例涉及的材料来源:
苏麦3号等小麦品种或品系(表1):由江苏省农业科学院粮食作物研究所麦类作物研究室保藏;
赤霉菌:为亚洲镰刀菌Fa0609,由江苏省农业科学院粮食作物研究所麦类作物研究室保藏;
实施例1分子标记JAASM273引物对在抗感品种中的验证
本实施例中PCR反应采用的模板为:苏麦3号、望水白、台湾小麦、宁麦8号、宁麦9号和宁麦13号,其中,苏麦3号和望水白为抗赤霉病品种,台湾小麦、宁麦8号、宁麦9号和宁麦13号为中抗赤霉病品种。济麦22号、安农8455、淮麦18、小偃54、扬麦4号和皖麦55号为感赤霉病品种。利用CTAB法提取小麦叶片基因组DNA,并采用微量分光光度计Nanodrop对基因组DNA进行定量。
通过软件Primer Premier5.0对变异位点进行分子标记引物设计时,引物设计软件无法进行序列比对和校正,无法对变异位点进行锚定,也无法调整引物末端碱基种类。采用软件设计的引物对P1(其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)和P2(其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)以上述抗感品种为模板进行PCR扩增时,扩增结果如图1所示,引物对P1和P2能有效扩增,但扩增结果不能对抗感品种进行有效判定。
在此基础上,申请人对变异位点序列进行人工比对和校正的基础上,人为调整引物对末端的锚定位置和调整末端碱基种类,所获得的引物对核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示,以获得分子标记JAASM273。
分别以上述品种基因组DNA为模板,利用分子标记M273的引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增,PCR反应体系为10μl体系:10×buffer 1μl,MgCl2(25mM)0.5μl,dNTP(2.5mM)0.5μl,引物SEQ ID NO.1(10μM)0.1μl,SEQ ID NO.2引物(10uM)0.1μl,Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl,模板DNA 50ng,ddH2O补足至10μl;
PCR反应程序:94℃ 3分钟;94℃ 15秒,55℃ 30秒,72℃ 40秒延伸,30个循环;72℃延伸5分钟。
扩增产物用质量百分比为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统记录结果。检测结果如图2所示,含有分子标记M273特异性扩增产物条带(600bp)的有苏麦3号、望水白、台湾小麦、宁麦8号、宁麦9号和宁麦13号,不含有特异性扩增产物条带(600bp)的有济麦22号、安农8455、淮麦18、小偃54、扬麦4号和皖麦55号。通过以上结果可以判断:苏麦3号、望水白、台湾小麦、宁麦8号、宁麦9号和宁麦13号为中抗或抗赤霉病品种;济麦22号、安农8455、淮麦18、小偃54、扬麦4号和皖麦55号为感赤霉病品种。
以上结果表明:通过分子标记推定的抗性结果与实际抗性水平相符,可以通过检测小麦品种中是否含有分子标记JAASM273特异性条带,来判断其对赤霉病的抗性,检测结果正确有效。
实施例2利用分子标记JAASM273鉴定小麦的赤霉病抗性
供试品种(系)为小麦品种共计48份,包括“宁麦”、“扬(辐)麦”、“淮麦”、“皖麦”和“安农”系列,品种(系)名称如表1所示。以实施例1中建立的分子标记JAASM273的检测方法,对上述小麦品种(系)进行检测;同时,以已发表的检测标记Gwm533进行检测,检测结果记为“有”或“无”。若存在分子标记JAASM395(即以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示引物PCR扩增后电泳,获得的的大小为600bp的DNA片段),则判定小麦品种赤霉病抗性至少达到中抗水平;若不存在分子标记JAASM395,则判定为感赤霉病小麦品种。
田间抗性鉴定采用单花滴注法:培养强致病力小麦赤霉病菌F0609分生孢子液(5×105个分生孢子/ml),将分生孢子液滴注到扬花初期麦穗中部的1个小花中,每品种10穗,塑料袋套袋保湿3天后,每天喷水雾3-4次,每次5分钟左右,以达到保湿效果。接种后21天调查接种麦穗的严重度,并计算平均严重度,平均严重度小于2的小麦品种判定为“中抗”,平均严重度大于等于2且小于3的小麦品种判定为“中抗”;平均严重度大于等于3的小麦品种,判定为“感”,即中感或高感赤霉病小麦品种(农业行业标准NY/T2954-2016)。
标记检测及判定结果和田间鉴定及判定结果如表1所示:
表1利用分子标记JAASM273筛选抗赤霉病小麦品种(系)
由表1可知,结合标记判定与田间抗性鉴定结果,分子标记JAASM273检测的准确率为85.4%(41/48),Gwm533检测的准确率为75%(36/48)。说明利用分子标记JAASM273可以应用于小麦赤霉病抗性材料筛选和分子标记辅助选择育种,与已公开发表的单个检测标记相比,本发明中的分子标记的检测结果可以提高小麦赤霉病抗性分子标记辅助选择的准确性。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种鉴定小麦赤霉病抗性的分子标记及其应用
<141> 2018-12-12
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtggtaagga ctcaaagggt gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgctgctcg ctttctcctc c 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtacaaaa gggaggagaa ag 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttcttcctc cgcctcctgt tt 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggtacaaaa gggaggagaa 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggtgacga cgatgtaggt ga 22
Claims (6)
1.一种与小麦赤霉病抗性QTL连锁的分子标记,该分子标记是以苏麦3号的DNA为模板,以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为引物进行PCR扩增,扩增产物在质量百分数为1%的琼脂糖凝胶上电泳后,获得的大小为600bp的DNA片段。
2.如权利要求1所述分子标记在预测小麦赤霉病的抗性中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,具体步骤如下:以样品小麦DNA为模板,SEQID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增后电泳,若存在大小为600bp的DNA片段,则判定小麦品种赤霉病抗性至少达到中抗水平。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,PCR扩增体系:10× buffer 1µl,浓度为25mM的MgCl2 0.5 µl, 浓度为2.5mM的dNTP0.5 µl,浓度为10µM的引物SEQ ID NO.1 0.1 µl,浓度为10µM的引物SEQ ID NO.2 0.1 µl,浓度为5U/µl的Taq聚合酶 0.2 µl,模板 DNA50 ng,ddH2O补足至 10 µl;
PCR扩增程序:94˚C 3分钟;94˚C 15秒,54.5˚C 30秒,72˚C 30秒延伸,30个循环;72˚C延伸5分钟。
5.一对用于预测小麦对赤霉病抗性的引物对,所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
6.一种小麦赤霉病抗性的预测方法,其特征在于,具体步骤如下:以样品小麦DNA为模板,SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增后电泳,若存在大小为600bp的DNA片段,则判定小麦品种赤霉病抗性至少达到中抗水平。
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PB01 | Publication | ||
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